Name: 미세 주입 상처 분석 및 생체 내 표피의 현지화는 응답 기자의 상처 초파리 태아. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아의 생체 내 표피 상처 반응을 시각화하는 미세 주입 방법을 통해 유전자 발현을 실시간으로 분석하는 기술입니다. 이 방법은 조직 재생 연구에 활용됩니다.

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이 프로토콜은 McGinnis 연구소, 김 A. 메이스와 조셉 C. 피어슨의 이전 멤버와 공동으로 개발되었습니다. 우리는 가치있는 주식을 정리하고 배포 할 수있는 자신의 작품에 대한 블루밍턴 초파리 증권 센터의 지속적인 노력에 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM077197 및 K12 GM68524)과 허버트 스턴의 가족에서 자금에 의해 지원되었다. MTJ는 현재 소수 민족 건강과 건강 불균형에있는 국립 연구소의 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 번호 8G12MD7603-27에서 부여 번호 5G12RR003060-26에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 소수 민족 건강과 건강 격차 또는 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

Drosophila의 배아 상처 프로토콜은 다섯 단계로 요약 될 수있다 : (1) 배아 컬렉션, (2) 배아 준비 (3) 배아 부상, (4) 배아 미세 주입하고, (5) 배아 고정. 1. 배아 컬렉션 <ol><li> 성인 파리를 수집 2~3일 eclosing 후 배아 수집 케이지에 50 명의 여성과 25 명의 남성을 추가합니다. </li><li> 3 일 동안 매일 아침 신선한 사과 주스 한천 플러스 효모 판을 놓습니다. 주 : 25 ° C 배양기에서 12 시간 낮의 일정에 최적의 배아 수집, 사이클 파리 (17:00 빛 &quot;OFF&quot;, &quot;ON&quot;5시 등), 여성 파리는 빛 사이클의 변화에​​ 대응하고 빛을 &quot;OFF&quot;, 11 &quot;ON&quot;등의 스위치 중에 계란의 큰 수량을 입금합니다. </li><li> 일 - 3 일 오후, 케이지에 신선한 사과 주스 플러스 효모 한천 플레이트를 배치하고 2 시간 동안 배아를 수집합니다. 새장에 새 효모 판을 놓고 저장2 시간 수집 판. </li><li> 배아를 나이에 25 ° C에서 추가로 14 시간 동안 수집 판을 보관합니다. 주의 사항 : 상처 치유는 초파리를 개발하는 동안 모든 단계에서 정량 할 수 있으며,이 문서에 설명 된 상처에 의한 전사 기자는 단계 12월 15일에서 16일까지 사이의 최적의 활성을 갖는다. 말기 (17)에 의해, 배아 쉽게 성숙 표피를 관통하고 효율적으로 상처 기자를 활성화하거나 상처에 의한 전사를 감지 너무 오래. 수집 시간과 상처를 입기 시간이 피크 랩 시간 동안 발생할 수 있도록하기 위해, 우리는 18시 새 접시와 컬렉션 플레이트를 교환, 2 시간 (16시부터 18시까지)에 대한 배아 컬렉션의 스케줄을 따라 세 14 시간 (야간) 25 ° C에서 컬렉션 플레이트, 그리고 (다음 날) 08:00 배아를 상처. </li></ol> 2. 배아 준비 참고 :이 프로토콜은 날카로운 또는 G 만든 다양한 도구와 개체의 사용을 포함아가씨. 부상을 방지하기 위해주의 모든 날카로운 유리 개체를 처리 할 수​​ 있습니다. <ol><li> 조심스럽게 접시와 소용돌이에 2 ~ 3 ㎖의 물을 추가하여 붓 수집 플레이트에서 배아를 제거합니다. 나일론 메쉬 및 수집 관에 접시에서 물과 배아를 전송합니다. </li><li> 플라스틱 페트리 접시 접시의 뚜껑에 표백제의 4 ~ 5 mL를 넣고 2 분 동안 표백의 배아를 포함하는 수집 관의 메쉬 커버 끝 흡수, 태아의 외부 껍질을 제거합니다. 수동으로 수집 관에게 표백제의 응집에서 배아를 방지하기 위해 몇 번 회전합니다. 물 배와 배아를 씻어 종이 타월에 dechorionated 배아를 포함하는 메쉬 커버 포집 관을 건조. </li><li> 한천 플레이트에 나일론 메쉬에서 ~ 50 배아를 전송하는 해부 바늘을 사용합니다. 우리는 배아의 정렬에 대비 및 지원을 추가 할 한천 플레이트에 녹색 식용 색소를 추가합니다. 해부 현미경, 엠브리 정렬 ~ 25 배아의 두 개의 병렬 행을슬라이드 OS가 마이크로 인젝션 장치에 천자 바늘에 대하여 직각이되도록. 가스 교환을 목적으로 배아 사이에 약간의 공간 (약 1 배아의 길이)를 둡니다. 두 개의 병렬 행이 떨어져 대략 5 mm 이상이어야한다. </li><li> 정렬 된 배아의 상단에 두 배 지팡이 테이프와 슬라이드를 놓고 조심스럽게 슬라이드에 그린 접시에서 배아를 전송하는 슬라이드를 누릅니다. 