제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별 스포 도프 테라 리토 랄 DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙 ¹³ C-포도당

다음 실험의 전반적인 목표는 곤충의 장에서 대사 활성 박테리아를 유전적으로 특성화하는 데 사용되는 효율적인 방법론을 자세히 설명하는 것입니다. 이는 먼저 C 13 표지 포도당을 곤충에게 공급하여 장에서 대사 활성 박테리아의 DNA를 동위원소로 농축함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 장에 존재하는 박테리아 군집의 DNA를 추출

세 번째 단계는 C 13을 통합한 대사 활성 종의 DNA를 분리하는 것입니다. 그런 다음 DNA는 파이로 염기서열분석에 의해 존재하는 종에 대해 계통 발생학적으로 식별되고 정량화됩니다. 따라서 곤충의 장에 존재하는 군집을 구성하는 대사 활성 박테리아 종을 식별합니다.

따라서 다세포 유기체의 장은 미생물의 대사 능력을 이용하여 복잡한 유기물을 분해하거나 용해시켜 최종적으로 곤충 숙주의 영양분 역할을 할 수 있도록 하는 독창적인 발명품입니다. 이 시스템을 이해하기 위해서는 먼저 누가 밖에 있는지 분석해야 하고, 두 번째로 누가 어떤 대사 활동을 하고 있는지 분석해야 합니다. 이러한 데이터가 있으면 분해 미생물과 곤충 숙주 사이의 대사 산물과 분해 산물의 흐름을 재구성할 수 있습니다.

이 방법은 미생물 생태학 분야의 주요 질문, 특히 이러한 미생물이 숙주와 상호 작용하는 방식에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 그런 의미에서 우리는 더 많은 것을 알 수 있고, 이 유기체들이 숙주를 위해 어떤 기능을 하고 있는지 명확히 하고 정의할 수 있다. 이 방법은 일반적인 활성 장내 세균에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

ucle glucose를 추적함으로써 ocrant 영양소의 소화 과정에 관여하는 활성 박테리아를 식별하기 위해 cellose를 라벨링하는 것과 같은 다른 탄소원에도 수행할 수 있습니다. op liters, egges 및 Petri 접시를 유지하고 부화할 때까지 실온을 추가합니다. 그런 다음 새로 부화한 유충을 깨끗한 플라스틱 상자에 옮겨 넣고 섭씨 23-25도의 인공 식단으로 사육한 다음 16시간의 조명과 8시간의 어둠이 있는 긴 하루 동안 사육 상자에서 9-15마리의 건강한 두 번째 인스타 유충을 사육 상자에서 신선한 C 13 포도당이 들어 있는 개별 페트리 접시로 옮깁니다.

스파이크 인공 식단, 치료당 각각 3마리의 유충을 최소 3회 복제해야 합니다. 대조군을 먹이기 위해 목화와 같은 천연 식품 공급원과 동일한 양의 천연 포도당을 제공하는 인공 식단을 사용하십시오. 앞으로 24시간 동안.

인공 식단을 자주 갱신하십시오. 큰 파편을 제거하기 위해 부드러운 집게로 유충을 증류수 웅덩이로 옮기는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 곤충을 마취하고 죽이기 위해 새 깨끗한 접시로 옮깁니다.

얼음 위에 올려 놓고 쿨러에서 온도를 섭씨 영하 5도로 떨어뜨립니다. 그런 다음 죽은 곤충을 70% 에탄올로 소독하고 PBS에 담가 해부합니다. 도구도 70% 에탄올로 세척해야 합니다.

오른쪽과 왼쪽을 따라 큐티클을 절개하는 것부터 시작합니다. 머리에서 시작하여 항문에서 끝냅니다. 외골격 전체, 말리안 세뇨관 및 지방체를 제거합니다.

그런 다음 장을 열기 전에 완충액을 다른 조직에서 분리된 장으로 교체하십시오. 장 전체 또는 장, 중장 또는 뒷장 부분을 처리합니다. 과학적 질문에 따라 다릅니다.

PBS가 없는 장 조직을 작은 멸균 튜브에 옮겨 냉동실에 보관합니다. DNA를 추출하기 전에 조직의 크기에 따라 진공 농축기 장치에서 섭씨 45도에서 30-90분 동안 샘플을 건조합니다. 다음으로, 멸균 플라스틱 Pele를 사용하여 건조된 조직을 분쇄하고 토양 DNA 추출용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.

그런 다음 분광 광도계를 사용하여 최종 회피된 DNA의 농도를 측정합니다. 박테리아 일반 프라이머 27 F 및 1, 492 R.진단을 사용하여 진단용 PCR 분석을 준비하여 곤충 내장에서 미생물 메타유전체 DNA의 성공적인 추출을 확인합니다. 300볼트 및 115밀리암페어에서 1% 그로스 젤에 각 PCR 제품 5마이크로리터를 약 20분 동안 실행합니다.

