높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜
December 9th, 2013
이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 염색체 외 배열을 Caenorhabditis elegans 게놈에 통합하기 위한 빠르고 낮은 재료 소모 절차를 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 염색체 외 어레이를 높은 비율로 전송하는 형질전환 라인에 특히 적합합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 자외선 조사를 사용하여 형질전환 추가 염색체 배열을 serratus elegance 게놈에 통합하는 것입니다. 먼저, 가능한 가장 높은 투과율(이상적으로는 80% 이상)을 가진 형질전환 라인을 선택한 다음 선택된 각 F1 플레이트에서 형광 형질전환 F 2마리 중 4마리를 골라낸 선택된 형질전환 L 4마리의 유충을 UV조사합니다. 다음 화면, 100% 형광 형질전환에 대한 F 두 플레이트.
F 세 개의 벌레. 궁극적으로 F 3 세대의 형광 동물을 선택하면 전이 유전자의 100 % 유전을 보여줄 수 있습니다. 이 실험적 접근법은 여분의 염색체 배열을 높은 비율로 전달하는 형질전환 세포주에 매우 적합합니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Stephanie Belman이 맡을 것입니다. 선충 성장이 포함된 500개의 대형 페트리 접시로 시작하십시오. 중간 : 각 플레이트에 0.3 밀리리터의 포화 이시아 콜리를 씨를 뿌립니다.
OP 50 문화. 각 형질전환 라인에 대해 통합될 형질전환 라인의 투과율을 평가합니다. 형광 입체경 배양 아래에 있는 10개의 개별 배양 플레이트에 10명의 형광 중력 성인을 선택합니다.
지렁이 인큐베이터에 있는 동물들은 유전적 배경의 번식에 허용되는 온도로 설정됩니다. 매일 자손을 모니터링하여 CO 주입 마커가 발현되는 발달 단계를 평가하고 형광 투시경을 사용하여 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 형광 자손의 비율을 결정하여 자손의 전염 속도를 평가합니다.
transgene integration의 경우 투과율이 가장 높은 형질전환 라인을 선택합니다. L 4 유충 단계에서 동기화된 형질전환 동물의 개체군을 얻습니다. 통합을 위해 30개의 형광 GRA 성체를 5개의 배양 플레이트에 선택합니다.
기생충이 섭씨 15도에서 3-4시간 동안 알을 낳은 후, 접시로 최소 30개의 알이 있는지 확인한 다음 접시에서 성충을 제거하고 자손이 L 4개의 유충 단계에 도달할 때까지 벌레 부화기에서 동물을 배양합니다. 15-20마리의 형광 형질전환 L 4마리를 담고 있는 각 플레이트를 뚜껑을 제거한 상태로 UV 가교제에 넣고 기생충에 방사선을 조사하여 회복시킵니다. 방사선에 노출된 벌레를 섭씨 15도에서 밤새 배양합니다.
우리 손에 살아 있는 동물의 수를 확인하십시오. 약 80-90%의 생존율은 효율적인 방사선 조사에 적합합니다. 방사선 조사된 동물을 자손이 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 15도에서 25도에서 성장시켜 co injection marker 발현을 관찰할 수 있습니다.
단일 형광 F1 동물을 별도의 배양 플레이트로 옮깁니다. 자손이 사용된 co marker에 따라 형광 F 두 동물을 관찰할 수 있는 적절한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트를 섭씨 15-25도로 유지하십시오. 이 특별한 경우에서, 우리는 성충이 F1 동물이 불임 상태이거나 죽었음을 나타내는 자손이 하나, 없거나 몇 마리의 형광 F 2 동물만 나타내는 모든 F1 플레이트를 버리는 것을 관찰했습니다. 이는 F1 동물이 예상된 속도로 전이유전자를 전달하지 않았음을 나타냅니다.
선택한 각 F1 플레이트에서 4개의 형광 형질전환 F, 2마리의 동물을 골라냅니다. 형광 전이유전자를 사용할 때 형광 수준이 높은 두 개의 웜을 선택하면 이러한 동물이 통합 어레이에 대해 동형접합적임을 나타낼 수 있습니다. F 두 동물을 선택할 때 다음 단계에서 거짓 부정을 피하기 위해 알이나 유충을 가지고 다니지 않는 것이 중요합니다.
성장 후 F 두 동물은 F 두 플레이트에서 100% 형광 형질전환 F 3 벌레를 스크리닝합니다. 단일 비형광 웜의 존재는 플레이트를 버려야 함을 나타내고, 선택된 플레이트에서 8개의 형광 F 3마리를 골라내어 전이유전자의 100% 유전을 확인해야 함을 나타내기 때문에 스크리닝은 매우 빠릅니다. 가능한 경우, 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 균주를 유지하십시오.