그런 다음 공기 배아를 건조 ~ 25 분 배아에서 내부 압력을 감소시키고 상처를 입는 경우 버스트를 방지합니다. </li><li> 더 탈수를 방지하기 위해 배아에 할로 카본 오일 혼합의 2 ~ 3 방울을 넣습니다. </li></ol> 3. 배아 부상 <ol><li> 주사 현미경 단계에있는 배아 슬라이드를 놓습니다. 보기의 분야에서 배아를 찾아 거꾸로 현미경의 무대를 이동 연습. 참고 : 바늘을 사용하기 전에, dorsoventral 축을 따라 배아의 중간면에 초점을 맞 춥니 다. 효율적으로 상처를 입기을 허용하기 위해정렬 된 배아는 가까이 바늘 장치에 행을 부상 시작합니다. 보기의 필드에 정렬 된 배아의 행의 상단을 가지고 무대를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 배치하고 바늘 홀더에서 뽑아 바늘을 고정합니다. 슬라이드를 향해 아래로 바늘을 이동하는 미세 조작기를 사용합니다. 같은 초점면에서, 배아와 바늘을 맞 춥니 다. 바늘이 배아에 초점되면, 미세 조작기로 바늘을 이동하지 않습니다. </li><li> 다음 행의 다음 배아로 이동을 통해 통해 배아를 천공 단계를 이동합니다. 첫 번째 행을 부상 할 때, 슬라이드를 이동하기 전에 단계로부터 멀리 완​​전히 바늘을 이동하는 미세 조작기를 사용하여, 수동으로 슬라이드를 180 ° 회전하고 두 번째 행 상처. </li><li> 실온에서 할로 카본 오일에서 배아를 저장하고 배아 고정 진행 현장 하이브리드 또는 항체 염색에서하고있는 경우 (절차의 단계 5 참조). 또한, 4 ~ 6 시​​간 동안 배아를 저장할로 카본 오일에서와 상처 전사 형광 기자 시각화 (대표 결과)를 진행합니다. 참고 : 형광 기자의 시각화를 위해, 우리는 50 % 1 - 페녹시 -2 - 프로판올 (13)를 사용하여 배아를 마취. 배아는 할로 카본 오일에서 제거하고 새 슬라이드에 배치됩니다. 우리는 배아의 주위에 유리 구슬을 배치 마취 몇 방울을 추가하고, 배아에 커버 슬립을 배치합니다. </li></ol> 4. 배아 미세 주입 주 : 우리가 프로토콜에서 사용하는 미세 주입 장치는 분석 기간 동안 특정 볼륨을 제공하는 자동화되지 않습니다. 우리는 미세 주입을 시각화하고 전달 볼륨을 정상화하려고 솔루션에 염료를 추가합니다. 너무 많은 솔루션이 배아에 주입되는 경우, 난황 막 파열 것이다. <ol><li> 화학 용액 플러스 염료의 1 μL와 후면에서로드 바늘 (예 : 0.6 MH 2 O 2). 모세 혈관이 허용바늘의 끝 부분에 화학 용액을 그리는 작업입니다. </li><li> 바늘을 중단하려면 슬라이드 코트 할로 카본 오일 믹스 가장자리에 각도로 커버 슬립을 배치합니다. 각진 커버 슬립의 가장자리에 초점에 장착 된 바늘을 가지고 부드럽게 깨진 때까지 바늘의 끝을 가로 질러 커버 슬립의 가장자리로 이동합니다. 미세 주입 장치에 압력을 적용하고 화학 용액 플러스 염료 바늘을 유출되어 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 단계에 맞춰 배아를 포함하는 슬라이드를 놓습니다. 동일 평면에있는 배아와 바늘에 초점을 진행합니다. 동시에 찔린 microinject 화학 솔루션 플러스 각 배아로 염색. 참고 : 막힌 바늘 자주 발생, 불완전 미세 주입을 방지하기 위해 새로운 바늘을 휴식. 무딘 바늘 끝은 깔끔 각도 바늘 끝과 같은 상처를하지 않습니다. 파손하는 동안 비 90 ° 각도로 커버 슬립을 조정하면 각도 바늘 끝을 생산하기에 최적입니다. </li></ol> 5. 포름 알데히드 인터넷xation 참고 :이 초파리의 고정에 사용되는 화학 물질은 유해하다. 화학 약품을 처리하는 개인 보호 장비 (예 : 장갑, 실험복, 안전 고글)를 사용합니다. 규제 화학 물질의 처분을 위해 개별 기관의 지침을 따르십시오. <ol><li> 남긴 상처 후 발생하는 상처 유발 유전자의 전사 활성화를 위해 15, 30, 60, 분 이상 기다립니다. 사출 슬라이드에서 배아를 제거하려면, 조심스럽게 슬라이드에서 할로 카본 오일 혼합 드레인 랙에 슬라이드 기대어 킴 와이프로 끝을 얼룩. </li><li> 슬라이드에 헵탄을 씻어 유리 페트리 접시에 린스 액을 씻어 유리 피펫을 사용합니다. 헵탄 테이프를 녹여 배아를 발표 할 예정이다. 모든 배아가 슬라이드에서 제거 될 때까지 계속 세척 할 것. 모든 배아가 슬라이드에서 제거 될 때까지, 다음 슬라이드로 이동합니다. </li><li> 20 ㎖의 공상 과학에 유리 접시에서 헵탄 플러스 배아 솔루션을 전송ntillation 유리 병. 2 ~ 3 분 동안 병을 흔들어, 헵탄을 제거하고 신선한 헵탄 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 신선한, 고정 솔루션의 5 ML을 추가합니다 (조리법에 대한 시약의 목록 참조). 