열 유도 항원 검색: 성체 해마 신경 발생 중 전구 세포 유형을 감지하고 식별하는 효과적인 방법

이 절차의 전반적인 목표는 해마 뇌 조직에서 항원 검색을 수행하여 신생아 뉴런을 발생시키는 전구 세포 유형을 더 잘 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 얇은 코로나 절편을 절단한 쥐에서 관류된 뇌를 채취하고, 이 절편을 조직에 강하게 부착되도록 특별히 설계된 유리 슬라이드에 장착함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 티슈와 케이 아토피 치료제로 슬라이드를 끓이고 냉각을 위한 충분한 시간을 확보하는 것입니다.

다음으로, 1차 항체로 밤새 조직을 염색합니다. 마지막 단계는 다음날 최소 2시간 동안 조직에 대한 2차 항체 염색을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 타임 랩스 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 해마 조직의 성인 신경 발생 중 다양한 발달 단계에 걸쳐 다양한 프로 젠더 세포 유형을 시각화합니다.

안녕하세요, 제 이름은 박사후 연구원이자 Dr.Ian John의 연구실과 Mayo Clinic의 일원인 Hun Jo입니다. John Lab의 주요 초점은 신경 및 정신 장애의 다른 신경 발생 과정을 조사하는 것입니다. 우리의 최종 목표는 항원 회수 절차가 Quam Hui가 될 것임을 보여주는 치료 응용 프로그램으로 이러한 지식을 성공적으로 변환하는 것입니다.

기존 면역조직화학 방법에 비해 당사 기술의 주요 장점은 성체 해마 신경 발생 중에 뚜렷한 세포 유형을 효과적으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 다른 방법으로는 검출하기 어려운 전구체 신경 줄기 세포를 포함한 이러한 세포 유형은 당사의 항원 검색 방법을 사용하여 효율적으로 라벨링하고 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 성인 해마 신경 발생 동안 신생아 뉴런의 발달 및 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

정신 장애 및 약물 치료에 관심이 있는 사람들에게 당사의 항원 검색은 이 질병 동안 신경 발달의 역할을 조사하는 데 유용할 것입니다. 발병 기전. 관류된 마우스의 뇌를 10ml 원추형 튜브에 4% 파라 포름알데히드에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 최소 12시간에서 24시간 동안 또는 완전히 고정하려면 36시간을 넘지 않도록 삽입하여 절차를 시작합니다. 하룻밤 고정 후 PFA를 제거하고 뇌를 원뿔형 튜브에 남겨둡니다.

다음으로, 30% 자당으로 뇌를 헹구어 잔류 PFA를 제거하고 자당을 버립니다. 그런 다음 튜브에 30%의 자당을 다시 채우고 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도로 유지합니다. 그런 다음 마이크로톰에서 해마를 40마이크로미터 크기의 뇌 절편으로 자릅니다.

면역조직화학이 준비될 때까지 부동액 용액의 단면을 보존합니다. 그런 다음 조직에 강하게 부착되도록 특별히 설계된 현미경 슬라이드에 슬라이스를 장착합니다. 티슈를 장착한 후 슬라이드를 약 10분 동안 건조시킵니다.

슬라이드를 종이 타월의 수직 표면에 대고 이전 화학 물질을 완전히 제거할 수 있도록 건조를 가속화할 수 있습니다. 슬라이드가 건조되면 PB S3로 매번 5분씩 세척합니다. 그런 다음 다시 말리십시오.

이 절차에서는 동봉된 원고의 설명에 따라 조직이 끓을 수 있도록 용액을 준비합니다. 그런 다음 용액을 표준 설정으로 표준 전자레인지에서 5분 동안 끓입니다. 끓는 것이 완료되면 전자레인지에서 용기를 조심스럽게 꺼냅니다.

그런 다음 건조된 슬라이드를 용액으로 옮깁니다. 해마 부분이 있는 면이 용액에 완전히 노출되었는지 확인하십시오. 가능하면 슬라이드를 용기 벽에 비스듬히 놓고 그 주위에 다른 슬라이드를 쌓습니다.

그런 다음 표준 설정으로 전자레인지에서 7분 동안 슬라이드와 함께 혼합물을 끓입니다. 그동안 얼음 양동이 두 개에 얼음을 반쯤 채웁니다. 끓는 것이 완료되면 전자레인지에서 용기를 꺼내 얼음 양동이 중 하나에 넣으십시오.

