Name: 제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별 스포 도프 테라 리토 랄 DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙 13 C-포도당 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 배우세요 Spodoptera littoralis의 장내 대사 활성 박테리아를 안정 동위원소 프로빙과 파이로시퀀싱으로 식별하는 방법입니다. 이 기술은 미생물 생태학 및 곤충 생리학 연구에 활용됩니다.

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우리는 실험실 지원되었습니다 Angelika 버그 감사합니다. 이 작품은 막스 플랑크 사회와 미생물 통신 (JSMC)에 대한 예나 학교에서 지원하고 자금을했다.

1. 곤충 사육 <ol><li> 구입 또는 스포 도프 테라의 계란 클러치를 얻을 자신의 양육에서 리토 랄. 부화 할 때까지 실온 (RT)에서 무균 배양 접시에서 그들을 유지합니다. </li><li> 다음과 같이 사육 곤충의 인공 사료를 준비합니다 : <ol><li> 물 100 ㎖에 하룻밤 500g 지상 흰 콩을 적신다. </li><li> H 2 O 증류수 1,000 ml로 9.0 g 아스 코르 빈산 및 75g의 한천을 추가하고, 그 후 가열한다. </li><li> 혼합물이 냉각하게하고 (흰색 밀랍 고체 혼합물) 응고 할 때 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 조명의 16 시간과 어둠의 8 시간과 긴 하루 정권 깨끗한 플라스틱 상자와 23 ~ 25 ° C에서 인공 사료에 후면을에 부화 된 유생을 전송합니다. 애벌레가 여섯 애벌레 령충을 통과 할 때까지 매일 음식을 변경합니다. </li></ol> 대사 활성 창자 박테리아의 DNA의 2. 13 C-라벨 <ol><li> 증류수, 탈 이온수 (DDH 2 O)와 완벽하게 13 C-표지 된 포도당 186.1 mg의 용해 및 SIP 실험을위한 인공 사료 100 g을 잘 혼합. 인공 사료에 10 mm의 최종 13 C - 포도당 농도를 확인합니다. 이것은 S.의 창자에있는 현장의 포도당 농도를 모방 샤오 등에 따라면 식물에 리토 랄 유충의 먹이. (제출). </li><li> 전송 9-15 신선한 13 C - 포도당을 함유하는 멸균 플라스틱 페트리 접시 (세균 배양 용 접시 당 하나의 유충)에 사육 상자에서 건강한 두 번째 령 유충은 인공 사료를 아군. 한 바와 같이 대조군 수유를 들어, 네이티브 포도당 (글루코스 C-12)의 동일한 양을 함유하는 인공 사료를 사용한다. </li><li> 배양 기간 (1 일) 동안 자주 인공 사료를 갱신. 단계 1.3에서와 같이 양육 조건을 사용합니다. </li><li> 후 처리 (DNA 추출)에 대한 각각의 치료에서 아홉 애벌레를 수집합니다. 각각의세 개인에 의해 구성되고, 복제, 처리 당 적어도 세 개의 반복을합니다. </li></ol> 3. 곤충 해부 <ol><li> 깨끗하고 에탄올 70 % (도구 = Vannas 가위, 집게 및 미세 일회용 블레이드 메스)에 대한 작업의 시작 부분에 해부 도구를 소독. </li><li> 부드러운 집게와 곤충을 가지고 증류수로 표면적으로 자신의 피부를 씻는다. 를 마취하기 위해 적어도 30 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 여전히 그들을 죽일 1 시간 동안 0 ℃에서 장소를 마취하는 동안. 몇 분 에탄올 (70 %)에서 그들을 담가 표면으로 죽은 곤충을 소독. </li><li> 7.4으로 산도를 조정, 약 15 ㎖의 1X PBS의 멸균 페트리 접시 (1XPBS = 137 밀리의 NaCl, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4에 증착의 볼륨으로 곤충 해부를 수행 , 오토 클레이브). 완전히 한 solut에 몰두 전체 곤충의 몸을 갖는하십시오전체 해부 기간 동안 이온. </li><li> 머리에 시작하여 항문에 완료, 오른쪽과 곤충의 왼쪽 측면을 따라 피부를 절개하여 절개를 시작합니다. 피부 전체, Malpighian 세관, 지방의 몸을 제거합니다. 창자를 열고 절단하기 전에 신선한 버퍼로 변경합니다. 절은 앞, 미드, 그리고 hindgut의 용기가 필요합니다. 냉동실에 조직을 보관 (-80 ~ -20 ℃)​​까지 D​​NA 추출 </li></ol> 4. DNA 추출 및 증폭 <ol><li> 1.5 ㎖의 멸균 원심 분리 관에있는 곤충의 조직을 놓고 진공 집중 장치에서 45 ° C에서의 모든 샘플을 건조. 멸균 플라스틱 유봉 건조 조직을 분쇄. </li><li> 토양 DNA 추출에 적합한 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. 키트의 반응 관에 건조 조직을 전송하고 제조업체가 표시된 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 최종 용출 된 DNA의 농도를 결정. </li><li> Verif와 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3) - Eubacterial 일반 프라이머를 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 5)를 사용하여 진단 PCR 분석을 준비하여 곤충의 창자에서 미생물 metagenomic DNA의 나중에 성공 추출. 다음과 같이 PCR 반응을 설정 <ol><li> 1X 버퍼, 1.5 mM의 MgCl2를, 10 mM의 네 옥시 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 2.5 U의 Taq의 DNA 중합 효소, 각 프라이머의 0.5 ㎜, 템플릿으로 추출 된 DNA의 60 NG를 포함하는 50 ㎕의 반응 액을 설정합니다. </li><li> 30 초 동안 55 ° C에서 45 초, 어닐링 94 ° C, 1 분 72 ° C의 확장 :; 35 회 반복 처음 3 분 동안 94 ° C에서의 변성을 다음과 같이 열 순환기를 사용하여 PCR 반응을 실행 . 