유리 병 모자와 궤도 플랫폼 통에 연결합니다. 220 ~ 230 rpm에서 25 분 동안 배아를 포함하는 유리 병을 흔들어. </li><li> 흔들어, 인터페이스 팝업에서 거품을 할 수 있습니다. 완전히 배아를 잡아 당겨 피 피펫 아래, 수성 단계를 제거합니다. 바닥 층은 고정 솔루션으로 구성되어 있으며 제대로 처리해야합니다. </li><li> 메탄올 5 ㎖를 추가 유리 병 캡을 20 ~ 30 초, 소용돌이에 손으로 격렬하게 흔들 벤치에 놓습니다. 부상 배아는 계면에 남아있을 것하고 아래로 침몰하지 않습니다. 주의 사항 : 고정 후 unwounded 배아의 난황 막 일반적으로 메탄올 탈수 단계에서 폭발합니다. 그러나, 부상당한 배아의 난황 막 이미 고장 및 탈수 단계는 난황의 MEMB을 제거하지 않습니다RANE. 손 devitellinzation는 고정 프로토콜을 완료하는 데 필요합니다. </li><li> 조심스럽게 상단 헵탄 층을 제거하고 신선한 메탄올 5 ㎖를 추가합니다. 유리 병을 흔들어 배아 싱크해야합니다. </li><li> 유리 전송 피펫으로 메탄올 플러스 배아 용액을 제거하고 유리 접시에 나일론 메쉬 포집 관에 수집한다. </li><li> 메탄올을 제거하고 1X PBS 용액으로 배아를 씻어. </li><li> 사과 주스 플레이트에 나일론 메쉬에서 배아를 전송합니다. 판의 표면을 따라 배아를 확산. </li><li> 두 배 지팡이 테이프 유리 슬라이드에 배아를 전송합니다. 1X PBS와 배아를 커버. 참고 : 배아 때문에 난황 막 응집하는 경향이있다. 사과 주스 장소를 사용하여 응집 배아를 빠르게 분리 할 수​​ 있습니다. 힘에서 배아를 제거하기 위해 적용되었을 때 배아 한천 플레이트에 싱크 때문에 배아는 플레이트로부터 제거되고 이중 스틱 테이프 유리 슬라이드로 전송해야난황 막. </li><li> 조심스럽게 난황 막 &quot;팝업&quot;으로 해부 바늘로 배아를 밀어 넣습니다. 배아는 PBS에 침몰한다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 1X PBS 플러스 배아를 전송하는 유리 피펫을 사용합니다. 4 ℃에서 1X PBS 및 저장과 배아를 씻어 PBS 시리즈와 현장 하이브리드 또는의 면역 프로토콜 14을 계속 : 에탄올을 사용하여 배아를 탈수로 이동합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

외부 신호에 즉시 전사 조절 반응은 세포가 스트레스, 손상 또는 감염을 포함 할 수있다 세포 자극에 대한 지역화 된 응답을 조정 할 수 있습니다. 지역화 된 응답의 부적절한 조절은 손상을 복구하는 손상 이웃 세포에 대한 영향뿐만 아니라 자원의 낭비가있을 수 있습니다. Drosophila의 배아는 저렴하고 유지 관리가 쉬운 모델 생물의 기본적인 상처 치유 실험을 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 다른 모델 생물의 연구와 초파리 사이의 협력의 가능성은 많은 생물 학적 질문을 탐험 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 상처 기자의 추가적인 기술은 표피 상처 반응 경로의 활성화에 새로운 유전자의 포스팅을 테스트하기위한 효율적인 방법을 제공하는 돌연변이의 유전 적 배경을 조합이다. 우리는 표피 상처에 의한 전사 기자 AV가2 차 및 3 차 염색체 5 모두 ailable. 이 연구에서 우리는 UAS 및 과발현 (16)의 GAL4 시스템을 사용합니다. 치명적인 돌연변이 대립 형질을 가진 연구를 위해 우리는 형광 균형 염색체, 예를 들어 크 룹펠-GFP (17)를 사용하여 유전 적 배경을 결정합니다. 우리는 여러 가지 유전 적 배경 (표 1)에 상처 기자 현지화를 분석 하였다. 기술의 가능한 변형은 미세 주입 및 상처를 입기를 결합하는 것입니다. 마이크로 인젝션은 배아에 약액을 도입하는데 사용될 수있다. 몇몇 화합물은 화학적 검사를 마친 표피 상처 기자 9의 활성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 동시 상흔 및 마이크로 인젝션이 방법은 상처 신호를 직접 반응 (18)을 부상 후 유전자 발현의 변화를 모니터링하는데 사용될 수 초파리 배아 세포의 수를 증가하는 것이 유용 할 수있다. 미세 주입 기술의 미래 응용 프로그램은 표피 상처 반응의 조절에 대한 새로운 화학 물질을 테스트하는 것입니다. 유전자 연구를위한 모델 시스템으로 초파리 효율적으로 복잡한 문제를 해결하기 위해 간단한 프로토콜의 넓은 범위를 제공합니다. 초파리 기법의 타당성에 대한 최근의보고는 더욱 초파리 연구계의 영향 범위를 확장하기위한 수단으로서 혈구 이주 (19)과 기생 말벌 감염 (20)의 사용을 강조한다. 상처 수리 연구뿐만 아니라, 초파리, 상상 디스크 시스템 (21, 22)와 재생을위한 고전적인 모델을 제공합니다. 가상적인 디스크 재생 연구와 펑크 / 마이크로 인젝션 남긴 상처의 결합 발전은 조직 복구의 잘 보존 된 구성 요소를 발견 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다.

