Name: 높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans 게놈에 UV 조사를 이용하여 고전달률 염색체 외 배열을 통합하는 빠른 프로토콜. 이 방법은 안정적인 형질전환 계통 생성에 효과적입니다.

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저자는 통합되지 않은 Pdyc-1::d yc-1::gfp를 생성한 Claire Lecroisey와 Laurent Ségalat에게 감사를 표합니다. Pmyo-2::d sRed 및 Pmyo-3::gfp 형질전환 균주. Pmyo-2::d sRed 플라스미드를 선물해 주신 Andy Fire님과 Pmyo-3::gfp 플라스미드를 선물해 주신 Pamela Hoppe님께 감사드립니다. 이 연구는 프랑스 국립 과학 연구 센터 (CNRS)와 리옹의 클로드 버나드 대학 (Claude Bernard University of Lyon)에 의해 설립되었습니다.

1. 통합 전에 형질전환 선충 배양
형질전환 라인은1에 설명된 대로 생성될 수 있습니다. 이러한 라인은 일반적으로 형광 단백질의 발현 또는 주어진 발달 단계에서 특정 행동 또는 형태학적 표현형으로 이어지는 coinjection marker plasmid를 포함합니다1,3. 이 통합 프로토콜은 형광 또는 비형광 동시 주입 마커를 발현하는 균주에 적용할 수 있습니다. 다음 예에서는 형광 동시 주입 마커가 있는 균주가 사용되었습니다.
<ol>
	<li>배양 플레이트 준비:
		<ol>
			<li>약 500 개의 60mm 대형 페트리 접시를 준비하고, 각각 10ml의 선충 성장 배지 (NGM) 6,7를 무균 적으로 붓는다.</li>
			<li>표준 절차6,7에 따라 각 플레이트에 0.3ml의 포화 대장균 OP50 배양을 파종합니다.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>통합할 형질전환 라인의 투과율을 평가합니다.
		<ol>
			<li>각 형질전환 라인에 대해7에 설명된 대로 지렁이 픽을 사용하여 형광 입체경 아래 10개의 개별 배양 플레이트에 10개의 형광 임신 성체를 선택합니다.</li>
			<li>벌레가 번식할 수 있도록 15-25°C(유전적 배경에 따라 다름)의 벌레 인큐베이터에서 동물을 배양합니다.</li>
			<li>매일 자손을 관찰하여 어떤 발달 단계에서 coinjection marker가 발현되고 가장 잘 관찰될 수 있는지 평가합니다. 현재 사용되는 대부분의 coinjection 마커의 발현은 L4 유충 단계 또는 성충에서 관찰됩니다.</li>
			<li>형광 입체경으로 관찰하여 형광 자손의 비율을 결정하여 자손의 전염 속도를 평가합니다.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>transgene integration을 위한 transgenic line 선택:
		<ol>
			<li>가능한 한 가장 높은 투과율(이상적으로는 ≥80%)을 가진 형질전환 라인을 선택합니다.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>통합을 위해 L4 유충 단계에서 동기화된 형질전환 동물 개체군을 얻습니다.
	<ol>
		<li>30마리의 형광 임신 성체를 5개의 배양 플레이트(플레이트당 6마리)에 담습니다.</li>
		<li>벌레가 15 ° C에서 3-4 시간 동안 알을 낳도록하십시오.</li>
		<li>접시에 최소 30개의 알이 있는지 확인한 후 접시에서 성체를 제거하십시오.</li>
		<li>자손이 L4 유충 단계(15°C에서 96시간 또는 25°C에서 36시간)에 도달할 때까지 15-25°C의 지렁이 인큐베이터에서 동물을 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 형질전환 웜의 UV 조사 및 회수
<ol>
	<li>벌레 조사:
		<ol>
			<li>30-100마리의 형광 형질전환 L4 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다(플레이트당 15-20</li>마리).
			<li>뚜껑을 제거한 상태로 플레이트를 UV 가교기에 놓습니다. 0.012 J/cm2에서 벌레를 조사합니다. 변형률은 UV에 다소 민감하며 결과는 사용된 UV 조사기에 따라 달라질 수 있습니다. 0.010-0.015 J / cm2 사이의 선량 범위를 테스트 할 수 있습니다.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>방사선 조사 후 웜 복구:
