높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

이 절차의 전반적인 목적은 자외선 조사를 이용하여 형질전환 외염색체 어레이를 C. elegans 게놈에 통합하는 것입니다. 먼저, 가급적이면 80% 이상의 가장 높은 전달률을 보이는 형질전환 라인을 선택하십시오. 그다음, 선택한 형질전환 L4 유충에 UV를 조사하고, 선택된 각 F1 플레이트에서 형광 형질전환 F2 개체를 4마리씩 선별하십시오. 마지막으로, F2 플레이트를 스크리닝하여 100% 형광 형질전환 개체를 확인하십시오.

F3 세대 벌레를 확인합니다. 최종적으로 F3 세대에서 형광성 개체를 선택함으로써 트랜스진(transgene)의 100% 유전 가능성을 확인할 수 있습니다. 이러한 실험적 접근 방식은 추가 염색체 배열을 높은 비율로 전달하는 형질전환 라인에 매우 적합합니다.

실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Stephanie Belman이 진행하겠습니다. 선충 성장 배지가 담긴 커다란 Petri dish 500개로 시작하십시오. 각 플레이트에 포화 상태의 isia coli 0.3 milliliters를 접종하십시오.

OP 50 배양액. 각 형질전환 라인에 대해 통합될 형질전환 라인의 전달률을 평가합니다. 형광 입체 현미경 하에서 형광을 띠는 성체 10마리를 선정하여 10개의 개별 배양 플레이트에 분리하여 접종합니다.

유전적 배경의 번식에 적합한 온도로 설정된 선충 배양기에 동물들을 넣습니다. 매일 자손을 관찰하여 공동 주입 마커가 어느 발달 단계에서 발현되며, 형광 현미경을 통해 가장 잘 관찰되는지 평가합니다. 형광성 자손의 비율을 결정하여 자손의 전달률을 평가합니다.

트랜스지 알 수용을 위해 전달률이 가장 높은 형질전환 라인을 선택하십시오. L4 유충 단계에서 동기화된 형질전환 동물 집단을 확보하십시오. 통합을 위해 30마리의 형광 GRA 성체를 5개의 배양 플레이트에 분주하십시오.

벌레들이 15 °C에서 3~4시간 동안 알을 낳은 후, 플레이트당 최소 30개의 알이 있는지 확인하고 플레이트에서 성체를 제거합니다. 자손이 L4 유충 단계에 도달할 때까지 웜 인큐베이터에서 배양합니다. 15~20마리의 형광 형질전환 L4 동물이 포함된 각 플레이트의 뚜껑을 제거하고 UV crosslinker에 넣은 후, 회복을 위해 벌레들을 조사합니다. 조사된 벌레들을 15 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

현재 살아있는 동물의 수를 확인하십시오. 효율적인 조사를 위해서는 약 80에서 90%의 생존율이 적당합니다. 공동 주입 마커 발현을 관찰할 수 있는 발달 단계에 도달할 때까지 조사된 동물을 15 to 25 °C에서 배양하십시오.

개별 형광 F1 개체들을 각각 별도의 배양 플레이트로 옮깁니다. 사용된 공통 마커에 따라 형광 F2 개체를 관찰하기에 적절한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트들을 15~25°C에서 유지합니다. 본 사례에서는 성체 단계에서 웜을 관찰하였습니다. 자손이 하나뿐이거나 없는 경우(F1 개체가 불임이었거나 사망했음을 나타냄), 또는 형광 F2 개체가 없거나 극소수인 경우(F1 개체가 예상된 비율로 트랜스진을 전달하지 않았음을 나타냄)의 모든 F1 플레이트는 폐기합니다.

선택된 각 F1 플레이트에서 네 마리의 형광 트랜스제닉 F2 개체를 분리합니다. 형광 트랜스진을 사용하는 경우, 형광 수준이 높은 F2 웜을 선택하십시오. 이는 해당 개체가 삽입된 어레이에 대해 동형 접합성(homozygous)임을 나타낼 수 있기 때문입니다. F2 개체를 선택할 때, 다음 단계에서 위음성(false negative)이 발생하는 것을 방지하기 위해 알이나 유충이 함께 옮겨지지 않도록 하는 것이 중요합니다.

F2 세대 동물들을 배양한 후, F2 플레이트를 스크리닝하여 100% 형광을 띠는 형질전환 F3 웜을 선별합니다. 단 한 마리의 비형광 웜이라도 발견되면 해당 플레이트는 폐기해야 하므로 스크리닝 과정은 매우 빠르게 진행됩니다. 선택된 플레이트에서 형광을 띠는 F3 동물 8마리를 개별 분리하여 형질전환 유전자가 100% 유전되었는지 확인합니다. 가능하다면 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 계통을 유지하십시오.

약간 동일한 빈도로 추가 염색체 어레이(extra chromosomal arrays)를 전달하는 두 가지 서로 다른 라인에서 외래 유전자 삽입을 수행하였습니다. 표준 프로토콜과 개선된 프로토콜을 사용하여 비교한 결과, 삽입된 라인당 필요한 시간과 플레이트 수가 개선된 프로토콜에서 최적화되었습니다. 다음으로, 비삽입 라인에서 외래 유전자 전달률이 높을수록 유전체 내로의 외래 유전자 삽입이 더 쉬워진다는 가설을 검증하였습니다.

최고 전달률을 보이는 라인을 위해 개선된 프로토콜을 사용하여, 서로 다른 전달률로 유전되는 라인들에 특정 외래 유전자를 삽입하였습니다. 90마리의 선별된 F1 동물로부터 3개의 삽입 라인을 회수했으며, 50~60%의 전달률을 보이는 형질전환 라인에서는 110마리의 선별된 F1 동물로부터 1개의 삽입 라인을 회수하였습니다. 이 절차 이후에 유전자 발현, 패턴 및 조절 결정, 단백질 국소화 및 단백질 과발현, 또는 세포 소기관 마커 개발과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다양한 방법을 수행할 수 있습니다.