미세 주입 기술을 이용하여 초파리 배아의 조작은 잘 확립 된 분석 1. 표피 상처 응답 리포터 방법의 중요성은 형광 기자와 펑크 / 미세 주입을위한 프로토콜을 결합하고 Drosophila의 배아 표피 손상에 생체 반응을 시각화하는 것입니다. 이 방법의 목적은 표피 천자 부상으로 전사 반응을 조절하는 과정을 조사하기위한 도구로서 초파리를 사용하는 과학자의 광범위한 세트를 사용하는 것이다. 초파리의 단일 층 표피는 펑크 부상이 후 표피 상처의 반응을 연구 할 수있는 간단한 시스템을 제공합니다. Drosophila의 배아는 유전자 상처 반응, 염증, 및 재 상피화 3 등의 상처 보수의 단계를 해부에 대한 강력한 모델 시스템입니다. 많은 또는 대부분의 접합체 돌연변이 embryogenes의 단부에 생존 때문 부분에과 발달 패턴 뿌리깊은 틀려서 경우에도 표피 장벽을 개발한다. GRH-표적 유전자 아미노산의 일종 탈 카르복시 화 효소 (DDC)과 티로신 수산화 효소 (PLE)을 전사적으로 부상 (4)의 사이트를 중심으로 활성화됩니다. 확인 잘 보존 전사 인자 거친 헤드 (GRH), 이전 특성 초파리 상처 대응을위한 모델 생물로 포유 동물의 상처 치유 5에서 연구를 진행하는 조사의 보완 라인을 제공합니다. 후속 연구는 추가 초파리 상처 유발 유전자를 발견하고 6 명이 부상 청소 생체 표피 상처의 반응을 모니터링하는 많은 형광 상처 기자의 &quot;키트&quot;를 개발했다. 초파리 상처 치유의 규제에 관한 최근의 보고서는 세포 이동을 규제 7,8 많은 경로의 검색을 허용 상처 봉합 표현형에 초점을 맞추고있다. 의 분석형광 상처 기자는, 우리의 연구는 표피 상처 유도 유전자 (9)의 지역화 식에 필요한 유전자의 새로운 세트를 발견했습니다. 상처 응답 리포터 방법의 장점 중 하나는 결과 신호가 인접 셀에 부상의 사이트에서 형질 도입하는 방법의 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공한다는 것이다. 그러나, 상처 응답 리포터 방법의 단점 중 하나는 결과 직접 상처 치유 또는 수리 표현형을 링크하지 않는다는 것이다. 유전 및 화학 화면의 깨끗한 상처 천자 프로토콜의 광범위한 사용은 전사 반응의 새로운 규제 식별 할 부상 표피 및 부상 치료의 포유 동물 모델로 상처 치유 발견의 번역을 증진 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>효모</td><td>시그마 알드리치</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>사과 주스</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일, 700W</td><td>시그마 알드리치</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일, 27W</td><td>시그마 알드리치</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1- 페녹시-2-프로판올</td><td>시그마 알드리치</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>메틸-&베타;-시클로덱스트린</td><td>시그마 알드리치</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>독성 화학</td></tr><tr><td>헵탄</td><td>피셔 Scientific</td><td>H360-1</td><td>독성 화학물질</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>독성 화학물질</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase free H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila 인큐베이터</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>플라이 케이지</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>배아 수집 튜브</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붓</td><td>일반</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td><td>날카로운 물체</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td><td>날카로운 