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 단계를 사용합니다. </li><li> 1 % 아가로 오스의 성공적인 PCR 증폭 에티 디움 브로마이드 (EB) 스테인드 젤 (100 1X TAE 버퍼링 ㎖의 1μL EB와 얼룩에 아가로 오스의 1g을 용해) 전기 영동 확인합니다. 일의 예금 5 μL젤 주머니에 배의 로딩 염료 + 1μL 전자 PCR 제품. (1X TAE pH를 8로 조정, 40 MM 트리스 -베이스, 20 mM의 빙하 아세트산, 1 mM의 EDTA를 =). </li><li> CA에 대한 300 V, 115mA에서 1xTAE 버퍼를 사용하여 젤을 실행합니다. 전기 챔버에서 20 분. 젤 문서 실 (디지털 카메라를 컴퓨터에 연결 UV 트랜스 일루미네이터)를 사용하여 젤을 관찰하고도로드 유전자 마커를 사용하여 최종 제품의 크기를 비교, 증폭 산물의 정확한 크기는 약 1.5 KB이어야합니다. </li></ol></li><li> 우선적으로, 깊은 냉동 조건에서 PCR 제품을 보관 -80 ° C, 사용할 때까지. </li></ol> 5. DNA 분리 - CSCL 그라데이션 초 원심 분리 <ol><li> 다음과 같이 초 원심의 그라데이션의 시약을 준비 <ol><li> 점차 DDH 2 O에서 협동 학습의 603.0 g을 용해시켜 7.163 M 염화 세슘 (CSCL) 솔루션을 준비하고 500 ML의 최종 볼륨을 채워. </li><li> 정확하게 해제삼중 의해 세자리 밸런스에 1.0 ml의 분취 량을 계량하여 준비된 CSCL 용액의 밀도 테르. 이것은 일반적으로 1.88 및 1.89 g / ㎖에서 RT에서 배열한다. </li><li> 1 M 트리스-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA 1 ㎖ (산도 8) 및 마지막에서의 KCl 3.75 g의 50 ㎖를 조합하여 구배 완충액 (100 mM 트리스, 100 ㎜의 KCl, 1 mM의 EDTA)를 준비 DDH 2 O를 사용하여 500 ㎖의 부피 (0.22 μm의) 필터이 솔루션을 살균 압력솥. </li></ol></li><li> DNA 분리 <ol><li> 포인트 4.3로 측정 처리 된 곤충의 개별 DNA 농도를 결정하는 데, 함께 복제에 대응하는 하나 하나가 동일하게 풀링 된 샘플에 기여하고 있는지 확인하기 위해 DNA 농도를 정상화하는 곤충을 풀. DNA의 500 ~ 5,000 NG (다시 최종 농도를 측정)의 최종 농도는 원심 분리 공정 (21)에 적합하다. </li><li> 그라데이션 매체를 설정하려면, 정량화 된 DNA, 그라데이션 버퍼를 결합D 4.8 멸균 15 ML 스크류 캡 튜브 (그라데이션 중간 DNA 혼합물의 생성)에 6.0 ㎖를 혼합 볼륨에 함께 7.163 M 협동 학습 솔루션의 ML. </li><li> 조심스럽게 주사기와 바늘을 사용하여 (튜브 목의 기초까지 기입) 5.1 ㎖의 초원 심 분리기 튜브로 제조 된 그라데이션 중간 DNA 혼합물을 배치합니다. 공기 방울을 펌핑하거나 형성하지 마십시오. 참조 그라데이션 각 원심 분리기 실행에 (대신 DNA의 DDH 2 O를 사용하여) 하나 이상의 빈 그라디언트를 포함합니다. </li><li> 각 필수 그라데이션 매체 후 중량 10 ㎎ 이내로 밸런스 관 쌍은 각각의 초원 심 분리기 튜브로 가득 차 있습니다. &quot;튜브 토퍼&quot;로 튜브를 밀봉하고 인감 누출이없는 튜브를 반전 손으로 적당한 압력을 적용하여 있는지 확인합니다. </li><li> 초 원심 5.1 ML의 원심 분리 튜브를 들고 8 개의 우물에 가까운 수직 로터를 사용합니다. 조심스럽게 로터 우물을 봉인하고 엄마에 따라 초 원심 분리기로 로터를로드nufacturer의 지시. 초 원심 분리 조건을 설정 스핀을 진공 40 시간 동안 실행 시간 50,000 (177,000 XG 정도) 회전 수, 온도 20 ° C에서, 및 초 원심에서. 브레이크없이 최대 가속과 감속을 선택합니다. </li><li> 일단 완료, 조심스럽게 집게를 사용하여 원심 분리기 회 전자에서 튜브를 제거합니다. 튜브 내에서 형성 그라데이션을 방해하지 않고 랙에 배치합니다. 가능한 빨리 임의의 확산을 최소화하기 위해 구배 분획 샘플들을 처리한다. </li></ol></li><li> 분별로 Isopycnic 분리 그라디언트에서 DNA의 검색 <ol><li> 똑같이 초원 심 분리기 관 정상 변위 방법에서 형성 그라데이션을 구분하는 그라데이션 분별을 수행하기 위해 정확한 HPLC 펌프 시스템을 사용합니다. DDH 2 O 1 L 변위로 채워진 병에 HPLC 펌프 (100 % 흐름 구배를) 연결하고 단단히 주사기 바늘에 23 G 1 오픈 펌프 호스에 연결합니다. 충분한 B 추가그것을 다크 블루 색상을 제공하기 위해 DDH 2 O에 파란색 염료를 romophenol. 이것은 그라데이션 매체 DDH 2 O.의 변위 사이의 인터페이스의 시각화를 용이 </li><li> 850 μL / 분의 유속으로 펌프를 설정하고, 블루 컬러 DDH 2 O 주사기 바늘 밖으로 나온다 한 방울까지 시스템을 평형. </li><li> 조심스럽게 클램프 스탠드에 초원 심 분리기 튜브를 수정하고 긴 바늘에 주사기 23 G 1 관의 바닥을 관통. 관의 상부에 펌프 호스에 부착 된 바늘을 삽입하여 초원 심 분리기 튜브에 펌프를 연결하고, 직접 멸균 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 바닥에서 방울을 수집합니다. 약 425 분수 당 μL 및 그라데이션 당 12 분수의 총 금액, 일부마다 30 초를 수집합니다. 마지막 부분 (부분 12) 일반적으로 변위 DDH 2 O를 포함하고 폐기해야합니다. </li><li> 분별 한 후에, 저단계 5.1.2에서 설명한 것처럼 분석 저울을 사용하여 모든 분리 된 분획의 밀도를 asure 수. </li><li> 첫 번째 DNA의 적은 양의 강수량을위한 캐리어로 (멸균 DDH 2 O에서 20 ㎍ / μL) 1 μL 글리코겐을 추가하여 (425 μL 정도) 각 부분의 DNA를 침전. 반전으로 잘 섞는다. </li><li> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (500 ml의 총 부피에 폴리에틸렌 글리콜 6000 150g과 DDH 2 염화나트륨 O 46.8 g을 용해의 두 개의 볼륨 (850 μL)를 추가합니다. 