Name: Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 학습하세요 알파헤르페스 바이러스의 신경 세포 내 수송 및 확산 과정을 형광 단백질 융합체와 라이브 셀 이미징 기법으로 실시간 시각화하는 방법을. 이 기술은 바이러스 감염 역학 연구에 필수적입니다.

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LWE와 RK는 건강 보조금 R37 NS033506-16 R01 NS060699-03의 미국 국립 연구소에 의해 지원됩니다. MPT는 미국 암 협회 박사후 연구 원정대 (PF-10-057-01-MPC)에 의해 지원되었다. 박사 매튜 리먼 박사 오렌 Kobiler의 조언과 지식 현미경 구성과 라이브 셀 이미징 방법을 설계에 쓸모 있었다. 우리는 또한 현미경의 취득, 설치 및 성능에서의 기술 지원 닐 발로과 니콘 인스트루먼트의 브라이언 T. 케인 덕분에 확장 할 수 있습니다.

제 1 항 - 라이브 세포 형광 현미경을위한 환경 제어 조건 <ol><li> 모든 영상 실험에 앞서 30 분에 연결하고 현미경 스테이지 위에 인큐베이터을 따뜻하게 시작합니다. <ol><li> 현미경, 전송되고 epifluorescent 광원, 자동화 하드웨어 컨트롤을 켭니다. 현미경에 연결하고 EM-CCD 카메라를 냉각하기 위해 현미경 제어 소프트웨어, NIS 요소를 엽니 다. </li><li> . 렌즈 적합한 목적 (하나 60X 나 100X 기름 침지)에 따뜻한 참고 첨부 : 실험 유형에 따라 대물 렌즈를 선택합니다. 60X 단계의 목적은 선행 성 확산을 시각화하기 적합하는 동안 100X 미분 간섭 대비 (DIC)은 선행 성 수송 virion의 어셈블리 추적에 가장 적합합니다. 그들은 샘플과 직접 접촉하지 않기 때문에 낮은 배율, 비 기름 침지 목표 렌즈 따뜻한 필요하지 않습니다. </li><li> 마일의 전동 무대에 무대 위로 보육을 연결<html> croscope. 샘플이 자리에 개최 적절한 삽입을 보장합니다. 인큐베이터 컨트롤에서 무대 위에 인큐베이터의 입력 포트에 가습 공기 라인을 연결합니다. </li><li> 인큐베이터와 렌즈 따뜻한 컨트롤을 설정하고 (설명 참조) 몇 군데되는 목적과 샘플에 대한 구체적인 이전에 확인 된 상태로 온도 설정을 조정합니다. </li><li> 5 % CO 2 / 최고 배양기를 준비하는 CO 2 보충 공기를 제공하기 위해 95 % 대기 탱크 제어 밸브를 엽니 다. 유량은 분당 가스의 60 내지 80 ML해야합니다. 빠른 속도는 가습 챔버에도 불구하고 광범위한 샘플 탈수가 발생합니다. </li></ol></li><li> 대물 렌즈에 렌즈 오일을 추가하고 바로 무대 위에 인큐베이터로 이미지화되는 문화를 놓습니다. </li><li> 10 분의 최소 문화의 온도 평형을 허용합니다. 한 시간 특히 3 장에서 설명 하룻밤 이미징 바람직하다. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 제 2 항 - 선행 성 virion의 전송 이벤트 프로토콜의 실시간 영상 <ol><li> 6 ~ 8 시간 전에 이미징, 테일러 등에 설명 된 방법을 사용하여 관심있는 바이러스 1 X 10 6 플라크 형성 단위와 성숙, 해리 SCG 뉴런의 35mm coverslip에 바닥 접시를 (예를 들어 바이러스를 표 1 참조) 감염 알. 2012A 11. 30 ~ 60 분에 한 개 이상의 바이러스, 오프 세트 접종을 테스트하는 유사한 시간 후 감염에 순차적으로 샘플 이미징을 허용하는 경우. </li><li> 어떤 실험을 실행하기 전에 10 분 최소 무대 위에 인큐베이터에 접시를 삽입합니다. 온도가 평형을하는 동안 초점면이 이동하고 부정적인 모든 이미징 실험에 영향을 미칠 것입니다. </li><li> 전송 빛과 현미경의 접안 렌즈를 사용하여 명확하게 고립 된 축삭 확장명을 가진 신경 세포의 시체를 찾을 수 있습니다. 또한, 검출을 표현하는 세포를 찾아 적절한 형광 조명을 사용형광 단백질의 테이블 양. 그것은 빛 때문에 유도 된 세포 손상의과 형광 단백질의 표백,이 단계와 이후 단계에서 형광등 조명에 시료의 노출을 제한하는 것이 중요합니다. </li><li> 세포가 노출하는 여기 빛의 강도를 줄이기 위해 형광 조명을 약하게. 중성 농도 (ND) 형광 조명 빛의 경로에 필터를 감쇠 빛을 갖습니다. 이상 1 분, ND4의 최소값보다 지속 동영상이 형광 단백질의 사진 - 표백 및 축삭의 사진 손상 광범위을 방지하기 위해 사용되어야합니다. 높은 형광 구조는 일반적으로 장소에 ND8 필터를 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 현미경 소프트웨어 (그림 2 및 보충 영화 1A)를 사용하여 EM-CCD 카메라에 빛의 경로를 전환합니다. </li><li> 각각의 형광 채널에 대한 최적의 이미징 시간과 조건을 결정합니다. <ol><li> &quot;재생&quot;버튼을 사용하여 라이브 이미지 창을 시작합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 각 형광 단백질을위한 최적의 카메라 노출 설정을 확인합니다. 