	<ol>
		<li>방사선 조사된 벌레가 담긴 플레이트를 15°C에서 밤새 회복을 위해 놓습니다.</li>
		<li>살아 있는 동물의 수를 확인하십시오. 우리 손에서는 약 80-90%의 생존율이 효율적인 방사선 조사에 적합합니다.</li>
		<li>자손이 1.2단계에서 확립된 바와 같이 coinjection marker 발현을 관찰할 수 있는 발달 단계에 도달할 때까지 방사선 조사된 동물을 15-25°C에서 성장시킵니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 통합 형질전환 라인의 분리
<ol>
	<li>F1 동물 선택:
		<ol>
			<li>150-200마리의 형광 F1 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다. 고투과율 라인(≥80%)의 경우 100마리의 F1 동물로 충분합니다.</li>
			<li>자손이 형광 F2 동물을 관찰하기에 적합한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트를 15-25°C로 유지하십시오.</li>
			<li>i) F1 동물이 불임 또는 죽었음을 나타내는 자손이 없거나, ii) F1 동물이 예상된 속도로 전이유전자를 전달하지 않았음을 나타내는 형광 F2 동물이 없거나 적음을 나타내는 모든 F1 플레이트를 폐기합니다. 이 단계는 빠르며 ≥75%의 형광 자손을 나타내는 F1 플레이트를 선택하기 위해 형광 F2 웜의 비율을 추정해야 하는 표준 프로토콜과 비교할 때 실질적인 이점을 나타냅니다(표 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>F2 동물 선택:
		<ol>
			<li>선택한 각 F1 플레이트에서 4개의 형광 형질전환 F2 동물을 단일화합니다. 형광 전이유전자(예: mCherry8, gfp9 또는 dsRed10)를 사용하는 경우, 이러한 동물이 통합 어레이에 대해 동형접합적임을 나타낼 수 있으므로 형광 수준이 높은 F2 웜을 선택합니다. F2 동물을 선택할 때 다음 단계에서 거짓 부정을 피하기 위해 알이나 유충을 가지고 다니지 않는 것이 중요합니다.</li>
			<li>15-25 °C에서 F2 동물을 성장시킵니다.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>통합 형질전환 균주의 분리 및 검증:
		<ol>
			<li>F2 플레이트에서 100% 형광 형질전환 F3 웜을 스크리닝합니다. 단일 비형광 웜의 존재는 플레이트를 버려야 함을 나타내기 때문에 화면은 매우 빠릅니다. 통합 전이유전자에 대한 F2 동물 동형접합은 100% 동형접합 형광 자손을 제공합니다.</li>
			<li>전이유전자의 100% 유전을 확인하기 위해 선택된 플레이트에서 8개의 형광 F3 동물을 선별합니다. 이론적으로 이 단계에서는 한 마리의 동물을 선택하는 것으로 충분합니다. 그러나 방사선 조사는 벌레 생리학에 중요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이를 무작위로 유도할 수 있으므로 수정이 불가능하거나 건강하지 않은 동물을 선택하지 않기 위해 8마리의 형광 F3 동물을 선택하는 것이 필요할 수 있습니다.</li>
			<li>가능한 경우 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 균주, 즉 다른 F1 동물에서 회수된 균주를 유지하십시오.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 염색체외 형질전환 어레이를 C. elegans 의 게놈에 통합하는 효율적인 방법을 제공합니다. 동일한 이식유전자 Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45)를 서로 다른 속도(10-15%, 50-60% 및 >80%)로 전달한 서로 다른 비통합계통을 사용하여 UV 조사 후 회수된 통합 균주의 수가 비통합계통의 초기 전송 수준에 의존한다는 것을 보여주었습니다(표 2). 따라서 이식유전자는 높은 전염률을 나타내는 계통에 통합하기가 더 쉽습니다.
통합 이식유전자는 유전자 조절 및 유전자 발현 패턴과 관련된 연구를 포함하여 광범위한 목적에 관심이 있습니다. 통합 이식유전자는 형광 세포 내 마커를 설정하는 데 유용한 도구이기도 합니다. 이식유전자를 통합할 때 여러 개의 독립적인 계통을 분리하는 것이 중요할 수 있습니다. 여러 연구에서는 다양한 유전적 배경에서 이식유전자를 도입해야 합니다. 그러나 이...