물체</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td>날카로운 물체</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>모세관 바늘</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>날카로운 물체</td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 주입 바늘 홀더</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>칼 자이스</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747 A</td><td>샤프 오브젝트</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피</td><td>펫 Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td>샤프 오브젝트</td></tr><tr><td>트랜스퍼 전구</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td>샤프 오브젝트</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>고정 용액</td><td>(5ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>2.5ml</td><td></td><td>독성 화학 물질</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5ml 0.5M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>0.5ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free H2O</td><td>1.5ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>할로겐 카본 오일 믹스</td> <td>(10ml)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>할로 카본 오일, 700W</td><td>5ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일, 27W</td><td>5ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

초파리 배아 모두 거친 외부 환경으로부터 내부의 세포를 보호 할뿐만 아니라, 세포의 항상성을 유지하는 역할을 강력한 표피층을 개발한다. 유리 바늘 구멍 부상 생활 배아 또는 유충의 지역화 기자 신호에 의해 시각하실 수 있습니다 상처 전사 기자가 활성화 빠른 표피 상처 반응을 일으킬 수있는 직접적인 방법을 제공합니다. 구멍을 뚫거나 레이저 부상은 상처 사이트에 혈구 세포의 채용을 촉진 신호를 제공한다. 놀랍게도, 최종 단계의 배아에서 심각한 (철저히) 빵꾸 부상은 거의 같은 부상 배아의 90 % 이상이 배아가 펑크 사이트에서 체액 즉시 누출을 최소화하는 오일 매체에 주입 할 때 성년 생존과 정상적인 배아 발달을 방해하지 . 상처 절차는 AG에 태아의 수동 정렬을 포함하여 초파리 배아의 미세 조작을 필요로하지AR 플레이트와 슬라이드를 현미경 정렬 된 배아의 전송. 초파리 표피 상처 반응 분석은 상처 치유뿐만 아니라 상처 치유를 촉진 잠재적 인 화합물을 선별하는 방법을 촉진 생물학적 기능의 다양한 유전 적 요건을 테스트하는 퀵 시스템을 제공한다. 짧은 수명주기 쉬운 배양 루틴이 초파리 강력한 모델 생물합니다. 초파리 깨끗한 상처 치유 규제 보존 찾을 수있는 훌륭한 시스템을 제공 아직 조사를 받고있다 방법으로, 타고난 면역 반응으로, 표피 재생 응답을 조정하기 위해 나타납니다 초파리와 포유 동물의 표피 상처를 입기에 공통 메커니즘.

이 방법에 나타낸 결과를 얻으려면, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 오픈 리딩 프레임은 도파 디카 르 복실 라 아제 (DDC) 및 DsRed를가 (티로신 수산화 효소로부터 상처 인핸서 서열에 융합에서 프로모터 / 상처 유발 인핸서 서열에 융합 PLE) 4,6. 라이브 Drosophila의 배아에서 형광 상처 기자 단백질의 성숙 최적의 4-6 충분한 단백질의 축적을위한 시간을 시각화 할 수 있습니다 부상 후 시간뿐만 아니라 형광 상태 (15)로 산화하는 형광 단백질을위한 시간이다. 기자 현지화를 관찰하기 위해, 화합물 형광 현미경은 충분하다. 기자 현지화의 높은 배율을 관찰하기 위해, 공 초점 현미경은 여러 광학 부분의 최대 투사 (그림 1)를 생성하는 최적입니다. Drosophila의 배아의 생체 내 이미징 공 촛점은 RA 복잡합니다배아의 PID 기복. . 