빠르게 움직이는 virion의 구조 운동의 수차로 채널당 300 밀리 초를 초과하지 마십시오 발생합니다. (제조 업체의 최대 이득 제안), 노출 시간을 최소화하고 희미한 신호의 검출을 향상시키기 위해 300의 설정으로 카메라의 EM 게인을 사용합니다. 정확한 노출 시간이 낮은 배경 강도 높은 특정 신호 이미지를 생성합니다. </li></ol></li><li> 노출을 설정하고 축삭의 잘 정의 된 영역을 찾은 후, 소프트웨어는 자동으로 이미지 수집을 수행하도록 구성해야합니다. 표백 샘플을 방지하기 위해 라이브 영상 창을 중지합니다. <ol><li> NIS 요소 소프트웨어에서 6D 선택 - 정의 / 다운 메뉴에서 &quot;응용 프로그램&quot;드롭에서 실험 응용 프로그램을 실행합니다. </li><li> ND 수집 창에서 이미지 수집의 빈도를 결정하는 시간 탭을 클릭합니다. &quot;아니 지연&quot;및 지속 시간 5 분까지의 간격을 설정합니다. 목전자 소프트웨어는 5 분 동안 가능한 최고 주파수에서 이미지 프레임을 습득합니다. </li><li> 여러 형광 이미지 획득에 사용되는 사전 설정 하드웨어 구성을 선택할 수있는 &quot;람다&quot;탭을 선택합니다. 첫 번째 상자를 클릭하고 다운 메뉴에서 다음 드롭 적절한 하드웨어 구성을 선택합니다. 이미지에 표시 할 모든 형광 단백질에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> &quot;XY 위치 위치&quot;, &quot;Z 시리즈&quot;와 &quot;큰 이미지&quot;에 대한 탭이 선택 취소되어 있는지 확인합니다. </li><li> 탭 위에 표시된 상자가 자동​​으로 수집하는 동안 하드 디스크에 이미지를 저장하기 위해 &quot;파일에 저장&quot;을 선택합니다. 실험 출력 파일의 위치와 파일 이름을 구성합니다. 연속적인 실험이 수행되면, 소프트웨어는 지정된 파일 이름 끝에 일련 번호를 추가합니다. </li><li> 일단 모든 탭이 선택되었습니다. &quot;실행 - 이제&quot;버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. </li><li> 노출 설정을 통해 이미지 수집 속도를 최적화하고 IMAG전자 크기입니다. 이미지 수 영역의 작은 영역을 사용하면 종종 프레임 수집 속도를 빠르게합니다. 25 % 전체 이미지 영역의 50 % 사이의 영역을 선택 NIS-요소 ROI 도구를 사용하여 관심 영역을 정의합니다. 또는 짧은 노출 시간은 프레임 수집 속도를 증가하지만 (설명 참조) 신호의 품질을 저하 할 것이다. </li></ol></li></ol> 제 3 항 - 선행 성 확산 이벤트 밤새 시간 경과 영상 <ol><li> 이미징 이전에 네 시간, 35mm μ-접시에 건설 구획화의 연결 문화를 감염. 테일러 등에 설명 된 방법을 사용하여 (예를 들어 바이러스를 표 1 참조) 그 바이러스의 1 X 10 6 플라크 형성 단위와 신경 세포 기관을 접종한다. 2012b 12. </li><li> 조심스럽게 무대 위로 인큐베이터에 배양 접시를 놓습니다. 목표의 위치를​​ 접시의 측면에 설정되어 있는지 확인합니다. 천천히 초점 ensur에에 목적을 가지고목표를 ING하면 샘플로 밀어하지 않습니다. 포커스 필드가 확인되면, 천천히 축삭 구획의 내부면을 demarking 내부 장벽 근처 접시의 중앙에 목표를 이동합니다. 운동을하는 동안, 초점 심도가 유지되도록하고 샘플로 밀어하지 마십시오. 목적에 의한 플라스틱 표면의 변형은 축삭과 플라스틱을 손상 될 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 (~ 37 ° C) 인산 테프론 링 밖에서 배양 접시에 식염수 버퍼.​​ 약 2 ML을 추가합니다 이 샘플 탈수를 최소화하고 단열을 제공하기 위해 PBS의 반지와의 연결 문화를 둘러싸고 있습니다. </li><li> 온도가 자동 이미지 수집 (3.8)을 시작하기 전에 1 시간의 최소 평형 수 있습니다. 3.7 단계 3.5이 시간 동안 구성 할 수 있습니다. </li><li> 모든 중립적 인 밀도 필터를 참여하여 낮은 수준으로 조명의 강도를 제한 할 수 있습니다. 이 빈번한 이미지 수집을 비켜 수사진 손상 과도한없이 R 오랜 시간 동안. 조명을 줄이는 것은 더 이상 노출 (토론 참조) 요구, 낮은 신호가 발생합니다. </li><li> 역사적 노출 설정이나 셋업 2.5 절에 설명 된대로 대상 형광 단백질이 노출 설정을 구성하는 표현 감염된 상피 세포의 병렬 접시를 생성 실험하기 전에를 사용합니다. </li><li> 필요한 채널에 대한 노출을 설정 한 후, 그것은 자동으로 이미지 수집 용 소프트웨어를 구성 할 때입니다. 