전이유전자는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 광범위한 응용 분야에 광범위하게 사용됩니다. 형질전환 균주는 일반적으로 세포융합 자웅동체 생식선1,2에 DNA를 주입하여 생성됩니다. 관심 전이유전자를 운반하는 DNA는 coinjection marker1,3,4를 인코딩하는 플라스미드와 함께 coinjection됩니다. Coinjection marker는 형광 단백질의 발현 또는 특정 행동 또는 형태학적 표현형으로 이어지는 확립된 전이유전자입니다. 주입된 DNA는 다중 복제 염색체외 배열을 형성하기 위해 재배열됩니다. 따라서 관심있는 transgene 및 coinjection marker는 함께 전달됩니다5,4. 형질전환 라인은 coinjection marker(형광 또는 특정 표현형)의 발현에 의해 유도된 표현형을 따라 주입된 동물의 F2 세대에서 선택됩니다1. 형질전환 라인은 염색체 외 어레이의 차세대로의 부분 및 가변 투과 속도를 나타냅니다. 균주에 따라 동물의 10-100%(100%는 드문 경우)가 염색체 외 배열을 물려받습니다. 또한, 형질전환 동물은 모자이크이며 다양한 수의 세포에서 전이유전자를 발현합니다. 이 모자이크주의는 다음 세대로의 전염 속도와 상관관계가 있을 수 있습니다. 실제로, 생식세포와 체세포(somatic cell) 모두에서 전염 속도는 세포 분열 중 염색체 외 배열(extrachromosomal arrays)의 분리에 따라 달라집니다. 이 문제를 피하는 한 가지 방법은 전이유전자를 게놈에 통합하는 것입니다. 고전적으로, 염색체에 형질전환 유전자를 통합하는 것은 염색체 외 배열을 운반하는 형질전환 벌레의 방사선 조사(자외선 또는 감마)에 의존합니다3. 간단히 말해서, 50-100 마리의 자웅동체 동물이 L4 유충 단계에서 방사선 조사됩니다. F1 세대에서는 200-800마리의 형질전환 동물을 선택하여 플레이트에 개별적으로 배양합니다. 멘델의 분리(Mendelian segregation)에 따르면, 전이유전자의 이형접합적 통합을 게놈에 운반하는 형질전환 F1 동물은 통합 배열에 대해 이형접합적(heterozygous)인 형질전환 후손의 1/2, 통합 배열에 대해 동형접합적(homozygous)인 형질전환 후손의 1/4, 배열을 통합하지 않은 자손의 1/4을 생산할 수 있습니다(그림 1). 따라서, F2 세대를 포함하는 플레이트는 coinjection 마커의 발현에 의해 관찰된 바와 같이 ≥75% 형질전환 동물에 대해 육안으로 스크리닝됩니다. 통합 후보로 선정된 F2 동물의 약 1/3은 통합 배열에 대해 동형접합적이며, 100% 동형접합적 F3 동물을 생산하는 것으로 가정됩니다. 따라서, 선택된 각 플레이트에서 3-8개의 형질전환 F2 동물을 개별적으로 배양하고 100% 형질전환 후손을 가진 플레이트를 선택합니다. 다음으로, 8마리의 F3 동물을 개별적으로 배양하여 전이유전자의 100% 유전을 확인합니다.
이 방법의 주요 단점은 다음과 같습니다.
<ol 유형 = "i">
	<li>≥75%의 형질전환 F2 자손을 위해 수백 개의 F1 플레이트의 시각적 스크리닝이 필요하며, 이는 비통합형 염색체 외 어레이의 가변적이고 예측할 수 없는 전달 비율로 인해 시간이 많이 걸립니다. 대안적으로, F1 플레이트의 스크리닝을 피하기 위해, P0 동물의 방사선 조사 후에 몇 가지 후속 기아 단계를 수행할 수 있습니다. 그 후 100마리의 형질전환 동물을 선택하고 100% 형질전환 자손을 선별합니다3.</li>
	<li>60% 이상의 염색체 외 어레이 투과 비율을 나타내는 균주에는 적용되지 않는데, 이 비율은 이 비율을 75%와 구별하기 어렵기 때문입니다.</li>
	<li>상대적으로 낮은 투과 속도를 가진 균주만 사용할 수 있기 때문에 많은 수의 방사선 조사된 형질전환 P0 동물과 수많은 F1 및 F2 동물의 관찰이 필요하며, 이는 시간이 많이 걸리고 상당한 수의 플레이트를 필요로 합니다.</li>
</ol>
벌레의 방사선 조사는 아마도 DNA에 이중 가닥 절단을 유도하고 DNA 복구 중에 염색체 외 배열의 염색체 내 통합이 발생합니다. 따라서, 성공적인 방사선 조사 매개 통합을 얻을 수 있는 기회는 염색체 외 배열을 운반하는 생식선 세포의 수에 정비례할 가능성이 높습니다. 투과율이 높은 균주는2에서 제안된 바와 같이 투과율이 낮은 균주보다 더 많은 형질전환 DNA 어레이를 포함할 수 있으며, 염색체 외 어레이를 운반하는 생식세포 수가 더 많습니다. 따라서, 우리는 투과율이 높은 라인에서 전이유전자가 투과 속도가 낮은 라인보다 통합이 더 쉬울 수 있다고 추론했습니다. 그러나 표준 프로토콜은 통합되지 않은 염색체 외 배열을 가진 형질전환 동물의 비율이 전이유전자의 이형접합적 유전체 통합을 가진 F1 동물의 자손의 비율과 거의 구별될 수 없기 때문에 높은 전달 빈도를 가진 전이유전자를 통합할 가능성을 배제합니다(그림 1).
여기서 우리는 특정 전이유전자의 경우, 자외선(UV) 광선을 조사한 후 회복된 적분선의 수가 비적분적 어레이의 초기 투과 비율에 따라 달라진다는 것을 보여줍니다. 당사는 UV 방사선 매개 전이유전자 통합을 위한 개선된 프로토콜을 제시하며, 이는 특히 높은 전이유전자 어레이 전달률을 보이는 라인과 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NGM(선충 성장 배지) 준비용</td> <td>Agar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td>(6,7)</tr><tr><td>NGM 준비용</td><td></td> <td>NaCl Chimie-Plus</td><td>40045</td></tr><tr>, <td>NGM 준비용</td><td>Bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211820</td></tr>, <tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904-1</td>, <td>NGM 준비용</td></tr><tr><td>K2HPO용4</td><td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>NGM 준비용</td></tr><tr><td>MgSO4</</td><td>sub>Roth</td><td>NGM 준비용</td><td>P027.2</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Prolabo</td><td>22317.297</td><td>NGM</td></tr><tr><td>준비용</td><td>콜레스테롤</td><td>렉타푸르</td><td></td></tr><tr><td>LB-broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>OP50 배양 박테리아</td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U.V. cross-linker</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>파장 254nm</td></tr><tr><td>현미경 SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>플라티늄 와이어 0.25mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>7440-06-4</td><td>벌레를 고르기 위해 (7)</td></tr></tbody></table>

