유전자 탐구하는 종피 침구 분석

본 실험 절차의 전반적인 목표는 다양한 환경 조건에서 배유가 rabbit opsis의 종자 발아를 어떻게 조절하는지 유전적 수준과 in vitro 수준 모두에서 탐구하기 위한 종피 베딩 분석(seed coat bedding assay)을 구성하는 것입니다. 이는 먼저 주사바늘과 절단된 포셉을 사용하여 Arab Opsis 종자에서 종피와 배를 조심스럽게 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 분리된 종피를 발아 배지로 조심스럽게 옮깁니다.

다음으로, 종피를 하나의 원형 층으로 조립합니다. 마지막 단계에서는 배를 조립된 종피 층의 중앙에 배치합니다. 이 또한 하나의 원형 층으로 구성합니다.

배젖은 아라비돕시스 씨앗의 종자 발아를 조절하는 데 필수적인 역할을 합니다. 종자 외피 굴곡 분석(seed coat bending assay)은 종자 발아 조절을 위해 배젖에서 작동하는 신호 전달 경로의 분자 유전학적 구성 요소를 식별하기 위한 인 비트로(in vitro) 유전 시스템 절차입니다. 일반적으로 배아를 손상시키지 않고 빠르게 분리해 내는 것이 어렵기 때문에, 이 방법이 처음인 사람들은 어려움을 겪습니다.

재료의 연령 또한 고려하는 것이 중요한데, 이는 재료가 노화됨에 따라 세포 결정 능력을 상실하기 때문입니다. 먼저 성숙한 건조 상태의 Arabidopsis 종자 50~60 $\mu\text{L}$를 1.5 $\text{mL}$ 마이크로 원심분리 튜브에 붓습니다. 그런 다음 튜브에 70% 에탄올 1 $\text{mL}$를 넣고, 보텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 상온에서 1,200 $\text{RPM}$으로 종자를 흔들어 줍니다. 10분 후, 4,000 $\text{G}$에서 3초 동안 튜브를 원심분리하여 종자가 튜브 바닥에 모이도록 합니다.

그런 다음 진공 흡입 팁을 사용하여 에탄올을 조심스럽게 흡입하고, 튜브 바닥에 씨앗만 남깁니다. 이제 씨앗에 멸균 증류수 1 mL를 첨가하고, 다시 10분 동안 씨앗을 흔들어 줍니다. 씨앗을 다시 원심 분리하여 가라앉힌 후, 상층액을 흡입하고 튜브에 멸균 증류수 1 mL를 추가로 첨가하여 물의 흐름에 의해 씨앗이 튜브 전체에 균일하게 부유하도록 합니다.

그 후 튜브를 랙에 세워 씨앗이 튜브 바닥으로 가라앉도록 합니다. 약 30초 후에, 씨앗을 플레이팅하기 위해 물을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 먼저, 새로 조제한 50 °C의 발아 배지 30 mL를 100 mm 페트리 접시에 붓습니다. 멸균 증류수 200 µL에 씨앗을 다시 현탁시킨 후, 1 mL 마이크로 피펫 팁을 사용하여 씨앗을 발아 배지 표면으로 옮깁니다.

종자 주변의 물을 흡입하여 제거한 후, 추가 건조를 위해 페트리 접시와 종자를 덮개 없이 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내에 둡니다. 2시간 후에 페트리 접시를 닫고, 작업대 내에서 90분 동안 더 유지합니다. 이제 작업대 내에 실체 현미경을 설치합니다.

다른 100 millimeter 페트리 접시에 30 milliliters의 발아 배지를 붓고, 배지 표면에 인접하게 배치한 직사각형의 멸균 watman 3 millimeter 여과지 두 장을 올립니다. 이 절차에서 가장 어려운 단계는 종자 절단입니다. 종자가 매우 얇기 때문에, 멸균된 blunt tip dumont 5번 핀셋으로 종자를 잡고 절단할 때 배아가 손상되지 않도록 매우 주의해야 합니다.

종자를 종이 위에 옮긴 후, 포셉을 닫은 상태로 유지합니다. 개별 종자를 종이 위에 살며시 누릅니다. 이제 29게이지 인슐린 주사기 바늘 팁을 사용하여, 자엽이 유근에 연결된 부위와 최대한 가깝게 종피의 가장 긴 반주축을 따라 절개합니다.

그 다음 핀셋을 사용하여 종자를 종이에 밀착시킵니다. 다시 한번 유근의 끝부분과 가장 가까운 Cains의 끝부분에 압력을 가해 종피에서 배를 분리하여 종피 베딩 분석(seed coat bedding assay)을 준비합니다. 먼저 3.5 by 5 cm 크기의 멸균 나일론 메쉬 조각을 새로 부은 또 다른 100 mm 발아 배지 디쉬에 넣습니다.

그런 다음 주사기를 사용하여 배아와 종피를 핀셋의 금속 가장자리로 조심스럽게 밀어내어 식물 조직을 나일론 메쉬 위로 옮깁니다. 핀셋과 주사기를 사용하여 종피를 단일 원형 층으로 배열하되, 종피들이 최대한 서로 밀착되게 하고 종피의 개구부가 위를 향하도록 합니다. 그 후, 배아들 역시 최대한 서로 밀착되도록 하여 종피 층의 중앙에 단일 원형 층으로 배치합니다.

마지막으로, 이전 결과와 일치하도록 20 to 21 °C의 연속 광 조건에서 종자 베딩 분석법을 배양합니다. gier illin을 합성할 수 없는 rabbit opsys 돌연변이 종자 또는 GA 결핍 돌연변이체는 종자 억제 80시간 후에도 발아하지 못합니다. 이와 대조적으로, 그리고 이전 결과와 더욱 일치하게, 배지에 OB CIC acid 또는 BA가 존재하지 않는 한 종피 제거는 GA 결핍 돌연변이 배아의 성장을 유도하며, 이는 GA 결핍 돌연변이체의 배유가 배아로 BA를 방출하여 발아를 차단함을 시사합니다.

이 이미지에서는 종자 억제 80시간 후, 80개의 GA 결핍 돌연변이 종피 층 위에 GA 결핍 돌연변이 배아를 배치한 종피 베딩 분석(seed coat bedding assay) 결과가 나타나 있습니다. 우리의 가설과 일치하게, GA 결핍 돌연변이 종피는 GA 결핍 돌연변이 배아의 성장을 억제합니다. 여기서는 A BA 합성 능력이 결여된 GA 결핍 돌연변이 종피 층에서 GA 결핍 돌연변이 배아를 배양한 종피 베딩 분석 결과가 나타나 있으며, 예상대로 돌연변이 종피는 GA 결핍 돌연변이 배아의 성장을 억제하지 못합니다.

마찬가지로, deli 인자인 RGL2가 결핍된 GA 결핍 돌연변이 종피 베드에서 배양된 GA 결핍 돌연변이 배아 역시 이 절차를 따른 후 성장이 억제되지 않았습니다. 종피 배양법을 이용하여 유전적 상호작용을 조사하기 위해, 종자에서 분리한 종피와 배아의 유전자 발현 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 따라서 이 기술을 숙달하면, 종자 발아 분야의 연구자들이 종피가 환경 신호에 반응하여 배아의 성장을 어떻게 조절하는지 탐구하는 데 도움이 될 것입니다.