다른 양동이의 나머지 얼음을 용기 전체에 붓고 완전히 덮습니다. 그 후, 한 시간 후에 한 시간 동안 그대로 두십시오. 용기에서 슬라이드를 꺼냅니다.

TBST 버퍼로 매번 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 어두운 곳에서 5-10분 동안 또는 슬라이드가 완전히 마를 때까지 슬라이드를 건조시킵니다. 그 동안, 하룻밤 동안 1차 항체 염색을 위해 DDH 2 O가 있는 챔버를 준비합니다.

슬라이드가 마르면 물 아펠란트 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 윤곽을 그립니다. 이 개요는 항체 혼합물이 흘러내리는 것을 방지하는 장벽 역할을 합니다. 그런 다음 T-B-S-T-T에서 1차 항체 혼합물을 준비합니다.

건조된 슬라이드를 염색 챔버의 스테이지에 놓습니다. 1차 항체 500마이크로리터를 전체 표면을 덮도록 천천히 추가합니다. 그 후, 염색 챔버를 덮어 외부 빛을 차단하고 다음날 실온에서 하룻밤 동안 보관하고 TBST 버퍼로 매번 5분씩 슬라이드를 3회 세척합니다.

그 후, 어둠 속에서 말리십시오. 이제 T-B-S-T-T에서 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 건조 슬라이드를 염색 챔버에 놓습니다.

2차 항체 500마이크로리터를 추가합니다. 염색 챔버를 천천히 덮고 2차 염색 완료 후 실온에서 최소 2시간 동안 외부 광선으로부터 보관하고 TBST 버퍼로 매번 5분 동안 슬라이드를 세 번 세척하고 건조 후 어두운 곳에서 슬라이드를 건조합니다. 슬라이드에 장착 솔루션을 추가합니다.

거품이 생기지 않도록 조심스럽게 커버 슬립으로 덮으십시오. 그런 다음 후속 분석을 수행하고 염색된 조직에 대한 시간 경과 또는 convo 분석을 수행하기 전에 슬라이드를 최소 2시간 동안 어두운 곳에 두십시오. 성인 해마 신경 발생은 치상회(dentate gyrus)의 하위 과립 영역에 걸쳐 묘사됩니다.

제1형 줄기세포와 같은 활성화된 방사상 신경교세포는 분화하고 성숙하며 정교한 형태로 기능적으로 뉴런 회로에 통합됨에 따라 뚜렷한 단계를 거칩니다. 각 상과 각각의 세포 유형은 마커 조합의 발현을 기반으로 식별될 수 있습니다. MCM 2는 모든 유사분열 전구 세포 유형에 걸쳐 발현되는 증식 마커인 반면, nein은 줄기세포와 같은 방사형 및 비방사형 신경교세포에서 발현됩니다.

유형 2 A 전구 세포가 분화됨에 따라 중첩 발현이 먼저 꺼집니다. 유사 분열 후 전구 MCM 2 발현에서 Anti TBR 2 발현이 증가하면 DCX 및 NEWAN 발현이 기능적 뉴런으로의 이동 및 성숙을 지시하는 반면 MCM 2 발현이 손실됩니다. 이것은 보라색 MCM, 두 개의 녹색 네스톤과 빨간색 대피 염색의 대표적인 컨포칼 이미지입니다.

상자의 확대된 이미지는 neston MCM 2 및 dpi를 표현하는 전구와 같은 방사형 GL을 보여줍니다. 다음은 청색 MCM 2 적색, TBR 2 녹색 DCX 및 회색 dpi의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. Type 2 B 전구 세포 유형의 특징을 염색하는 것은 MCM 2, TBR 2D, c, X 및 dpi를 표현하는 상자의 확대 이미지에 표시됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 세 가지를 기억하는 것이 중요합니다. 첫째, 적절한 관상 모양 두께의 잘 관류되고 고정된 조직을 활용합니다. 둘째, 조직을 슬라이드에 평평하게 장착하고 그렇게 하는 동안 손상을 방지합니다.

마지막으로 셋째, 항원 회수 중 끓이고 나중에 냉각할 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 이 절차에 따라 공초점 조직 재구성 및 행동 실험과 같은 다른 방법을 수행하여 신생아 뉴런이 해마 회로에 어떻게 통합되고 인지 기능에 기여할 수 있는지에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 해마 조직에서 항원 회수를 수행하여 다른 해마 신경증 동안 새로운 뉴런을 생성하는 현재 세포 유형을 더 효과적으로 시각화하는 방법을 잘 이해해야 합니다.