높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Caenorhabditis elegans의 세포융합 생식선의 세포질에 DNA를 미세주입하는 것은 염색체 외 배열의 부분 및 가변 투과 속도를 다음 세대로 나타내는 형질전환 계통을 설정하는 데 사용되는 주요 기술입니다. 또한, 형질전환 동물은 모자이크이며 다양한 수의 세포에서 전이유전자를 발현합니다. 염색체 외 어레이는 UV 조사를 사용하여 C. elegans 게놈에 통합되어 전이유전자의 100% 투과율을 가진 비모자이크 형질전환 균주를 확립할 수 있습니다. 그 정도까지, 자외선에 조사된 형질전환 동물의 F1 자손은 전이유전자의 이형접합적 통합을 가진 동물에 대해 스크리닝되며, 이는 F2 자손으로의 75%의 멘델식 전염률로 이어집니다. 이 방법의 과제 중 하나는 전(X% 형질전환 동물)과 통합 후(≥75% 형질전환 F2 동물) 집단 내 형질전환 유전자 전달의 비율을 구별하는 것입니다. 따라서 이 방법은 멘델 분리(Mendelian segregation)인 75%보다 현저히 낮은 형질전환 동물의 비율을 가진 통합되지 않은 형질전환 계통을 선택해야 합니다. 결과적으로, 차세대로의 염색체 외 어레이 투과율≤60%)을 가진 비통합형 형질전환 라인이 일반적으로 통합에 선호되며, 전달량이 높은 균주에서 전이유전자 통합은 어렵습니다. 여기에서 우리는 투과율이 높은 형질전환 라인(≥80%)을 사용할 때 게놈에 대한 염색체 외 배열의 통합의 효율성이 증가한다는 것을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 높은 염색체 외 어레이 전달률을 나타내는 형질전환 웜의 UV 조사 후 게놈에 동형접합 전이유전자가 통합된 여러 독립적인 라인을 쉽게 선택할 수 있도록 합니다. 또한 이 방법은 매우 빠르고 재료 소비가 적습니다. 특정 통합 전이유전자를 발현하는 다양한 라인을 빠르게 생성할 수 있는 가능성은 유전자 발현 패턴 및 조절, 단백질 국소화 및 과발현에 초점을 맞춘 연구뿐만 아니라 세포 내 마커의 개발에 큰 관심을 끌고 있습니다.