표백 샘플을 제한하는 라이브 영상 창을 중지합니다. <ol><li> 요소 소프트웨어 (그림 2 및 보충 영화 2)에서 6D 선택 - ND 취득 창을 가지고 아래 &quot;응용 프로그램&quot;드롭 메뉴에서 실험 응용 프로그램을 정의 / 실행합니다. </li><li> ND 취득 창에서 시간 탭을 클릭합니다. &quot;5 분&quot;으로 간격을 설정합니다. 20 시간의 지속 시간을 설정합니다. 루프 필드가 자동으로 PROGRA 반복의 수를 계산합니다남성 수행합니다. </li><li> &quot;람다&quot;탭을 선택합니다. 첫 번째 상자를 클릭하고 다운 메뉴에서 다음 드롭 위상차에 해당하는 람다 구성을 선택합니다. 이미지에 표시 할 각 형광 단백질에 대한 적절한 구성을 선택, 다음의 위치에 대해 반복합니다. </li><li> 보기의 큰 하나의 필드로 결합 할 여러 이미지의 매개 변수를 결정하는 &quot;큰 이미지&quot;탭을 선택합니다. 좋은 크기의 면적은 7 % 바느질 중복을 사용하여 5 × 2 이미지로 구성되어 있습니다. 이 이미지 수집의 빈도에 영향을주지 않고 이미지에 표시 할 위치 당 세포의 최대 수를 허용합니다. 또한, &quot;무대 이동 중 닫기 액티브 셔터&quot;확인란을 선택 취소합니다. 이 옵션은 이미지 사이의 셔터를 닫는하여 인수의 속도를 향상시킵니다. </li><li> , &quot;XY 위치 위치&quot;탭을 선택 순차적으로 밤새 영화의 과정에서 병렬로 이미지를 만들 여러 위치를 식별 할 수 있습니다. 센터 포를 정의 할 위치를 선택합니다각 큰 이미지 영역으로 int로. 예제 6-8 이미지 위치를 선택합니다. 좋은 이미지 영역은 명확하게 정의 된 축삭에 가까운 동격의 세포의 작은 클러스터를해야합니다. 세포는 최소화해야 서로 축삭 번들의 상단에 쌓여 할 수 없습니다. 초점 포인트는 세포의 핵이다. 명확하게 정의 된 핵 봉투 세포의 대부분을 볼 수 있도록 목표를 놓습니다. </li><li> &quot;Z 시리즈&quot;탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다. </li><li> 위의 2.6.5 절에 설명 된대로 자동 저장 기능을 구성합니다. </li><li> &quot;1 회 루프&quot;를 클릭하여 노출 및 위치 설정을 테스트합니다. 투과광 조명, 초점, 및 프레임에 대한 결과 이​​미지를 평가합니다. 초점이 이동 한 경우, XY 탭에서 각 위치에 대해 초점을 다시 설정합니다. 10 분을 기다린 후 초점이 안정 될 때까지이 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 설정을 확인 및 테스트 한 후 &quot;지금 실행&quot;버튼을 클릭하여 자동화 실험을 시작합니다. </li></ol></lI&gt; </ol> 제 4 항 - 이미지 프로세싱 및 수출 데이터 내보내기 <ol><li> 운송 또는 스프레드 이벤트의 라이브 세포 이미징 동안 얻어진 데이터 세트는 프레 젠 테이션 및 출판물 (보충 영화 3)에서 나중에 사용하기 위해 일반적으로 사용되는 파일 형식으로 NIS 요소 소프트웨어에서 내 보낸되어야한다. NIS 요소에 영화 적절한 원시. ND2 파일을 열 내보내고 원하는 형광 채널을 시각화하기 위해 &quot;분할 구성 요소&quot;보기를 선택합니다. 재생이 적절한 속도로 파일, 초당 5 프레임은 빠른 전송의 시각화를위한 좋은 출발점입니다. </li><li> 동영상 재생 중에 실시간 클럭을 나타내는 타임 스탬프를 포함합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, ND-정보를 추가합니다. 디지털 카운터는 왼쪽 상단에 표시됩니다. <ol><li> 정보를 표시하는 타임 스탬프를 편집합니다. 오른쪽 카운터에 클릭하고 편집 ND-정보를 선택합니다. 다음 팝업 창에서, 이마 기를 반영하기 위해 텍스트를 편집중요 NG 매개 변수입니다. 명확성을 위해 편집 글꼴, 색상 및 크기. </li></ol></li><li> &quot;편집&quot;메뉴로 가서 &quot;보기 스냅 샷 만들기&quot;또는 &quot;X&quot;키를 누르면 찾을 수 있습니다. 이 명령은 &quot;보기 스냅 샷&quot;창을 엽니 다. 선택은 8 비트, RGB, 전체 영화의 형광 채널을 포함하는 수출 준비 파일을 생성하기 위해 &quot;모든 프레임에 적용됩니다.&quot; </li><li> 크로스 플랫폼 호환성을 위해. AVI 파일로 저장합니다. 프레임 당 200 밀리 초에서 재생 속도를 설정합니다. NIS 요소에 의해 생성 된. AVI 파일은 다음 추가 원하는 파일 형식으로 다른 변환 소프트웨어를 사용하여 압축 할 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