필터, 살균 및 오토 클레이브. PEG 용액은 30입니다 % PEG 6000 1.6 M의 NaCl), 및 열 번 반전하여 다시 섞는다. </li><li> (필요한 경우 하룻밤) DNA를 침전 적어도 두 시간 동안 RT에서 튜브를 남긴다. </li><li> RT에서 30 분 동안 13,000 XG에서 침전물을 원심 분리기. 눈에 보이는 펠릿 형성한다. </li><li> 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 동일에서 원심 분리기다시 10 분의 조건. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 취소하고 15 분 동안 실온에서 펠렛을 공기 건조. </li><li> DDH 2 O 30 μL에서 건조 된 DNA 펠렛을 재용 부드럽게 튜브를 활용하여 잘 섞는다. 단계 4.3 스토어 -20 또는 -80 ° C에서 샘플을 장기 보관이 필요한 경우에 각 그라데이션 부분에있는 DNA의 양을. </li></ol></li></ol> 6. pyrosequencing 기법에 의한 DNA 특성 <ol><li> 13 C-표지 된 DNA는 약 1.720-1.735 ㎍ / ㎖의 밀도를 갖는 반면, 레이블이없는 네이티브 (12 C) DNA는 1.705 ㎍ / ㎖에서 1.720 ㎍ / ㎖의 농도 범위를 차지하고 있는지 확인합니다. 네이티브 및 환경 시료에서 추출 된 13 C-표지 된 DNA가 모두 몇 그라데이션 분수를 확장 할 수 있습니다. 빛 DNA 분수 9-11 분수 4-6과 연관 될 수있는 무거운 DNA와 연관 될 것으로 예상된다. </li><li> 하나의 &quot;컴파일&quot;대표 분수 교류를 만드는 주요 분수를 결합농도 - 해결 DNA의 특정 피크 할당으로 묶는. 대안 적으로, 이러한 구배 겔 전기 영동 (DGGE) (23)을 변성으로, 동위 원소 비율 질량 분석법 (IRMS) (22) 또는 핑거 프린팅 방법을 사용하여 분리 된 분획을 검사하는 다른 방법은 시퀀싱 전에 적절한 분획을 선택하는 것을 도울 수있다. </li><li> 각 그라데이션의 컴파일, 무거운 중간과 빛 분수에서 PCR 증폭 세균의 16S rRNA의의 유전자의 pyrosequencing 기법을 수행합니다. SIP이 방법의 혈통의 식별 및 대사 활성 박테리아 종의 상대 풍부하게 사용이 가능합니다 샘플을 배양 하였다. 다음과 같이 pyrosequencing 기법을 수행 <ol><li> 티타늄 시약 로슈 454 FLX 악기를 사용하여 앰플 리콘의 pyrosequencing 기법을 수행합니다. </li><li> 번째로 확장 (24, 25) (- - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3 5)과 Gray519r (GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5) Gray28F을 설정 융합 프라이머를 사용하여 다중에 대한 바코드 증폭 산물을 준비전자 각각의 프라이머 어댑터 A / B 및 샘플 별 다중 식별자 (MID). </li><li> 시퀀싱 라이브러리를 생성하기 위해, 핫 스타트의 Taq 중합 효소를 사용하여, 30 사이클을 가진 한 단계 PCR을 적용한다. </li><li> 공급 업체의 프로토콜에 따라 증폭 산물을 시퀀싱 및에 설명 된대로 진행 방향 (Gray28F)에서 읽어 연장 <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> . </li></ol></li></ol> 7. pyrosequencing 기법 데이터 분석 <ol><li> 원시 시퀀스가 &quot;미생물 생태에 풍부한 통찰력&quot;, QIIME 소프트웨어 파이프 라인 (26) 454 pyrosequencing 기법에 의해 생성 된 읽기 분석합니다. 다음과 같이 처리를 수행 <ol><li> 처음에는 process_sff.py 스크립트 FASTA, QUAL과 Flowgram 파일을 454 기계 생성 SFF 파일을 변환합니다. </li><li> (check_id_map.py 기준) 매핑 파일의 유효성을 검사하고 멀티 플렉스 생물 샘을 읽고 할당PLES split_libraries.py 스크립트를. 낮은 품질의 50의 슬라이딩 윈도우의 크기와 25의 평균 품질 차단 매개 변수로 끝 트림, 데이터 집합의 짧은 모호한 시퀀스 (길이 &lt;200 BP)도 제거한다. </li><li> denoise_wrapper.py를 사용하여 454 데이터를 노이즈 제거. </li><li> 다음에, 여러 OTU 피킹 방법 (pick_otus.py 97 % 서열 유사성 컷 오프 가진)를 사용하여 고품질이 작동 분류학 유닛 (OTUs)로 판독 클러스터. </li><li> pick_rep_set.py 사용하여 각 OTU의 대표 시퀀스를 선택합니다. </li><li> assign_taxonomy.py에 따라 대표 시퀀스 세트에 분류를 지정합니다. 0.80로 설정 기록 할당에 대한 최소한의 신뢰와 리보솜 데이터베이스 프로젝트 (RDP) 분류를 사용합니다. </li><li> 알고리즘 PyNast (align_seqs.py를 사용하여 prealigned Greengenes 코어 16S 시퀀스에 대해 설정을 대표하는 순서를 맞 춥니 다75 최소한의 서열 동일성 %의 집합). </li><li> 또한, identify_chimeric_seqs.py을 실행하여 추가 분석에서 키메라를 고갈. </li><li> 이전의 계통 발생 (make_phylogeny.py)를 구축하는 lanemask 템플릿 (filter_alignment.py)와 (계통 발생 추론에 유용하지 않음) 모든 간격의 위치를 제거합니다. </li><li> 마지막으로, 각 샘플 내의 박테리아 phylotypes의 발생을 설명하는, make_otu_table.py로 OTU 테이블을 생성. 세균 풍부하고 활동을 비교하기위한 히트 맵을 구성하는 OTU 테이블을 사용합니다. </li><li> 필요한 경우, 각각의 샘플 내 사이 알파 및 베타 다양성을 계산한다. 동일하게, 진공 곡선 (시퀀싱 깊이 대 다양성의 그래프) 및 ​​미생물 공동체 간의 관계를 나타내는 주 코디네이트 분석 (PCoA) 플롯도 제조 할 수있다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