약 50-60%의 동일한 빈도로 염색체 외 어레이를 전달하는 두 가지 서로 다른 라인의 트랜스진 통합을 표준 프로토콜과 개선된 프로토콜을 사용하여 수행하였습니다(표 1). 표준 프로토콜의 경우 91마리의 형질전환 L4 동물을 UV 조사한 후 3개의 독립적인 통합 라인을 회복할 수 있었으며, 개선된 프로토콜에서는 30마리의 형질전환 L4 동물을 UV 조사한 후 1개의 통합 라인을 회복할 수 있었습니다. 이는 두 프로토콜의 통합 효율이 유사함(조사된 L4 동물 30마리당 통합 라인 1개)을 시사합니다. 그러나 동일한 트랜스진의 통합을 비교했을 때 한 프로토콜이 다른 프로토콜보다 더 효율적일 가능성을 배제할 수는 없습니다. 두 프로토콜의 주요 차이점은 개선된 방법에서는 형광 자손이 나타나는 모든 F1 플레이트를 형광 F2 동물의 비율에 관계없이 선택한 반면, 표준 방법에서는 F1 플레이트를 육안으로 스크리닝하여 형질전환 F2 자손이 ≥75%인 플레이트만 선택했다는 점입니다. 이러한 스크리닝 단계는 특히 ...