그들은 관찰의 행위에 의한 중요한 변경없이 발생할 라이브 셀 이미징의 목표는 생물 학적 과정을 관찰합니다. 환경 제어, 영상의 속도 및 형광 조명이 목표는 세 가지 변수를 최적화하여 달성된다. 이러한 상호 종속 변수는 가능한 이미징 조건을 달성하기 위해 균형을해야합니다. 제시된 프로토콜은 대표적인 결과를 생성하는 특정 조건을 사용합니다. 우리는 간략하게 제시하는 특정 방법을 자세히 설명하기 전에 환경 제어 및 관측 손상을 설명합니다. 현미경에 관련된 생물학적 조건을 설정하고 유지하는 것은 세포 사건의 성공적인 모니터링에 매우 중요합니다. 대상 조건을 달성하면 현미경 보육 구성에 특정 변수의 수에 따라 달라집니다. 모든 인큐베이터 설정은 촬영 인큐베이터에서 모의​​ 시료의 독립적 인 온도 측정을 사용하여 유효성을 검사해야목표의 접점, 문화 접시의 중간, 그리고 문화 접시의 가장자리, 등 여러 위치에서. 설정은 1 이상이다 영역을 최소화하도록 최적화되어야한다 37 ° C보다 따뜻...

alphaherpes와 같은 단순 포진 바이러스와 같은 바이러스 (HSV) -1, -2, 그리고 pseudorabies 바이러스에 의한 말초 신경계 (PNS)의 감염 (PRV) 바이러스 라이프 사이클 전반에 걸쳐 여러 가지 복잡하고 규제가 심한 단계를 포함한다. PNS의 뉴런 내에서의 운반은 기본 바이러스 감염 및 후속 호스트 간 스프레드 모두의 이벤트 기간 동안 중요합니다. 바이러스 생활주기의 두 가지 구성 요소를 조절 분자 메커니즘, 멀리 축삭 (선행 성 전송) 및 감염 세포 (선행 성 확산)에 비리의 연속 전송에서 세포 기관에서 바이러스 어셈블리를 직접 전송 이해 헤르페스 바이러스 병인에 중요하다. 신경에 바이러스 입자의 전송과 송신은 성숙한 감염 virion의 1,2의 집합에 따라 달라집니다. 면역 (IF)과 전자 현미경 (EM)를 포함하여 이전에 고정 된 분석은, 입자의 조립 상태와 제자를 연구하는 데 사용되었다EIN 상호 작용 virion의 수송 및 확산 3-6와 관련. 그러나 화학 고정에 의해 도입 운반 비리 실험 유물의 동적 특성은 고정 된 이미지 7,8의 해석을 혼동. 최근 바이러스 형광 융합 단백질의 수는 단백질 기능의 무시할만한 영향을 미칠 HSV와 PRV에 대해 설명하고있다. 캡시드, 외피 및 당 단백질 9-11 : 녹색 형광 단백질 (GFP), 레드 형광 단백질 (mCherry 또는 MRFP) 형광체는 종종 성숙한 virion의 세 가지 구조 구성 요소의 두 가지 영상을 허용 한 쌍이된다. 이중 라벨 바이러스를 사용하여 선행 성 교통 세포 이미징을 살고는 수송 도중 바이러스 입자의 조립 상태를 시각화. 바이러스 변종을 표현 유사 형광은 수와 확산 12,13 다음 바이러스 게놈의 다양성을 시각화하는 데 사용됩니다. 형광 단백질의 특성 (14,15에 리뷰) 크게 영향을바이러스 또는 휴대 어셈블리를 시각화 할 수있는 능력. 야생형 기능의 보존을위한 새로운 단백질 융합을 설계하고 테스트 할 때 자기 상호 작용과 안정성 등 형광 단백질의 고유 특성이 고려되어야한다. 형광 단백질의 융합, 두 체외 세포 배양 시스템에서 잘 특성화와 함께 헤르페스 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징에 대한 사용된다 : 해리 16, 17 (그림 1A) 쥐 우수 자궁 경부 신경절 (SCG) 뉴런을하게 구분. 두 시스템에서 배아 SCG의는 하나의 세포 기관에 해리, 해부, 체외 배양 18에 대한 도금. SCG 신경은 자율 신경계의 일부이며 쉽게 성숙한 편광 상태 전직 생체에 배양 신경 성장 인자 (NGF)으로 구분 될 수있다. 해리 SCG 뉴런은 F 수 축색 돌기의 확장 된 네트워크를 형성또는 그들이 선행 성 교통 6를 받아야로 바이러스 입자의 시각화. 구획화 SCG 문화는 신경 세포체 (S 구획) 및 원위부 축삭 말단 (N 칸) 19의 유체 절연을 제공합니다. 원래 20 수정 Campenot 챔버 17를 사용하여 구획 된 뉴런의 건설 및 사용에 대한 자세한 프로토콜의 수는 이전에 다음 ID로 출판되었다. 유체 분리는 신경 세포 기관 및 격리 된 축삭 말단에 전송 한 후 자손 비리의 탐지를 선택적으로 감염 할 수 있습니다. 감염 전에 말단에 상피 세포를 도금하는 것은 바이러스 감염의 확산을 위해받는 세포를 제공합니다. 이 모든 라이브 셀 이미징 실험을위한 중요한 많은 필수 요소가 있지만, 우리의 프로토콜에 가장 관련이 있습니다 : 자동 이미지 수집, 형광등 조명, 영상의 속도 및 환경 제어. 모든 이미징 실험을 위해, 우리는 사용거꾸로, 자동화, epifluorescence에 조명 현미경 (그림 1B). 현미경은 니콘 이클립스 티베이스 중심으로 빠르게 재구성 자동화 이미지 수집하는 동안 현미경의 컴퓨터 제어 자동화 시스템의 숫자를 채택하고 있습니다. 형광 조명을 위해, 우리는 조명 경로를 따라 중립적 인 밀도 필터 감쇠 할 수 있습니다 광범위한 스펙트럼 수은 아크 램프를 사용합니다. 여기 필터는 형광 조명의 스펙트럼을 제한하고 멀티 패스 이색 거울과 형광 방출 필터 특정 형광 물질을 시각화와 결합 할 때. 여기 및 방출 필터는 서로 다른 형광 채널의 빠른 연속 획득을 가능하게하는 독립적 인 고속 스위칭 필터 휠에 장착되어 있습니다. 이미지 수집의 속도는 더욱 낮은 강도 신호와 짧은 이미지 번 읽어 검출에 유용 민감하고 빠른 EM-CCD 카메라로 향상됩니다. microsc의 환경 제어OPE는 인큐베이터 가열 스테이지 위쪽 및 가습 및 CO 2 농축 분위기 인큐베이터로 전달되는 동안 고온에서 샘플을 유지하기 위해 대물 렌즈 히터로 이루어집니다. 