앰플리콘의 정확한 크기는 1.5킬로베이스입니다. 각 실험 복제에 해당하는 추출된 DNA를 함께 당깁니다. C 13 포도당이 있는 사람과 없는 사람을 분리하여 유지합니다.

DNA 농도를 정규화하여 각 샘플이 풀에 동일하게 기여하도록 합니다. 500에서 5의 DNA의 000 nanogram의 마지막 농도는 ultracentrifugation 과정을 위해 적당합니다. 멸균 15ml 나사 캡 튜브에 있는 분광 광도계로 예상 농도를 다시 확인하십시오.

그라디언트 매체를 설정합니다. 정량화된 DNA를 4.8ml의 염화세슘 용액과 결합합니다. 그런 다음 6ml의 그라디언트 버퍼로 볼륨을 마무리합니다.

혼합물을 5.1ml 초원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 주사기와 바늘을 사용하여 튜브를 목 아래까지 채우고 펌프질하거나 기포가 형성되지 않도록 합니다. 각 실행에 DNA가 없는 blank gradient를 하나 이상 포함합니다.

참조 그래디언트로 작용하려면 한 쌍의 튜브를 선택하고 10mg 이내로 균형을 맞춥니다. 각 튜브에 튜브 토퍼를 바르고 튜브를 뒤집고 손으로 적당한 압력을 가하여 누출이 없는지 확인합니다. 8개의 웰이 있는 거의 수직 로터를 사용하십시오.

로터 웰을 조심스럽게 밀봉하고 제조업체의 지침에 따라 로터를 초원심분리기에 로드합니다. DNA를 섭씨 20도에서 50, 000RPM으로 40시간 동안 진공 상태에서 회전시킵니다. 최대 가속과 제동 없는 감속을 선택합니다.

이틀 후, 집게를 사용하여 원심분리기 로터에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 형성된 기울기를 방해하지 않고 랙에 넣고 튜브를 즉시 처리하십시오. 먼저 분당 850마이크로리터의 유속을 사용하여 HPLC를 평형화합니다.

그런 다음 초원심분리기 튜브를 클램프 스탠드에 부착하고 주사기에 부착된 23게이지 1인치 바늘로 튜브 바닥을 뚫습니다. 따라서 성공적인 PSA 동작을 보장하기 위해 사전에 형태, 기울기 및 연습을 방해하지 않도록 제어 광부로 튜브 상단을 조심스럽게 뚫습니다. 다음으로, 펌프 튜브에 부착된 바늘을 유체가 없는 튜브 상단에 삽입하고 바닥에서 직접 방울을 모아 멸균 1.5밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 직접 방울을 모으고 분획당 425마이크로리터에 대해 30초마다 분획을 수집합니다.

이 예에서는 각 그래디언트에서 12개의 분수가 수집됩니다. 다음으로, 분석 저울에서 분리된 각 분획의 밀도를 측정합니다. DNA 회수 및 파이로 염기서열분석을 24시간 동안 텍스트 프로토콜과 상의하여 진행합니다.

10 밀리몰 C 13 포도당은 솝 리터의 식단에 보충되었다. 유충. 동일한 양의 정상 포도당을 대조 곤충의 먹이에 첨가했습니다. 다음으로 곤충 내장의 박테리아 군집으로부터 DNA를 추출하였다.

전기영동 겔에서 상단에 있는 강력한 게놈 DNA 띠는 성공적인 DNA 추출, 즉 진단용 PCR을 확인했습니다. 박테리아 범용 프라이머를 사용하여 박테리아 DNA의 존재를 보여주고, 대표적인 SIP 구배에서 정량적 파이로 염기서열분석을 직접 수행하여 종 계통과 상대적 풍부도를 밝혔습니다. 총 120,045개의 고품질 판독이 생성되었으며 평균 길이는 404OT였습니다.

파이로 염기서열분석 프로파일은 대조군에 비해 라벨링된 샘플에서 엔테로코커스(enterococcus)와 판토(panto)를 포함한 특정 종의 풍부함이 증가한 것으로 나타났습니다. 따라서 이러한 박테리아는 신진대사 활동이 활발한 것으로 간주되며 추가 연구가 필요합니다. 따라서 이 절차를 시도하는 동안 CYP 분석에 적절한 통제를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 배경의 영향을 빼면 머리카락 섬광의 오염이 번쩍이고 나타나거나 사라지는 박테리아의 다양성과 풍부함이 덩어리 자체의 인공물이 아님을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 따르거나 형광 현장 혼성화와 같은 방법론을 사용하여 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 경우 곤충의 내장 내부에 있는 박테리아의 위치와 배열을 돌볼 것입니다.