총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한

본 절차의 전체적인 목표는 박테리아 프로테옴의 2차원 지도를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 배양물을 성장시켜 단백질을 수확함으로써 수행됩니다. 다음으로, 수확된 단백질들을 pH에 따라 1차원으로 분리합니다.

1차원 분리 후 등전점 전기영동을 거친 단백질들은 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다. 마지막으로, 2차원 겔을 염색하여 단백질을 시각화합니다. 최종적으로 2차원 전기영동을 통해 단백질 발현의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 특정 조건에서 어떤 단백질이 생성되는지, 그리고 서로 다른 세균 분리주 간에 단백질 생성에 어떠한 차이가 있는지와 같이 세균 병원성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 정보는 독성에 관여할 가능성이 있는 후보 단백질을 식별하는 데 유용합니다. 100 mL의 bur cold dairy 배양액을 정지기에 도달할 때까지 배양한 후, 35 mL를 원심분리관으로 옮겨 4,500 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.

침전물을 35 mL의 차가운 PBS에 현탁하고 원심분리를 반복합니다. 침전물을 1 mL의 차가운 PBS에 현탁한 후, 용액을 멸균된 2 mL 마이크로 튜브로 옮기고 다시 원심분리합니다. 4 °C, 14,000 G에서 1분 동안 원심분리하기 전에 1 mL의 차가운 PBS로 세척 과정을 반복합니다. 상층액을 제거하고 1 mL의 PBSEDTA-PMSF 용액을 추가한 뒤, 용해된 침전물을 약 0.5 mL의 사전 멸균된 유리 비드가 들어 있는 2 mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.

그다음 세포를 파쇄하기 위해 저온실에서 미니 비드 비더(mini bead beader)를 사용하여 1분씩 3회 처리하며, 매 회차 종료 후 샘플을 얼음 위에 둡니다. 원심분리를 1분간 수행한 후 상층액을 멸균된 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 수율을 높이기 위해, P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F 분주액을 추가하여 비드 파쇄 과정을 2회 반복합니다. 샘플을 회수합니다.

그 다음 단백질 정량을 측정한 후, 1차원 전기영동을 수행할 때까지 200 µg씩 분주하여 -80 °C에 보관하십시오. 등전점 전기영동(Isoelectric focusing) 또는 IEF은 스트립 세척액을 사용하여 스트립 홀더를 세척하는 것으로 시작합니다. 이어서 Milli Q water로 스트립을 헹굽니다.

그 다음, 샘플을 거꾸로 세워 건조시킨 후 각 샘플에 겔 스트립 홀더 번호를 부여하십시오. 미리 준비한 200 µg 단백질 샘플을 스트립 홀더의 측면 웰에 로딩하고, 깨끗한 핀셋과 피펫을 사용하여 샘플을 홀더 전체에 분배하십시오. 포장지에서 겔 스트립을 꺼내십시오.

그런 다음 젤 스트립에서 보호층을 제거하고, 거친 면이 아래로 향하게 하여 음극 끝에서 양극 끝으로 천천히 밀어 넣으며 스트립을 적십니다. 번아웃(burnout)을 방지하려면 멸균수로 적신 블로팅 페이퍼를 전극 위에 놓고 젤 스트립 아래에 배치하십시오. 기포를 제거하고 얇은 미네랄 오일 층을 덮어 건조를 방지합니다.

IEF 장비의 겔 스트립 홀더를 정렬합니다. 여기에 나열된 프로그램을 사용하여 샘플을 분석합니다. 마지막 단계 중에는 언제든지 겔을 제거할 수 있습니다.

프로그램이 완료되면 스트립 홀더에서 스트립을 제거하고, 즉시 사용하지 않을 경우 플라스틱 랩으로 덮어 2차 원형 SDS page를 수행할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. SDS page를 위한 젤 캐스터 장치를 조립한 후, 진공 팁과 교반 바가 있는 플라스크에 1.5 M tris 버퍼와 MCU water 혼합물을 넣어 젤 용액을 준비하고, 진공 장치를 사용하여 중간 속도로 20분 동안 용액을 탈기하십시오. 진공 처리가 끝나면 10% SDS를 플라스크 벽면을 따라 피펫팅하여 젤 용액에 첨가하십시오. 기포가 생기는 것을 방지하기 위해, 새로 조제한 ammonium per sulfate와 temid를 첨가하고 교반하십시오.