현미경 있으며 25 유지 온도와 어두운 방에 보관 ° C 모든 창에 암막 커튼을 최소화 외부 빛. 다음 프로토콜은 선행 성 전송 및 확산 분석이 시스템의 사용을 설명합니다. 대안의 숫자는 라이브 셀 이미징의 변수를 제어하기 위해 존재합니다. 현미경 설정의 제어는 수동으로 또는 독점 소프트웨어에 따라 자동화 된 시스템을 통해 수행 할 수 있습니다. 형광 조명은 할로겐, LED 또는 레이저 소스를 얻을 수 있습니다. 영상의 속도는 필터 전환의 속도와 짝을 탐지 시스템에 신호를 시각화하는 시간으로 변경됩니다. 환경 제어 마일에 특수 하드웨어를 얻을 수 있습니다croscope 단계 전부 또는 가열 가습 상자에서 현미경의 일부, 또는 현미경을 수행 할 실내의 온도를 상승으로의 인클로저. 이러한 대안 각각의 비용 및 성능과 관련된 장점과 단점이 있습니다. 다음 프로토콜, 우리는 당신에게 세부 사항을 재조합 바이러스 변종의 사용을 통해 빠른 선행 성 전송 및 alphaherpes 바이러스의 선행 성 확산을 연구하는 라이브 셀 이미징을 사용합니다. 실시간 라이브 셀 이미징 캡시드 (capsid), 외피 및 / 또는 축삭 11에서 전송받은 동적 구조에서 당 단백질의 공동 지방화를 시각화. 구획화의 연결을 문화의 하룻밤 인터벌 영상은 감염 세포 12의 축삭 virion의 탈출구 감염을 시각화. 여기에 제시된 프로토콜은 우리의 특정 이미징 시스템에 사용하도록 최적화되어 있지만, 라이브 셀 이미징의 네 가지 요소에 상대적으로 넓은 의미로 표시됩니다. 토론 우리더 세부 사항이 성공적으로 실험에 필요한 최적화의 일부 것이다.

<table><tbody><tr><td>35mm 유리 바닥 문화 접시</td><td>MatTek Corporation; Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC, 베로나, WI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>현미경 본체 </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nikon Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>전동 현미경 XY 스테이지</td><td>Prior Scientific; Rockland, MA</td><td>H117 ProScan Flat Top</td><td></td></tr><tr><td>전동 필터 휠</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 10 위치 필터 휠</td><td></td></tr><tr><td>형광 광원 </td><td>루멘 역학; 캐나다 온타리오주 미시소거</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>다중 대역 형광 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 카메라</td><td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide 스테이지 상단 환경 인큐베이터</td><td>Live Cell Instruments; 대한민국 서울</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈 히터</td><td>Bioptecs; Butler, PA</td><td>150803 컨트롤러 150819-12-08 히터</td><td></td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td><td>NIS 요소</td><td></td></tr></tbody></table>

alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

살아있는 세포 형광 현미경 기술뿐만 아니라 형광 융합 단백질을 표현하는 재조합 바이러스 변종의 건설의 발전은 수송과 뉴런의 alphaherpes 바이러스 감염의 확산을 실시간으로 시각화를 가능하게했다. 라이브 셀 이미징과 함께 바이러스 성 막, 외피 및 캡시드에 새로운 형광 융합 단백질의 유틸리티, 축삭 내에서 전송을 겪고 바이러스 입자 어셈블리를 확인했다. 비슷한 도구가 성공적으로 세포 사이에 전송 비리의 수와 다양성을 정량화하는 바이러스 입자의 확산 세포 - 세포의 분석에 사용되어왔다. 중요한 것은, 선행 성 수송과 확산의 라이브 셀 이미징 기술은 입자의 전송 속도, 입자 분포, 단백질 지방화의 시간적 분석 등 다양한 정보를 생성합니다. 클래식 바이러스 성 유전자 기술과 함께, 이러한 방법론 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다중요한 기계적인 문제에. 이 문서에서 우리는 자세히 alphaherpes 바이러스 수송과 확산의 기본적인 질문에 대답하기 위해 개발 된 이미징 방법을 설명합니다.