대부분의 곤충의 창자는 풍부하고 복잡한 미생물 군집을 품고, 일반적으로 10 ~ 12 -10 9 원핵 세포는 대부분의 경우 호스트의 자신의 세포를 상회하는, 거기에 제기. 따라서, 곤충의 창자는 상리 공생 (27)를 의무하는 기전에서 미생물 관계의 여러 측면을 대표하는 다양한 미생물의 활동에 대한 &quot;핫 스팟&quot;입니다. 많은 연구가 곤충 장내 미생물 사회의 놀라운 다양성을 설명했지만 장내 미생물의 대사 활동의 특성은 드물다. 안정 동위 원소 프로빙 방법은 현재 재배의 독립, 심지어 생체 내에서 복잡한 미생물의 배경에서 활동중인 회원을 구분하는 가능성을 제공합니다. 우리는 곤충의 모델 시스템,면 잎 웜 (스포 도프 테라 리토 랄)의 장내 미생물을 연구하기 위해이 유용한 도구를 적용했다. 포도당면 leafworm의 창자에있는 지배적 인 설탕이기 때문에,이 데모에서 우리는 고맙다을 공급인공 사료와 VAE는 창자 식물의 대사 활성...

곤충 박테리아의 공생 협회는 곤충 종 7의 큰 숫자에 대한 알려져있다. 이러한 공생 협회에서, 미생물은 곤충의 성장과 발달에 중요한 역할을한다. 미생물은 호스트에 곤충 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 재생 1, 페로몬 생합성 3, 영양, 및 액세스 음식의 소화에 기여하는 것으로 나타났다. 장내 세균 협회의 광대 한 다양한에도 불구하고, 훨씬 적은들은 곤충에 찬성 재생 기능 역할에 대한 알려져있다. 만 흰개미의 경우에는 목질 섬유소의 공생 소화가 원핵 생물, 원생 동물, 곰팡이에 의해 수행, 널리 8,9를 공부하고 있습니다. 이와 대조적으로, 거의가 제너럴 곤충의 용기면 leafworm 즉에 존재하는 공생 관계에 대해 잘 알려져 있습니다, 스포 도프 테라는 일반적으로 인해 식물 호스트의 자신의 빈번한 이동에, 또한. 리토 랄IST 곤충과 그들의 창자 관련된 세균성 지역 사회가 영구적으로 자신의 식습관은 식물성 화학 물질의 과다로 식물을 소비에 연결된 새로운 도전에 노출되어 있습니다. 이 옆에 lepidopterans의 창자 환경은 본질적으로 높기 때문에 장내의 pH 10의 박테리아의 성장을위한 가혹한 환경을 나타냅니다. 특히 S.의 경우 리토 랄, 그것은 범위 foregut 10.5에서 중장 캘리포니아. 9 거의 7 hindgut (11)를 PH합니다. 한편, 세균성 커뮤니티 S.의 가트와 관련된 리토 랄은 간단합니다. 당나라, Freitak, 등. (12)는이 곤충과 관련된 세균성 지역 사회의 구성원 만 아니라 7 개의 다른 박테리아 종의 총에 속하는 36 phylotypes 최대를보고했다. 이 외에도, 복잡한 양육 절차는 실험실에서 곤충 성장을 위해 필요하지 않습니다. 또한, 이것과 곤충의 짧은 수명주기가 다 g 용이enerational 연구, 창자 - 미생물 상호 작용 연구를위한 이상적인 모델 시스템에이 종을 선회. PCR 기반 시퀀싱 기술의 출현으로, 몇개의 미생물 (즉, 인간, 곤충이나 해양 생물)의 가트 생물상 다루는 연구의 수는 증가하고있다. 더욱이, 결과는 과거뿐만 고립과 가트 숨겨 세균 배양으로부터 독립적이다. 박테리아의 약 99 %는 경작되지 않고 장내에서 일반적인 환경 조건의 시뮬레이션은 12 어렵다. PCR을 이용하여 16S rRNA 유전자 단편 (세균 가운데 널리 계통 유전자 마커) 선택적 서열화 가트 세균 공동체의 혼합 DNA 템플릿에서 증폭 및 복제 될 수있다. 이 정보를 통해, 사용자는 공개 13,14 데이터베이스로부터 서열 정보를 검색 한 후 종의 박테리아를 식별 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 순서는 박테리아를 설명하는 접근사회 인해 지역 사회 내의 개별 종의 고유 대사 공헌에 대한 정보의 부족으로 충분한 남아있다. 안정 동위 원소 (SIP)를 프로빙 유망 문화가없는 기술이다. 그것은 종종 특정 신진 대사 활동에 링크 된 미생물의 계통 발생을 분석하는 환경 미생물학에서 사용된다. 이는 같은 인지질 유래 지방산, DNA 및 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적하여 달성된다. 핵산을 고려하면, 방법론은 밀도 구배 초 원심 분리 (6)에 의해 비 표지 DNA의 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA의 분리에 기초한다. 때문에 DNA 라벨과 신진 대사 활동 사이의 직접 연결로, 핵산의 하류 분자 분석은 종을 식별하고 신진 대사 활동에 대한 정보를 제공합니다. 또한, DNA-SIP와 pyrosequencing 기법의 조합에 의해 적용되는Pilloni 폰 쩌르 교수, 등. (15)는 무거운 13 C-표지 된 DNA 분획에 존재하는 세균 종의 특정 간단하고 민감한 식별을 허용합니다. 지금까지이 기술은 호기성 및 혐기성 조건 16, 17, 18, ​​19에서 토양 생지 화학 과정에 포함 된 세균의 지역 사회를 설명하기 위해 적용되었습니다. 난소 화성 탄수화물에 대한 응답으로 인간의 장내 미생물의 서로 다른 계통 발생 그룹의 신진 대사 활동을 설명 Reichardt, 등. 5에 의해보고 된 환경 과학에서의 사용 외에,이 기술은 의료 과학에 적용되었습니다. 여기에서 우리는 창자의 대사 활성 박테리아 종의 DNA &#39;라벨&#39;에 13 C-포도당을 사용합니다. 포도당은 예외가 20 알려져 있지만, 광범위한 엔트 - Doudoroff (ED) 경로를 따라 대부분의 세균 종에 의해 이용 당합니다. 이또한 대사 확립 경로를 따라 탄소원 간의 링크를 제공 신뢰성 대사 프로브로서 13 C-글루코스 사용을 정당화한다. 과학적 질문에, 다른 기판, 즉 13 C-메탄, 13 CO 2, 13 CO 2 분위기하에 발생 식물에 따라 대사 활동을 해결하는데 사용될 수있다. 이 시점에서, 우리는 제너럴 곤충, 즉 S.의 장내 세균 공동체의 대사 특성에 적용되는 프로토콜을 제시한다 리토 랄 (나비목, Noctuidae). 또한, 기술은 다시 높은 해상도와 정밀도를 가진 곤충 장내 세균 공동체의 식별을 허용 pyrosequencing 기법에 결합했다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스는 실험 동안 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 미러 마감 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>속도 진공 집중 장치 5301</td><td>Eppendorf Germany</td><td>5305 000.304</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스틱 유봉</td><td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td><td>P986.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NanoVue 분광 광도계</td><td>GE HealthCare, UK</td><td>28-9569-58</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mastercycler pro/thermocycler</td><td>Eppendorf Germany</td><td>6321 000.515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agagel 표준 수평 젤 전기영동 챔버</td><td>Biometra</td><td>단종</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>초원심분리기 (Optima L-90K)</td><td>Beckman</td><td>A20684</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>초원심분리기 로터 (NVT 90)</td><td>Beckman</td><td>362752</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC 펌프</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>퀵-씰, 폴리알로머 튜브</td><td>Beckman</td><td>342412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트랜스일루미네이터 UVstar 15&nbsp;</td><td>바이옴트라</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; dna 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; c-포도당