거의 동일한 빈도로 여분의 염색체 배열을 전달하는 두 개의 상이한 라인에서 전이유전자의 통합이 수행되었습니다. 표준 및 개선된 프로토콜을 사용하면 통합 라인당 필요한 시간과 플레이트 수가 개선된 프로토콜에서 최적화됩니다. 다음으로, 통합되지 않은 라인에서 더 높은 전이유전자 전달률이 전이유전자를 게놈에 더 쉽게 통합한다는 가설을 테스트했습니다.
하나의 특정 전이유전자는 가장 높은 전달 라인을 위해 개선된 프로토콜을 사용하여 다른 속도로 전송하는 라인에 통합되었습니다. 90마리의 선택된 F1 동물에서만 3개의 통합 라인이 회수된 반면, 50에서 60%로 전달되는 형질전환 라인의 경우 110마리의 선택된 F1 동물에서 하나의 통합 라인이 회수되었습니다. 이 절차에 따라 유전자 발현, 패턴 및 조절, 단백질 국소화 및 단백질 과발현 또는 세포 내 마커 개발과 같은 추가 질문에 답하기 위해 다양한 방법을 수행할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 외염색체 배열을 아원충(Caenorhabditis elegans) 게놈에 통합하기 위한 신속하고 재료 소모가 적은 절차를 설명합니다. 이 방법은 외염색체 배열을 높은 비율로 전달하는 형질전환 계통에 특히 효과적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 형질전환
배경
- 형질전환 유기체는 유전자 기능을 연구하는 데 중요합니다.
- 외염색체 배열은 유전자 발현을 촉진할 수 있습니다.
- 자외선 조사는 유전 물질을 통합하는 방법입니다.
- 높은 전달 비율은 성공적인 실험에 중요합니다.
연구 목적
- C. elegans에 형질전환 배열을 통합하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- 형질전환 전달의 효율성을 향상합니다.
- 연구자들에게 재료 소모가 적은 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 높은 전달 비율을 가진 형질전환 계통을 선택합니다(이상적으로는 >80%).
- 선택된 L4 유충에 자외선을 조사합니다.
- 형광성 형질전환 선충을 위한 F2 판을 선별합니다.
- 형광성 F3 세대 동물을 선택하여 유전을 확인합니다.
주요 결과
- 게놈에 형질전환 배열의 성공적인 통합.
- 형질전환 유전자의 높은 전달 비율이 관찰되었습니다.
- 프로토콜은 효율성과 낮은 재료 사용을 입증했습니다.
- 형광 선별을 통해 형질전환 계통을 쉽게 식별할 수 있었습니다.
결론
- 이 프로토콜은 안정적인 형질전환 계통을 만드는 데 효과적입니다.
- 자외선 조사는 유전자 통합을 위한 타당한 방법입니다.
- 이 접근법은 다양한 형질전환 응용에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of stable transgenic C. elegans lines with 100% transgene transmission, addressing a key bottleneck in target validation where mosaic expression and variable inheritance confound phenotypic screening. By improving integration efficiency in high-transmission strains, it supports mechanistic de-risking of gene function studies and accelerates lead identification pipelines requiring consistent transgene expression. The low material consumption and scalability make it suitable for enterprise-scale assay development and preclinical model generation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stable, nonmosaic transgene expression in C. elegans.
- Operational Value: Reduces ambiguity in phenotypic screening by eliminating variable transgene transmission rates.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing reliable readouts for gene expression pattern and regulation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with uniform transgene inheritance for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through 100% fluorescent F3 progeny screening, ensuring reproducibility.
- Scalability: Enables rapid generation of multiple independent integrated lines from a single UV irradiation step.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system development by enabling subcellular marker creation and protein localization studies.
- Preclinical Model: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through consistent overexpression models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway validation by eliminating transgene transmission variability as a confounding factor.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical validation, specifically enabling reliable transgene-dependent assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via stable transgene integration in high-transmission lines.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative fluorescent outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides binary readout (100% fluorescent F3) for go/no-go decisions on transgene integration success.
- Translational Research: Connects to biomarker development through subcellular marker generation and protein localization studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating multiple independent transgenic strains per target.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through elimination of mosaic expression and variable transmission.
- Operational Value: Standardization and scalability via low-material UV irradiation and rapid F3 screening.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions and capital efficiency by reducing failed transgenic line generation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through reliable transgene transmission metrics for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, fluorescent screening, and UV irradiation safety protocols.
- Depends on access to UV crosslinker and fluorescent stereoscope for co-injection marker visualization.
- Necessitates cross-team standardization on transmission rate thresholds (>80%) for line selection.
- Involves adaptation considerations for different co-injection markers and transgene expression patterns.
- Practical limitation: Integration efficiency remains strain-dependent, requiring prescreening for high-transmission lines.