선행 성 전송 PRV 348와 해리 SCG 문화의 감염이 프로토콜의 응용 프로그램은 GFP-US9와 GM-mCherry 막 융합 단백질을 발현하는 재조합 PRV의 변형, 비리의 선행 성 전송 (그림 3 및 보충 영화 4)의 시각화를 촉진했다. 눈물 점을 운반에 자신의 검출 바이러스 입자 결과, 앞서 언급 한 이미징 조건으로 이러한 융합 단백질의 결합은 필터 전환 중에 움직이는 입자의 각 형광의 오프셋을 최소화합니다. 3 분 영상 창에서 수많은 운반 눈물 점은 일반적으로 관찰하고 colocalization을 분석을위한 큰 샘플 크기가 빠르게 생성됩니다. 우리는 이전에 GFP-US9의 colocalization을을 정량화 한, alphaherpes 바이러스 축삭이 방법 11을 사용하는 다른 구조 단백질과 단백질을 대상으로. 다른 듀얼 recombinan 유사한 분석T PRV의 변종도 11</sup...

alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

이 절차의 전반적인 목적은 형광 단백질 융합물을 사용하여 일차 신경세포 배양물에서 헤르페스 바이러스의 수송 및 확산 과정을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 조명의 빠른 전환이 가능한 현미경 상에서 생리학적으로 유의미한 온도로 샘플 배양 환경을 조성합니다. 두 번째 단계에서는 적절한 데이터를 획득하면서 세포의 광손상을 최소화하도록 형광 이미징 파라미터를 설정합니다.다음으로, 형광 채널의 순차적 획득 또는 다중 위치 획득을 수행합니다. 마지막 단계에서는 다중 이미지 타일 프레임을 획득합니다. 획득한 데이터는 분석 후 발표 및 출판을 위해 형식을 재구성합니다.궁극적으로, 이 살아있는 세포 이미징 방법은 뉴런 내에서 형광 바이러스 입자의 이동을 추적하고, 세포 간에 확산되는 감염 과정을 관찰하는 데 사용됩니다. 이 방법은 헤르페스 바이러스의 뉴런 내 수송 및 확산에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 입자의 내세포작용 섭취나 세포 이동과 같은 세포 생물학 및 미생물학의 다른 동적인 현상에도 적용될 수 있습니다.모든 이미징 실험을 시작하기 전, 현미경 스테이지 상단 인큐베이터를 연결하고 예열을 시작하십시오. 30분 후, 현미경과 투과광 및 에피 형광 광원, 그리고 자동 하드웨어 제어 장치를 켭니다. 그 다음, 현미경 제어 소프트웨어인 NIS elements를 실행하여 현미경에 연결하십시오.여기 NIS elements의 표준 사용자 인터페이스 스크린샷이 표시되어 있습니다. 재생 및 정지 버튼은 현재의 이미징 하드웨어 구성과 현재 이미징 중인 내용을 보여주는 라이브 이미지 창을 제어합니다. 상단 패널에는 투과 조명 또는 형광 검출을 위해 현미경을 설정하는 사전 설정된 하드웨어 설정을 구현하는 일련의 광학 구성 항목들이 있습니다.카메라 제어 및 노출 설정을 통해 카메라 검출 구성을 조정하여 이미지 품질과 속도를 최적화할 수 있습니다. 모든 실험은 ND 획득 제어 장치를 사용하여 조정됩니다. 다음으로, 적절한 오일 침수 렌즈에 렌즈 워머를 부착한 후, 현미경의 전동 스테이지에 스테이지 상단 인큐베이터를 장착하십시오.샘플을 고정할 적절한 인서트가 제자리에 있는지 확인한 다음, 인큐베이터 컨트롤러에서 스테이지 탑 인큐베이터의 입력 포트로 연결되는 가습 공기 라인을 연결하십시오. 인큐베이터와 렌즈 워머 컨트롤러를 켜고, 이미징하려는 목적 및 샘플에 맞게 이전에 검증된 조건으로 온도 설정을 조정하십시오. 마지막으로, 5% 이산화탄소 95% 대기 탱크의 제어 밸브를 열어 스테이지 탑 인큐베이터에 이산화탄소가 보충된 공기를 공급하십시오.실시간으로 비리온 수송 이벤트를 이미징하려면, 먼저 실험을 시작하기 최소 10분 전에 감염된 뉴런이 포함된 세포 배양 접시를 스테이지 탑 인큐베이터에 넣으십시오. 그런 다음 투과광과 현미경 접안렌즈를 사용하여 축삭 돌기가 명확하게 분리되어 있는 뉴런 세포체를 찾으십시오.신경 배양물에서 이미징 가능한 영역을 찾는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 세포 성장 불량이나 오염이 발생하거나, 이미징 중에 배양물이 물리적으로 손상될 경우를 대비하여 여러 개의 배양물을 준비함으로써 성공 가능성을 높일 수 있습니다. 이제 현미경 소프트웨어를 사용하여 광경로를 EM CCD 카메라로 전환한 다음, 재생 버튼을 클릭하여 라이브 이미지 창을 실행하십시오.