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

대부분의 곤충의 내장은 공생 비병원성 박테리아의 복잡한 사회에서 살고있다. 이러한 미생물 지역 사회 내에서 그것은 공생이나 공생 박테리아 종을 식별 할 수 있습니다. 후자의 것, 즉 다른 사람의 사이에서, 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 면역 반응 2, 페로몬 생산 3,뿐만 아니라 영양을 증폭, 곤충 재생 1 도움, 곤충에 여러 기능을 제공하는 것으로 관찰되었다. 때문에 이러한 연결의 중요성에 많은 노력이 개별 구성원에 이르기까지 지역 사회의 특성을되었습니다. 그러나, 이러한 노력의 대부분은 하나 재배 방법에 근거하거나 최종 식별 서열화 된 16S rRNA 유전자 단편의 생성에 의존 하였다. 불행히도, 이러한 방법은 장내에 존재하는 세균 종을 파악하고 더 INFORMAT을 제공하지미생물의 대사 활동에 이온. 곤충의 창자의 대사 활성 세균 종의 특성을 위해, 우리는 보편적 인 기질로 13 C-포도당을 이용한 생체 내 (SIP)를 프로빙 안정 동위 원소를 사용했습니다. 이것은 그들의 특정 신진 대사 활동에 미생물 계통의 결합을 할 수있는 유망한 문화가없는 기술이다. 이는 DNA와 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적 가능합니다. DNA가 비 표지 (12 C)에 비해 한 표지 DNA의 밀도를 증가시킨다 (13)에 C의 혼입 동위 원소. 결국, 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA는 12 C-레이블이없는 유사 하나 6에서 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 분리된다. 분리 된 핵산 분자 동위 원소의 후속 분석 종의 대사 활동 및 ID 사이의 연결을 제공한다. 여기에서, 우리는 제너럴 곤충 (우리의 모델 시스템), 스포 도프 테라 리토 랄 (나비목, Noctuidae)의 창자에있는 대사 활성 박테리아의 특성을하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. DNA의 계통 발생 학적 분석은 곤충 장내 세균 공동체의 식별에 높은 해상도와 정밀도를 허용 pyrosequencing 기법을 사용하여 수행 하였다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스가 실험에 사용 하였다. 기판은 인공 사료를 사용하여 곤충에 공급 하였다.

곤충 장내 본 대사 활성 균의 충분한 표시를 달성하기 위해, 곤충 한 비 표지 라이터로부터 용이하게 표지 된 중질 분획의 분리를 허용하기에 충분한 미리 최적화 동안 13 C가 풍부한 기판에 노출되어야한다. 우리의 경우는, 13 C-글루코스는 일일 (도 1a)에 대한 10 mM의 최종 농도 인공 사료에 첨가 하였다. 정상 글루코스 (도 1b)의 동일 량을 제어 곤충의 인공 사료에 공급 하였다. 전술 한 바와 같이, (라이터에서 울트라) DNA 분획의 분리는 전체 과정의 기초이다. 따라서, 수행되는 첫 번째 단계는 또한 조직으로부터 DNA를 추출이며,이 경우, 세균 여행자는 곤충 가트와 연관​​된. 품질을 확인하기 위해이 모든에서 모든 DNA는 물리 - 화학적 인 매개 변수의 분석에서 얻은 여부를 확인하기 위해 전기 영동 젤을 실행하는 것이 중요합니다제드 자형의 조직. 도 1C에서, 긍정적 DNA 추출...