배아의 전체보기는 20X 목적으로 취득 할 수 있고, 상처 사이트의 근접 촬영보기 40X 목적으로 얻을 수있다. 표피 상처 기자 현지화의 상위 뷰는 10 연속 1 ㎛의 광학 부분에 몇 군데 있습니다. 표피 상처 기자 현지화의 측면 뷰는 40 연속 1 μm의 광학 부분에 몇 군데 있습니다. 표준 유전자 횡단 방법을 사용하면, 유전자 변이 권취 기자 조합 될 수있다. 이 논문에서 제시 한 예는 Flotillin-2 (FLO-2)이다, 때문에 (P 요소의 삽입에 의해 생성 NULL 대립 유전자) 손실 함수와 기능 획득 (모든 세포에서 유비쿼터스 식으로 생성 과발현) 돌연변이의 FLO-2 FLO-2 유전자의 제품은 기자들에게 9 상처 DDC-GFP의 현지화를 억제하기 위해 필요하고 충분한 설명 (그림 2A와 2B). MI를 사용하여croinjection 프로토콜, 그것은 화학 솔루션 superactivates의 도입 또는 상처 기자의 지역화를 억제하는지 여부를 테스트 할 수 있습니다. 화학적 부상 배아 동시에 부상 및 1 % 톨루이딘 블루 염색 및 가용화 된 화합물의 1:4 비율로 주입 하였다. 톨루이딘 블루 염색은 체강에 주입되는 용해 된 화합물의 시각적 확인을 허용했다. 제어 배아는 화학하지 않고 1 % 톨루이딘 블루 염색 및 고용 1:4 비율을 포함 부러진 바늘로 부상했다. 본 논문에서 제시된 두 가지 예는 과산화수소이다 (H 2 O 2) 및 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD), 모두 화학 솔루션은 전 세계적으로 DDC-GFP의 현지화 기자 상처를 활성화하기에 충분하기 때문에 9 (그림 2C와 2D) . 과산화수소 (H 2 O 2) H에서 희석 2 O M. 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD) 0.6은 1m에 용해 된M NaOH를 3 mm로. 배아 고정 프로토콜을 사용하면, 상처 사이트를 둘러싸고, 국소 영역에서 권취 반응 유전자의 전사 활성을 검출 할 수있다. 이 논문에서 제시 한 예는 DDC와 PLE 성적 4,6,9 (그림 3a 및 3b)를 검출하기 위해 RNA 프로브의 현장 하이브리드입니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. DDC-GFP 및 PLE-DsRed를은 (B). (A) DDC-GFP 상처 기자의 높은보기. 부상 야생 형 배아 기자 현지화. 명 시야 및 형광 이미지를 상처 PLE-DsRed를의 높은보기 기자 상처. 모든 이미지는 20X 목적으로, 라이카 SP2 공 초점 현미경에 수집되었다. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널에서 점선의 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 유전자 돌연변이 배경과 화학 미세 주입 배아. 명 시야 및 부상 Flotillin-2 (FLO-2) 돌연변이 배아의 형광 이미지의 DDC-GFP 상처 기자의 현지화. (A) 손실의 기능 FLO-2 {KG00210} 돌연변이, 모든 상피 세포 걸쳐 리포터 활성의 팽창. (B) 기능 획득 FLO-2 (아르마딜로-GAL4, UAS-Flo2) 돌연변이 모두 상피 세포 걸쳐 리포터 활성의 억제. (C) 과산화수소 (H 2 O 2 ) 솔루션 미세 주입, 담당자의 확장의 orter 활동 모든 표피 세포에 걸쳐. (D) 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD) 솔루션 미세 주입, 모든 표피 세포에 걸쳐 기자 활동의 확장. 모든 이미지는 20X 목적으로, 라이카 SP2 공 초점 현미경에 수집되었다. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널의 점선은 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 그림 3. 상처 반응 유전자의 RNA 전 사체의 탐지. 부상당한 야생 형 배아 현장 하이브리드와 RNA의 검출의 형광 이미지. DDC (A)와 PLE (B) RNA 전 사체는 상처 사이트 주위에 축적된다. 모든 이미지는 컬렉터 엔진이었다20X의 목적으로 라이카 SP2 공 초점 현미경에 테드. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널의 점선은 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="표 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> 표 1. 표피 상처 응답 기자의 요약. 네 상처 응답 기자 (DDC, PLE, MSN, KKV)의 삽입 내용은 두 번째와 세 번째 염색체에 사용할 수 있습니다. 