겔을 붓고 굳을 때까지 기다린 다음, 이전에 준비한 평형화 용액에 DTT를 녹입니다. -80°C 보관함에서 스트립을 꺼내 포장을 벗기고, IPG 스트립의 겔 면이 아래로 향하게 하여 버퍼에 넣고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 전기영동 탱크에 전기영동 버퍼 4.5리터를 넣습니다.

그다음 핀셋을 사용하여 평형 용액에서 스트립을 꺼내고, 종이 타월로 과잉 버퍼를 제거합니다. 겔 캐스터 장치를 분해하고 유리판을 따뜻한 물로 세척합니다. 겔 상단의 물을 러닝 버퍼로 교체한 후, 깨끗한 핀셋을 사용하여 겔 면이 본인을 향하도록 하여 긴 유리판 위에 스트립을 놓습니다.

IPG strip에 1x buffer를 도포하여 윤활시킨 다음, 플라스틱 스트립을 사용하여 IPG strip을 젤 방향으로 더 밀어 넣어 스트립과 젤 사이의 모든 기포를 제거합니다. 스트립 상단에 agarro sealing solution을 추가하여 스트립을 고정합니다. 모든 스트립에 대해 이 과정을 반복한 후, 이를 젤 탱크에 넣습니다.

외부 챔버의 1x 버퍼 수위가 지정된 높이에 있는지 확인한 후, 상부 챔버를 장착하십시오. 상부 버퍼 챔버용 프레임을 유리판 위에 놓고 아래로 누릅니다. 상부 챔버의 중간선까지 2x 러닝 버퍼를 추가하십시오.

그런 다음 외부 챔버에 1x 러닝 버퍼를 상단 라인까지 채웁니다. 덮개를 닫고 전기영동 장치와 파워 팩의 전원을 켭니다. 샘플을 52 V, 96 mA, 5 W 조건에서 밤새 동안 전기영동합니다.

선단선이 바닥에서 1 cm 거리까지 내려올 때까지 젤 전기영동을 수행합니다. 작동 시간이 끝나면 캐스터에서 플레이트를 제거합니다. 유리 플레이트에서 젤을 분리한 후, 4 °C에서 최소 1시간 또는 밤새도록 용액 1에 넣어 고정합니다.

그 다음 겔을 고정액 2로 옮기고 1시간 동안 흔들어 섞어줍니다. Milli Q water로 15분씩 4회 세척합니다. 그런 다음 질산은 용액을 사용하여 30분에서 최대 48시간 동안 겔을 염색합니다.

Milli Q water로 젤을 1분 동안 세척한 후, 젤이 염색될 때까지 현색액으로 옮깁니다. 약 5분에서 30분 후 반응을 중지시키기 위해, 젤을 정지액으로 옮겨 10분 동안 둡니다. 여기 제시된 것은 ol dia multivorans의 전세포 단백질 추출물을 Coomassie Blue로 염색한 젤입니다.

LB 또는 yeast mannitol broth에서 배양하여 정지기(stationary phase)에 수확한 임상 분리주입니다. 동일한 박테리아 배양물로부터 두 차례에 걸쳐 추출한 단백질 프로파일의 비교 분석 결과, 유사한 밴딩 패턴이 나타나 단백질 추출이 성공적으로 이루어졌음을 보여주었습니다. 이 그림의 Bural dio, pseudo에서 유래한 200 micrograms의 총 단백질에 대한 2D 젤 전기영동 분석 결과, 질량 분석법으로 개별 식별이 가능한 500개 이상의 스폿(spot)이 풍부하게 관찰되었습니다.

이 절차 이후에 사이토메트리와 같은 다른 방법들을 수행하여 밀접하게 연관된 박테리아 분리주 간의 정성적 및 정량적 차이를 결정할 수 있습니다. 또한, 염색 방법을 수정하면 연구자는 스팟 절제 및 질량 분석법을 통해 단백질 스팟의 정체를 결정할 수 있습니다.