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

다음 실험의 전반적인 목표는 곤충의 장내에 존재하는 대사 활성 박테리아를 계통 유전학적으로 특성화하는 데 사용되는 효율적인 방법론을 상세히 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 곤충에게 C 13 표지 포도당을 먹여 장내 대사 활성 박테리아의 DNA를 동위원소로 농축시킵니다. 다음 단계는 장내에 존재하는 박테리아 군집의 DNA를 추출하는 것입니다.세 번째 단계는 C 13을 통합한 대사 활성 종의 DNA를 분리하는 것입니다. 그런 다음 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)을 통해 해당 DNA의 계통 발생학적 정체를 확인하고 존재하는 종의 양을 정량화합니다. 이를 통해 곤충 장내에 존재하는 군집을 구성하는 대사 활성 박테리아 종을 식별할 수 있습니다.다세포 생물의 장은 미생물의 대사 능력을 이용하여 복잡한 유기물을 용해 또는 가용화함으로써, 최종적으로 곤충 숙주의 영양분으로 활용할 수 있게 하는 정교한 발명품입니다. 이 시스템을 이해하려면, 우선 어떤 미생물이 존재하는지 분석해야 하며, 둘째로 어떤 미생물이 어떤 대사 활동을 하는지 분석해야 합니다. 이러한 데이터를 확보하면, 분해 미생물과 곤충 숙주 사이의 대사산물 및 분해 산물의 흐름을 재구성할 수 있습니다.이 방법은 미생물 생태학 분야의 핵심 질문, 특히 이러한 미생물이 숙주와 상호작용하는 방식에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 그런 의미에서 우리는 이러한 유기체들이 숙주를 위해 어떤 기능을 수행하는지 더 많이 알고 이를 명확히 정의할 수 있습니다. 또한 이 방법은 일반적인 활성 장내 세균에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.글루코스의 경로를 추적하는 것과 마찬가지로, 셀룰로스를 표지하여 해당 영양분의 소화 과정에 관여하는 활성 박테리아를 식별하는 등 다른 탄소원에 대해서도 동일한 실험을 수행할 수 있습니다. 배양 용기, 알 및 페트리 접시는 부화할 때까지 상온에서 유지합니다. 그 후, 갓 부화한 유충을 깨끗한 플라스틱 상자로 옮기고 16시간의 명기과 8시간의 암기로 구성된 장일 조건 하에 23~25 °C에서 인공 사료로 사육합니다. 며칠 후, 사육 상자에서 건강한 2령 유충 9~15마리를 선택하여 신선한 C 13 glucose가 담긴 개별 페트리 접시로 옮깁니다.첨가물이 포함된 인공 사료의 경우, 처리군당 유충 3마리씩 최소 3회 반복 실험이 필요합니다. 대조군 급여를 위해서는 목화와 같은 천연 먹이원과 동일한 양의 천연 포도당을 제공하는 인공 사료를 사용하십시오. 이후 24시간 동안 진행합니다.인공 사료를 자주 교체하십시오. 먼저 부드러운 핀셋을 사용하여 유충을 증류수 웅덩이로 옮겨 큰 이물질을 제거합니다. 그 다음, 곤충을 마취시키고 살처분하기 위해 깨끗한 새 접시로 옮깁니다.샘플을 얼음에 놓은 다음, 쿨러를 이용하여 온도를 -5 °C로 낮춥니다. 그 후 죽은 곤충을 70% ethanol로 소독하고 해부를 위해 PBS에 담급니다. 도구 또한 70% ethanol로 세척해야 합니다.우측과 좌측의 큐티클을 따라 절개하며 시작합니다. 머리 부분에서 시작하여 항문 부분에서 마칩니다. 외골격 전체와 말피기관, 지방체를 제거합니다.그런 다음 장을 개봉하기 전, 다른 조직으로부터 분리한 장과 함께 버퍼를 교체합니다. 과학적 질문에 따라 장 전체 또는 전장(midgut)이나 후장(hind gut) 부위를 처리합니다.PBS 없이 장 조직을 작은 멸균 튜브로 옮겨 냉동고에 보관하십시오. DNA 추출 전, 조직의 크기에 따라 진공 농축기를 사용하여 45 °C에서 30분에서 90분 동안 샘플을 건조시키십시오. 그다음, 멸균 플라스틱 페스틀(pestle)을 사용하여 건조된 조직을 분쇄한 후, 토양 DNA 추출 키트를 이용하여 게놈 DNA를 추출하십시오.그 다음, 분광광도계를 사용하여 최종 용출된 DNA의 농도를 측정합니다. 박테리아 범용 프라이머인 27 F와 1, 492 R을 이용한 진단 PCR 분석을 수행하여 곤충 장내 미생물 메타게놈 DNA가 성공적으로 추출되었는지 확인합니다. 진단을 위해, 각 PCR 생성물 5 µL를 1% agarose 겔에 로딩하고 300 V, 115 mA 조건에서 약 20분 동안 전기영동을 실시합니다.증폭산물의 정확한 크기는 1.5 kilobases입니다. 각 실험 반복구에 해당하는 추출된 DNA를 한데 모으십시오. 이때 C 13 glucose가 포함된 시료와 포함되지 않은 시료를 구분하여 보관하십시오.