상처 응답 기자의 모든 야생형 배경 (예 : &quot;로컬&quot;표현형)에 찔린 상처의 사이트를 주변 표피 세포의 제한된 수의 형광 유전자 (GFP 또는 DsRed를)를 활성화합니다. DDC와 MSN 상처 응답 기자에 GRH가 필요 fluorescen의 활성화찔린 상처 (예를 들어, &quot;없음&quot;표현형) 후 CE 유전자. 상처 기자의 모든 구멍 부상 (예 : &quot;글로벌&quot;표현형) 후 형광 유전자의 국산화 FLO-2가 필요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아의 표피 상처 반응에 대한 생체 내(in vivo) 리포터를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 리포터 활성이 일관되게 검출될 수 있는 발달 단계를 수집합니다. 절차의 두 번째 단계는 유리 바늘과 미세주입 장치를 사용하여 배아에 구멍을 내는 것입니다.세 번째 단계는 리포터 시각화를 위해 배아를 마취하는 것입니다. 마지막 단계는 RNA 프로브의 발현 패턴을 검출하여 리포터의 국소화를 검증하는 것입니다. 최종적으로 공초점 현미경을 통해 천자 손상 부위 주변의 세포에서만 표피 상처 반응 리포터가 특이적으로 활성화된 결과를 확인할 수 있습니다.상처 폐쇄를 관찰하는 기존 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 천자 상처에 의해 유도되는 유전자 발현을 살아있는 배아에서 확인할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 손상 부위 주변의 세포들이 복구를 촉진하기 위해 즉각적인 상처 반응을 어떻게 조절하는지와 같이, 조직 복구 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 상처 반응 조절은 초기 단계에 해당하므로, 이 기술의 함의는 조직 재생의 치료 또는 진단 분야로 확장됩니다.상처 치유는 발달의 어느 단계에서나 분석할 수 있습니다. 하지만 17단계에 이르면 큐티클이 너무 성숙해져서, 알려진 상처 리포터(wound reporters)가 활성화되지 않습니다.시연을 위해, 배아를 수확하기 위해 15~16단계의 배아에 상처를 낼 것입니다. 성체 파리 2~3일 된 개체 중 암컷 50마리와 수컷 25마리를 수집하십시오. 이들을 사과 주스와 한천이 포함된 신선한 플레이트와 효모 페이스트가 소량 첨가된 배아 수집 케이지로 옮기십시오.향후 3일 동안 매일 아침 케이지를 25 °C에서 유지하십시오. 플레이트를 새것으로 교체하십시오. 셋째 날 오후에 새 플레이트에 2시간 동안 알이 쌓이도록 둡니다.이 플레이트를 25 °C에서 14시간 동안 보관하십시오. 2시간의 산란 시간이 주어지면 다음 날 약 200개의 배아가 생성될 것입니다. 플레이트에 수 밀리리터의 물을 추가하고 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.그 다음 페인트 붓을 사용하여 플레이트의 물과 배아를 수집 튜브 내의 나일론 메쉬 바스켓으로 옮깁니다. 이제 묽은 표백제 용액을 만들어 배아를 2분 동안 담급니다. 이 단계는 난각막(CORs), 즉 알 껍질을 제거하는 과정입니다.배아가 서로 뭉치는 것을 방지하기 위해 배스(bath)를 몇 번 가볍게 흔들어 줍니다. 2분 후, 흐르는 물과 페트리 접시를 사용하여 각각 5초 동안 배아를 헹굽니다. 그런 다음 배아 바스켓을 종이 타월 위로 옮겨 배아의 물기를 제거합니다.다음으로 해부침을 사용하여 약 50개의 배아를 메쉬에서 녹색 식용 색소로 만든 아가 플레이트로 옮깁니다. 색소는 배아의 가시성을 높이기 위한 것입니다. 해부 현미경 하에서 배아를 약 5mm 간격으로 두 개의 평행한 줄로 배치합니다.가스 교환이 가능하도록 배아 한 개의 너비만큼 행 사이의 간격을 둡니다. 다음으로, 행이 슬라이드의 길이 방향과 수직이 되도록 양면테이프를 붙인 슬라이드를 배아 위에 조심스럽게 누릅니다. 내부 압력을 낮추기 위해 배아를 공기 중에서 건조시킵니다.이렇게 하면 배아가 상처를 입었을 때 터지지 않습니다. 25분이 지나면 처음 준비한 슬라이드가 건조되었을 것입니다. 이제 추가적인 탈수를 방지하기 위해 배아 위에 halocarbon oil을 2~3방울 떨어뜨리고, 즉시 건조된 배아에 상처를 내는 과정을 진행하십시오.배아 슬라이드를 주입 현미경 스테이지에 놓습니다. 시야에서 배아를 찾아 도립 현미경의 스테이지를 이동시키는 연습을 합니다. 이제 배아의 등-배축(dorsal ventral axis)을 따라 중간 평면에 초점을 맞추고, 정렬된 첫 번째 행의 상단 배아를 시야로 가져옵니다.다음으로, 풀링된 니들을 니들 홀더에 조심스럽게 배치하고 고정합니다. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 니들을 슬라이드 쪽으로 내립니다. 