이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 염색체 외 배열을 Caenorhabditis elegans 게놈에 통합하기 위한 빠르고 낮은 재료 소모 절차를 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 염색체 외 어레이를 높은 비율로 전송하는 형질전환 라인에 특히 적합합니다.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

이 절차의 전반적인 목적은 자외선 조사를 이용하여 형질전환 외염색체 어레이를 C. elegans 게놈에 통합하는 것입니다. 먼저, 가급적이면 80% 이상의 가장 높은 전달률을 보이는 형질전환 라인을 선택하십시오. 그다음, 선택한 형질전환 L4 유충에 UV를 조사하고, 선택된 각 F1 플레이트에서 형광 형질전환 F2 개체를 4마리씩 선별하십시오. 마지막으로, F2 플레이트를 스크리닝하여 100% 형광 형질전환 개체를 확인하십시오.F3 세대 벌레를 확인합니다. 최종적으로 F3 세대에서 형광성 개체를 선택함으로써 트랜스진(transgene)의 100% 유전 가능성을 확인할 수 있습니다. 이러한 실험적 접근 방식은 추가 염색체 배열을 높은 비율로 전달하는 형질전환 라인에 매우 적합합니다.실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Stephanie Belman이 진행하겠습니다. 선충 성장 배지가 담긴 커다란 Petri dish 500개로 시작하십시오. 각 플레이트에 포화 상태의 isia coli 0.3 milliliters를 접종하십시오.OP 50 배양액. 각 형질전환 라인에 대해 통합될 형질전환 라인의 전달률을 평가합니다. 형광 입체 현미경 하에서 형광을 띠는 성체 10마리를 선정하여 10개의 개별 배양 플레이트에 분리하여 접종합니다.유전적 배경의 번식에 적합한 온도로 설정된 선충 배양기에 동물들을 넣습니다. 매일 자손을 관찰하여 공동 주입 마커가 어느 발달 단계에서 발현되며, 형광 현미경을 통해 가장 잘 관찰되는지 평가합니다. 형광성 자손의 비율을 결정하여 자손의 전달률을 평가합니다.트랜스지 알 수용을 위해 전달률이 가장 높은 형질전환 라인을 선택하십시오. L4 유충 단계에서 동기화된 형질전환 동물 집단을 확보하십시오. 통합을 위해 30마리의 형광 GRA 성체를 5개의 배양 플레이트에 분주하십시오.벌레들이 15 °C에서 3~4시간 동안 알을 낳은 후, 플레이트당 최소 30개의 알이 있는지 확인하고 플레이트에서 성체를 제거합니다. 자손이 L4 유충 단계에 도달할 때까지 웜 인큐베이터에서 배양합니다. 15~20마리의 형광 형질전환 L4 동물이 포함된 각 플레이트의 뚜껑을 제거하고 UV crosslinker에 넣은 후, 회복을 위해 벌레들을 조사합니다. 조사된 벌레들을 15 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.현재 살아있는 동물의 수를 확인하십시오. 효율적인 조사를 위해서는 약 80에서 90%의 생존율이 적당합니다. 공동 주입 마커 발현을 관찰할 수 있는 발달 단계에 도달할 때까지 조사된 동물을 15 to 25 °C에서 배양하십시오.개별 형광 F1 개체들을 각각 별도의 배양 플레이트로 옮깁니다. 사용된 공통 마커에 따라 형광 F2 개체를 관찰하기에 적절한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트들을 15~25°C에서 유지합니다. 본 사례에서는 성체 단계에서 웜을 관찰하였습니다. 자손이 하나뿐이거나 없는 경우(F1 개체가 불임이었거나 사망했음을 나타냄), 또는 형광 F2 개체가 없거나 극소수인 경우(F1 개체가 예상된 비율로 트랜스진을 전달하지 않았음을 나타냄)의 모든 F1 플레이트는 폐기합니다.선택된 각 F1 플레이트에서 네 마리의 형광 트랜스제닉 F2 개체를 분리합니다. 형광 트랜스진을 사용하는 경우, 형광 수준이 높은 F2 웜을 선택하십시오. 이는 해당 개체가 삽입된 어레이에 대해 동형 접합성(homozygous)임을 나타낼 수 있기 때문입니다. F2 개체를 선택할 때, 다음 단계에서 위음성(false negative)이 발생하는 것을 방지하기 위해 알이나 유충이 함께 옮겨지지 않도록 하는 것이 중요합니다.F2 세대 동물들을 배양한 후, F2 플레이트를 스크리닝하여 100% 형광을 띠는 형질전환 F3 웜을 선별합니다. 단 한 마리의 비형광 웜이라도 발견되면 해당 플레이트는 폐기해야 하므로 스크리닝 과정은 매우 빠르게 진행됩니다. 선택된 플레이트에서 형광을 띠는 F3 동물 8마리를 개별 분리하여 형질전환 유전자가 100% 유전되었는지 확인합니다. 가능하다면 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 계통을 유지하십시오.약간 동일한 빈도로 추가 염색체 어레이(extra chromosomal arrays)를 전달하는 두 가지 서로 다른 라인에서 외래 유전자 삽입을 수행하였습니다. 표준 프로토콜과 개선된 프로토콜을 사용하여 비교한 결과, 삽입된 라인당 필요한 시간과 플레이트 수가 개선된 프로토콜에서 최적화되었습니다. 다음으로, 비삽입 라인에서 외래 유전자 전달률이 높을수록 유전체 내로의 외래 유전자 삽입이 더 쉬워진다는 가설을 검증하였습니다.최고 전달률을 보이는 라인을 위해 개선된 프로토콜을 사용하여, 서로 다른 전달률로 유전되는 라인들에 특정 외래 유전자를 삽입하였습니다. 90마리의 선별된 F1 동물로부터 3개의 삽입 라인을 회수했으며, 50~60%의 전달률을 보이는 형질전환 라인에서는 110마리의 선별된 F1 동물로부터 1개의 삽입 라인을 회수하였습니다. 이 절차 이후에 유전자 발현, 패턴 및 조절 결정, 단백질 국소화 및 단백질 과발현, 또는 세포 소기관 마커 개발과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다양한 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