각 샘플이 풀(pool)에 동일하게 기여할 수 있도록 DNA 농도를 정규화합니다. 초원심분리 공정에는 500에서 5,000 nanograms의 최종 DNA 농도가 적절합니다. 멸균된 15 milliliter 스크류 캡 튜브에서 분광광도계를 사용하여 예상 농도를 다시 한번 확인하십시오.구배 배지를 준비합니다. 정량된 DNA를 4.8 milliliters의 cesium chloride 용액과 혼합합니다. 그 다음 구배 버퍼 6 milliliters를 추가하여 최종 부피를 맞춥니다.혼합물을 5.1 milliliter 초원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 주사기와 바늘을 사용하여 튜브의 목 하단까지 채우고, 펌핑하거나 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 매 가동 시 DNA가 포함되지 않은 블랭크 구배(blank gradient)를 최소 하나 이상 포함하십시오.기준 구배(reference gradient)로 사용하기 위해, 튜브 쌍을 선택하고 10 mg 이내의 오차로 무게를 맞춥니다. 각 튜브에 튜브 캡(tube topper)을 씌우고, 튜브를 뒤집어 손으로 적당한 압력을 가함으로써 누수가 없는지 확인합니다. 8개의 웰이 있는 수직에 가까운 로터를 사용하십시오.로터 웰을 조심스럽게 밀봉하고 제조사의 지침에 따라 초원심분리기에 로터를 장착하십시오. 진공 상태의 20 °C에서 50,000 RPM으로 40시간 동안 원심분리하여 DNA를 침전시킵니다. 가속도는 최대값으로 설정하고, 감속은 브레이크 없이 설정하십시오.이틀 후, 포셉을 사용하여 원심분리기 로터에서 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 형성된 밀도 구배가 흐트러지지 않도록 튜브를 랙에 세우고 즉시 처리합니다. 먼저 850 µL/min의 유속으로 HPLC를 평형화합니다.그 다음 초원심분리관을 클램프 스탠드에 고정하고, 주사기에 연결된 23 gauge 1인치 바늘로 튜브 바닥을 뚫습니다. 농도 구배와 형태가 흐트러지는 것을 방지하기 위해 컨트롤 미너(control miner)로 튜브 상단을 조심스럽게 뚫으며, 성공적인 PSA 이동을 위해 사전에 충분히 연습하십시오. 다음으로, 펌프 튜브가 연결된 바늘을 액체가 없는 튜브 상단에 삽입하고, 바닥에서 떨어지는 방울을 멸균된 1.5 milliliter Micro fuge 튜브에 직접 수집합니다. 30초마다 한 분획씩 수집하며, 분획당 425 µL씩 수집하십시오.본 예시에서는 각 구배(gradient)로부터 12개의 분획을 수집합니다. 다음으로, 분석 저울을 사용하여 분리된 각 분획의 밀도를 측정합니다. 24시간 동안 텍스트 프로토콜을 참조하여 DNA 회수 및 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)을 진행하십시오.10 millimolar C 13 glucose를 ssop liters.Larva의 식단에 첨가하였습니다. 대조군 곤충의 먹이에는 동일한 양의 일반 glucose를 추가하였습니다. 그 다음, 곤충 장내 박테리아 군집으로부터 DNA를 추출하였습니다.전기영동 젤 상단에서 강한 genomic DNA 밴드가 확인되어 DNA 추출과 진단 PCR이 성공적으로 수행되었음을 입증하였습니다. 박테리아 범용 프라이머를 사용한 결과 박테리아 DNA의 존재가 확인되었으며, 종 계통 및 상대적 풍부도를 밝히기 위해 대표적인 SIP 구배 시료에 대해 정량적 pyro sequencing을 직접 수행하였습니다. 평균 길이 404 OTs로 총 120,045개의 고품질 리드가 생성되었습니다.파이로 시퀀싱 프로파일 결과, 대조군과 비교하여 표지된 시료에서 enterococcus 및 panto를 포함한 특정 종의 풍부도가 증가한 것으로 나타났습니다. 따라서 이 박테리아들은 대사적으로 활성 상태인 것으로 간주되며 추가 연구 가치가 있습니다. 그러므로 이 절차를 수행할 때는 CYP 분석 시 적절한 대조군을 포함시키는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.따라서 배경의 영향과 헤어 플래시(hair flash) 내의 오염을 제거함으로써, 박테리아의 다양성과 풍부도의 변화(출현 또는 소실)가 시료 자체의 인위적인 결과가 아님을 보장할 수 있습니다. 추가적인 질문에 답하기 위해 이 절차나 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization)과 같은 방법론을 사용할 수 있습니다. 이 경우 곤충의 장 내에서 박테리아의 위치와 배열을 확인하게 됩니다.