니들을 배아와 동일한 초점 평면에 맞춥니다.이제 마이크로 조작기를 더 이상 조정하지 마십시오. 이제 스테이지를 이동시켜 배아를 완전히 관통하도록 천자합니다. 그런 다음 같은 줄의 다음 배아로 이동하십시오.첫 번째 줄에 상처를 낸 후, 바늘을 스테이지에서 완전히 위로 들어 올려 멀리 이동시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 회전시켜 두 번째 줄의 배아들에 계속해서 천공을 수행합니다. 모든 배아에 상처를 낸 후에는, 즉시 고정하여 내부 하이브리드화 또는 항체 염색을 진행할 수 있습니다.형광 리포터를 확인하려면 4~6시간 동안 기다린 후 배아를 새 슬라이드로 옮기고, 배아 주변에 유리 구슬을 배치합니다. 그다음 마취제인 50% phenoxy, two propanol을 몇 방울 첨가하고, 미세 주입을 위해 배아 위에 커버 슬립을 덮습니다. 주입 바늘의 후면을 통해 0.6 molar hydrogen peroxide와 같은 염료가 포함된 화학 용액 1 µL를 충전합니다.모세관 현상을 통해 화학 용액이 바늘 끝까지 끌어올려지도록 합니다. 그 다음, halo carbon oil 혼합액 내에서 커버 슬립의 가장자리를 이용해 바늘 끝을 부러뜨립니다. 먼저, 약 90도 각도로 기울어진 커버 슬립의 가장자리에 맞춰 장착된 바늘의 초점을 맞춥니다.다음으로, 커버 슬립의 가장자리를 바늘 끝부분에 대고 살며시 움직여 바늘 끝을 부러뜨립니다. 그 후 미세주입 장치에 압력을 가해 용액이 바늘 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 용액이 흐르지 않는 경우, 바늘 끝을 조금 더 부러뜨립니다.이제 배아에 구멍을 뚫을 때 사용했던 것과 동일한 절차를 수행하십시오. 이번에는 구멍을 뚫음과 동시에 용액을 미세 주입합니다. 이상적으로는 10 nanoliters를 주입하십시오.배아에 용액을 너무 많이 주입하면 Vitale 막이 파열될 수 있으므로, 텍스트 프로토콜의 고정 절차를 따를 때 다음 단계들에 주의를 기울이십시오. 슬라이드 위의 heptane을 헹굴 때는 플라스틱이 아닌 유리 피펫을 사용하고, 배아를 유리 페트리 접시 중앙으로 모을 때도 유리를 사용하여 회전시키십시오. 이후, 고정액 내에서 배아를 220에서 230 RPM으로 25분 동안 흔들어 줍니다.흔든 후, 하단의 수층을 완전히 제거하기 전에 계면에 생긴 기포가 터질 때까지 기다리십시오. 또한, 배아가 함께 딸려 나오지 않도록 주의하십시오. 메탄올을 첨가한 후, 손상된 배아들이 나중에 계면에 뭉치게 되는데, 이때 배아들을 플레이트 표면을 따라 이와 같이 펼친 다음, 이와 같이 양면테이프가 부착된 유리 슬라이드로 옮기십시오.그런 다음 해부용 바늘로 배아를 조심스럽게 밀어 Vitale 막을 터뜨리고 탈수를 진행합니다. 야생형 파리에 DOPA decarboxylase 또는 tyrosine hydroxylase 인핸서가 융합된 형광 리포터를 형질전환 시킨 후 기술된 분석을 수행했습니다. 명시야에서는 상처 부위를 확인할 수 있었으며, 형광 조명 하에서는 DCD 상처 리포터 활성을 확인할 수 있었습니다.tyrosine hydroxylase 리포터에서도 유사한 결과가 나타났습니다. 두 이미지 모두 20 x 대물렌즈가 장착된 Leica SP two 공초점 현미경으로 수집되었습니다. 해당 절차는 loss of function flow two 변이체에서 수행되었습니다.배경을 살펴보면, 모든 세포에서 보편적으로 발현되도록 생성된 기능 획득(gain of function) flow two 돌연변이체에서는 DOPA 탈탄산효소(DOPA decarboxylase) 리포터 활성이 표피 세포 전체로 확장되었습니다. 표피 세포 전반에서 리포터의 억제가 관찰되었습니다. 다음으로 배아에 상처를 동시에 내고 가용화된 화합물과 udine blue 염료, 과산화수소 및 물을 주입한 결과 표피 세포 내 DOPA 탈탄산효소 리포터 활성이 확장되었으며, 내부 U 하이브리다이제이션(inside U hybridization)을 이용해 수산화나트륨 내의 methyl B cyclodextrin을 주입했을 때도 마찬가지 결과가 나타났습니다.상처 반응 유전자의 전사 활성화는 내인성 DOPA 탈카복실화 효소를 통해 분석되었습니다. RNA 발현은 상처 부위 주변에 국한되어 나타났으며, 당연히 tyrosine hydroxylase의 RNA 전사체 또한 상처 부위에 축적되는 것이 확인되었습니다. 숙달되면 이 기술은 적절히 수행했을 때 60분 이내에 완료할 수 있습니다.본 실험 절차를 수행할 때, 배아를 정렬하는 데 너무 많은 시간을 소비하지 말고 신속하게 다음 단계로 진행하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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