세포 유전 분광법을 사용하여 특발성 척추 측만증의 예후 예측을위한 세포 기반 분석 프로토콜

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 유전체 분광법을 사용하여 GPCR R 활성화에 대한 PBM C의 반응을 스크리닝함으로써 환자의 기능적 분류에 따라 특발성 척추측만증의 예후를 예측하는 것입니다. 이는 세포 수를 확장하기 위해 피토 헤마글루티닌(phyto hemagglutininin) 또는 PHA가 있는 상태에서 pbmc를 배양함으로써 달성됩니다. 세포 확장은 기울어진 자세로 유지되는 튜브에서 완료됩니다.

두 번째 단계로, 세포는 위장 단백질 활성을 증가시키거나 감소시키는 오스테오폰틴 또는 OPN으로 처리됩니다. 치료 후 환자에 따라 세포 현탁액이 마이크로플레이트로 전달됩니다. 다음으로, GI 또는 GS GPCR 작용제로 세포를 자극하여 결과적인 임피던스 변화를 결정합니다.

결과는 모든 well에 대한 운동 반응을 제공하고 통합 응답은 임피던스 변화를 기반으로 정량화됩니다. 이 기술의 의미는 단순한 진단을 훨씬 뛰어넘습니다. 그래서 처음으로, 저희는 척추측만증으로 발전할 위험이 있는 증상이 있는 환자들을 조기에 발견할 수 있게 되었고, 이제 누가 척추측만증으로 발전할 것인지 또는 어느 단계에서 발병할지 알게 되어, 저희는 그들을 치료하기 위한 새로운 치료법을 제공할 수 있습니다.

X-ray 노출과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 covid를 측정할 필요가 없고 건강 위험 없이 progno osteopath 척추측만증을 예측할 수 있다는 것입니다. 가장 최근의 기술은, 지금 우리의 연구 조교인 니타 프랑코(Nita Franco)가 섭씨 37도의 수조에서 말초 혈액 단핵 세포의 동결 분취액을 해동하는 것입니다. 멸균 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15ml의 완전한 배지와 원심분리기가 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다.

세포는 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1ml의 PHA 배지에 부드럽게 매달아 놓고 동일한 매체로 부피를 20ml로 채우고 튜브를 느슨하게 덮어 공기가 들어갈 수 있도록 합니다. 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 튜브를 배양하여 정지된 림프구가 빠르게 증식하는 림프구로 변형되도록 합니다.

캡을 완전히 조이고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 흡인에 의해 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 1ml의 완전한 배지에 부드럽게 매달아 놓습니다.

동일한 배지로 부피를 20ml로 완성하고 밤새 튜브를 느슨하게 배양하여 세포 수를 확장합니다. 10ml의 RPMI 1640으로 두 번 세척한 후 600마이크로리터의 RPMI 1640에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 자동 세포 계수기 및 생존도 분석기를 사용하여 세포 농도와 생존율을 측정합니다.

그런 다음 적절한 부피의 RPMI 1640을 추가하여 20마이크로리터당 5번째 세포에 1.5 곱하기 10의 세포 농도로 조정합니다. 100마이크로리터의 현탁액을 두 개의 멸균 1.5ml 엔드 고아 튜브로 옮깁니다. 하나의 튜브에 재조합 오스테오폰틴을 최종 농도인 밀리리터당 0.5마이크로그램까지 추가합니다.

두 번째 튜브에 동일한 부피의 PBS를 추가합니다. 100 마이크로리터로 설정된 멸균 피펫을 사용하여 두 번 피펫팅하여 각 조건을 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 96 Well 플레이트의 각 웰에 5마이크로리터의 RPMI 1640을 추가하고 200GS에서 플레이트를 3분 동안 원심분리하여 기포를 제거하여 튜브에서 마이크로플레이트로 세포를 이동시킵니다.

세포의 균일한 현탁액을 보장하기 위해 위아래로 한 번 부드럽게 피펫팅합니다. 웰당 40마이크로리터의 세포 현탁액을 시딩하고, 처리되지 않은 세포의 경우 쿼드 복제, ROPN 또는 PBS 처리된 세포의 경우 복제합니다. 세포판을 멸균 후드 아래에 5분 동안 그대로 두어 세포가 휴식을 취하고 웰 바닥에 고르게 정착할 수 있도록 합니다.

OPN 배양의 효과를 최적화하기 위해 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 18시간 동안 세포를 실온에서 약 30분 동안 배양물을 평형화합니다. 한편, RPMI 1640에서 100마이크로몰 소마토스타틴과 이소프로테레놀 1밀리리터를 준비합니다. 적절한 웰에 20마이크로리터를 분배하여 복합 플레이트를 채웁니다.

경화 가능한 씰로 복합 플레이트를 덮습니다. 플레이트 피펫 팁과 복합 플레이트를 CDS 기반 시스템에 로드합니다. CDS 기반 기기 소프트웨어에서 플레이트의 이름을 지정합니다.

프로토콜 목록으로 이동하여 적절한 프로토콜을 선택하여 프로토콜을 시작합니다. 시작을 클릭합니다. 통합 유체 시스템은 동시에 모든 웰에 화합물을 추가합니다.

CDS 기반 시스템은 86%와 96% 범위에서 일관된 값으로 모든 샘플 간에 compound edition cell viability를 비교한 후 15분 동안 데이터를 자동으로 수집합니다. 32개의 샘플 중 사용된 2개는 세포 수가 부족하여 분류되지 않았습니다. 이 예제에서는 GI와 GI 신호 간의 불균형 정도에 따른 기능 분류를 보여줍니다.

GI 자극에 대한 반응으로 OPN 효과를 평가한 결과, OPN이 환자 353 및 371에서 반응을 증가시킨 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, ROPN 치료 후 환자 345 및 382에서 반응이 50% 이상 감소했고 환자 370에서 50% 미만으로 감소했습니다. 그래서 우리의 분류 기준에 따라 FG 1의 환자 353과 371, FG 2의 환자 45와 382에서 300, FG 3의 환자 370을 분류할 수 있었습니다.

이와 동시에 모든 환자를 GI 단백질 자극에 대한 반응을 선별하고 대조군과 비교했습니다. 예상했던 대로, 모든 환자들은 대조군보다 반응이 낮았다. 동일한 기능군으로 분류된 환자들은 비슷한 수준의 최대 반응을 보였다.

San Justine Hospital의 특별 클리닉에서 정기적으로 실시한 대규모 SC 환자 코호트의 분류는 세 가지 기능 그룹이 유사하게 분포되어 있음을 밝혔습니다. 중등도 사례 중에서는 FG 2가 중증 사례 중에서 우세했습니다. 이 비디오를 기다린 후에는 세포 유전체 분광법을 사용하여 환자를 2개, 3개의 작용기로 분류하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.