각 형광 단백질 세트에 대한 최적의 카메라 노출 설정을 결정한 후, 카메라의 전자 증배 이득(electron multiplication gain)을 300으로 설정합니다. 이는 노출 시간을 최소화하고 희미한 신호의 검출력을 높이기 위함입니다. 샘플의 퇴색을 방지하기 위해 라이브 이미징 창을 닫습니다.다음으로, 노출 시간을 설정하고 NIS elements에서 축삭의 명확한 영역을 찾은 후, 순차적 이미지 획득을 위해 소프트웨어를 구성합니다. 애플리케이션 드롭다운 메뉴를 열고 6D define run experiment 애플리케이션을 선택하십시오. ND acquisition 창에서 time 탭을 클릭하여 이미지 획득 빈도를 결정합니다.간격을 '지연 없음(no delay)'으로, 지속 시간을 5분으로 설정하십시오. 이제 Lambda 탭을 클릭하여 다중 형광 이미지 획득에 사용되는 사전 설정 하드웨어 구성을 선택하십시오. 첫 번째 상자를 클릭한 다음, 이어지는 드롭다운 메뉴에서 적절한 하드웨어 구성을 선택하십시오.파일로 저장(save to file) 상자를 선택하고 실험 출력 파일의 저장 위치와 파일 이름을 설정하십시오. 모든 파라미터 설정이 완료되면, 지금 실행(run now) 버튼을 클릭하여 실험을 시작하십시오. 이미지 획득 속도는 노출 설정과 획득하는 이미지 크기를 통해 최적화됩니다.NIS elements의 관심 영역(region of interest) 도구를 사용하여 관심 영역을 설정하십시오. 전체 이미지 영역의 25~50% 사이의 영역을 선택하여 엔트라그레이드 전파(anterograde spread) 이벤트의 야간 타임랩스 이미징을 수행합니다. 먼저, 배양 접시를 스테이지 상단 인큐베이터에 조심스럽게 넣으십시오.대물렌즈의 위치가 디쉬 측면에 설정되었는지 확인한 후, 대물렌즈가 샘플을 밀어 올리지 않도록 주의하며 천천히 초점을 맞춥니다. 초점 영역이 확인되면, 대물렌즈를 디쉬 중심의 내부 장벽 근처로 천천히 이동시켜 축삭 구획의 내부 측을 표시하되, 이때 초점 깊이를 유지하고 샘플을 밀어 올리지 않도록 주의합니다. 다음으로, 샘플의 탈수를 최소화하고 열 절연을 제공하기 위해 테플론 링 바깥쪽의 배양 디쉬 내 뉴런 주변에 37 °C PBS 약 2 mL를 채웁니다.그 다음, 중성 밀도(ND) 필터를 모두 사용하여 조명 강도를 가능한 최저 수준으로 제한함으로써, 과도한 광손상 없이 장기간에 걸쳐 빈번하게 이미지를 획득할 수 있도록 합니다. ND 획득 창에서 대형 이미지 탭을 클릭한 다음, 5x2 이미지 영역을 선택하십시오. 7%의 스티칭 중첩(stitching overlap)을 적용하여 여러 위치를 병렬로 순차적으로 촬영합니다.밤샘 촬영 과정 중에 XY 포지션 탭을 선택하십시오. 그다음 각 대형 이미지 영역의 중심점이 될 위치를 정의하십시오. 초점은 세포의 핵에 맞춰야 하며, 대부분의 세포에서 핵막이 명확하게 보이도록 대물렌즈의 위치를 조정하십시오.그런 다음, 노출 및 위치 설정을 테스트하기 위해 한 번의 루프(loop)를 클릭하고, 결과 이미지의 투과광, 조명, 초점 및 프레임을 평가하십시오. 모든 설정이 검증 및 테스트되었다면, 'run now' 버튼을 클릭하여 라이브 셀 이미징 중에 획득한 동영상을 내보내어 자동 실험을 시작하십시오. 먼저, NIS elements에서 적절한 raw ND2 파일을 열고 'split component view'를 선택하십시오.원하는 형광 채널을 시각화하려면 적절한 속도로 파일을 재생하십시오. 빠른 수송 과정을 시각화할 때는 초당 5프레임으로 시작하는 것이 좋으며, 동영상 재생 중에 실시간 시계를 나타내는 타임스탬프를 포함하십시오. 이미지에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 ADD ND information을 선택하십시오.화면 왼쪽 상단에 디지털 카운터가 나타납니다. 타임스탬프를 편집하려면 카운터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'edit ND information'을 선택하십시오. 이어지는 팝업 창에서 해당 영상 파라미터를 반영하여 텍스트를 수정하십시오. 가독성을 위해 텍스트의 글꼴 색상과 크기를 조절하십시오.그런 다음 편집 메뉴로 이동하여 'Create view snapshot'을 선택하여 뷰 스냅샷 창을 엽니다. 전체 영상의 형광 채널을 포함하는 8비트 RGB 내보내기용 파일을 생성하기 위해 'apply to all frames'를 선택합니다. 마지막으로, 플랫폼 간 호환성을 위해 파일을 AVI 형식으로 저장하고 재생 속도를 프레임당 200 milliseconds로 설정합니다. 