C. elegans 게놈에 높은 전송률을 가진 염색체외 어레이를 통합하기 위한 신속한 프로토콜

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

Microarray 분석은 유전자 표현의 프로필을 결정하기 위해...

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

여기에 장기 후각 적응의 분자 기록을...

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

이 비디오는 PCR 스크리닝을 통해 단일 선충에서 유전자 마커를 빠르게 스크리닝하는 기술을 설명합니다. 예시 프로토콜에서는 CRISPR 기반 게놈 편집을 스크리닝합니다.

Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

전이유전자의 미세주입은 일반적으로 큰 염색체 외 배열을 가진 C. elegans 균주를 초래하며, 이는 전이유전자의 다양한 발현 및 전달을 초래합니다. UV 방사선 조사는 어레이의 염색체 통합과 보다 안정적인 전이유전자 전달을 유도할 수 있습니다.

UV 조사: 염색체 외 배열을 통합하는 방법

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기에 제시된 것은 시판되는 조직 키트를 사용하여 하나 또는 몇몇 동물로부터 예 쁜꼬마선충 게놈 DNA의 간단하고 비교적 신속한 분리에 대한 설명이다. 생성된 gDNA 제제는 PCR에 적합한 주형이다.

Caenorhabditis elegans Genomic DNA의 소규모 추출

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에서 감수분열 동안 교차 빈도 및 분포를 측정하는 방법을 제공합니다. 염색체의 기원을 결정하기 위해 Real-time PCR을 사용한 single-nucleotide polymorphism genotyping을 사용했습니다. 4점 매핑을 통해 각 염색체의 왼쪽, 중앙 및 오른쪽 팔 영역의 교차 분포를 결정할 수 있었습니다. ...

Real-time PCR을 이용한 SNP 유전형 분석에 의한 Caenorhabditis elegans 감수분열의 교차 빈도 및 분포

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

Caenorhabditis elegans 생식계통에서 동형접합 노크인 라인을 얻기 위한 CRISPR/Cas9 미세 주입 워크플로우.

카에노르랍디티스 엘레간스에서 생식계 특이 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅

학습하세요 Caenorhabditis elegans 게놈에 UV 조사를 이용하여 고전달률 염색체 외 배열을 통합하는 빠른 프로토콜. 이 방법은 안정적인 형질전환 계통 생성에 효과적입니다.

높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

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