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Biology

생물학

DNA 안정 - 동위 원소 탐색 특정 기판을 활용 능력이 미생물의 활성 커뮤니티를 식별하고 특징을 재배 독립 방법입니다. 무거운 동위 원소의 농축 기판의 동화는 미생물 바이오 매스로 분류 원자의 결합에 이르게한다. 밀도 기울기 ultracentrifugation은 하류 분자 분석을위한 DNA 라벨을 검색합니다.

DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어...

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

이 문서는 Bemisia tabaci 루프 중재 등온 증폭 (램프) 기술 기반에 대 한 빠른 식별 분석 결과 대 한 프로토콜을 보고 합니다. 프로토콜은 최소한의 실험실 훈련이 필요 하 고 따라서, 항구, 공항 등 식물 수입에 대 한 항목의 지점에서 현장 구현 될 수 있습니다.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)

도끼 곤충을 얻기 위해 달걀 표면을 살균하고 부화 한 유충은 도끼 잎을 사용하여 사육됩니다. 이 방법은 항생제를 투여하거나 다른 잎을 먹는 곤충에도 적용 할 수있는 인공 식단을 개발하지 않고도 축산 곤충 준비를위한 효율적인 방법을 제공합니다.

잎 딱정벌레의 숙주 - 장 microbiota 상호 작용 연구를위한 조직 배양 묘목으로 축 곤충 준비 및 사육

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여기에서는 MIP-FISH(mid-infrared photothermal-FISH)라고도 하는 광학 광열 적외선 형광 in situ hybridization(OPTIR-FISH)을 사용하여 개별 세포를 식별하고 세포의 신진대사를 이해하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 single-cell resolution으로 세포 대사를 매핑하는 것을 포함하여 다양한 응용 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

배우세요 Spodoptera littoralis의 장내 대사 활성 박테리아를 안정 동위원소 프로빙과 파이로시퀀싱으로 식별하는 방법입니다. 이 기술은 미생물 생태학 및 곤충 생리학 연구에 활용됩니다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별

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