이 위상차 이미지에서는 역행성 비리온 수송 이미징에 사용된 대표적인 성숙한 해리 상경절 또는 SCG 배양 세포가 나타나 있습니다. pseudo rabies virus 또는 PRV 3 48에 감염된 뉴런은 GFP-S9 및 Gm-mCherry 막 융합 단백질을 발현합니다.이 그림에서는 P RV 3 48 감염 8시간 후 SCG 축삭의 대표적인 살아있는 세포 이미징 결과가 제시되어 있습니다. 원위부 축삭 내의 순방향 수송 구조가 GFP와 mCherry라는 두 가지 형광 채널에서 시각화되었습니다. 흰색 화살표로 표시된 순방향 수송 구조가 축삭 내에서 이동하고 있습니다. 형광 채널의 순차적 획득과 바이러스 구조의 빠른 이동으로 인해 두 형광 단백질의 위치가 공간적으로 어긋나 보입니다.해당 프로토콜을 PRV 3 48이 감염된 분리 SCG 배양액에 적용함으로써 VoN의 순방향 수송을 시각화할 수 있었습니다. 이러한 융합 단백질이 바이러스 입자에 포함되면, 이동하는 형광 점으로 시각화되는 수송 점(puncta)에서 이들의 검출이 가능해집니다. 앞서 언급한 이미징 조건은 필터 전환 중 이동하는 입자에서 각 형광체의 오프셋(offset)을 최소화합니다.고속 전환 필터 휠과 쌍을 이룬 다중 통과 다이크로익 미러를 활용하면, 3분의 이미징 윈도우 동안 초당 최대 0.8프레임의 속도로 두 개 이상의 형광 채널을 빠르게 연속적으로 획득할 수 있습니다. 수많은 이동성 Punta가 흔히 관찰되며, 공동국소화 분석을 위한 대규모 샘플 크기를 빠르게 생성할 수 있습니다. 여기에는 왼쪽 구획에 SCG 뉴런이 플레이팅되어 있고, 축삭 돌기가 내부 장벽 아래로 뻗어 가장 오른쪽 구획까지 도달한 구획화 배양 시스템의 모식도가 이 이미지에 나와 있습니다.다음 이미지들은 PRV 4 27에 감염된 축삭에서 수용 상피 세포로의 비리온 전송을 촬영한 대형 타일 기반 타임랩스 동영상에서 선택되었습니다. 첫 번째 패널은 감염 후 특정 시점에서 전송된 YFP 및 RFP 형광 이미지들이 나타난 모습입니다. 수용 세포들이 막 결합 YFP 및 VP 26 MRFP 융합 단백질을 발현하기 시작하는 단계가 보여집니다.흰색 상자는 감염된 캡시드 어셈블리가 포함된 수용 상피 세포 영역을 강조합니다. 여기서는 RFP 채널로만 관찰한 이전 이미지와 동일한 영역을 보여줍니다. 실선 흰색 라인은 세포 윤곽의 도식적 표현을 나타냅니다.점선으로 표시된 흰색 선은 세포핵을 나타내며, 파란색 선은 축삭의 윤곽을 나타냅니다. 이 두 번째 패널에서는 YFP와 RFP 채널만 함께 보여줍니다. 축삭 경로와 연관된 MRFP 점들의 수가 매우 많다는 점에 유의하십시오.이 세포들은 최근에 감염되었으며 두 가지 융합 단백질 중 어느 것도 발현하지 않습니다. 감염된 세포들을 역추적하여 바이러스 감염을 유발한 형광 캡시드를 시각화할 수 있습니다. 이러한 개별 세포들은 큰 프레임에서 분리하여 세부 정보의 큰 손실 없이 추적할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 살아있는 세포 현미경 관찰이 관찰 대상인 생물학적 과정에 영향을 줄 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 하지만 이러한 프로토콜을 세심하게 최적화하면 생물학적 변화 없이 시각화가 가능합니다.

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

원형질막에서 트랜스-골지체 네트워크로의 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 수송은 막 항상성을 유지하고 신호 전달을 조절하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HeLa 세포에서 유도체화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 살아있는 세포 현미경으로 막관통 화물 단백질의 엔도사이틱 수송을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

학습하세요 알파헤르페스 바이러스의 신경 세포 내 수송 및 확산 과정을 형광 단백질 융합체와 라이브 셀 이미징 기법으로 실시간 시각화하는 방법을. 이 기술은 바이러스 감염 역학 연구에 필수적입니다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

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