Name: 표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 학습하세요 척수후각신경절에서 감각신경세포를 퇴행성 염료 표지로 식별하고 패치클램프 전기생리학 및 면역화학을 이용하여 이온 채널을 연구하는 방법을. 이 비침습적 기법은 신경세포 생리학적 특성을 포괄적으로 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 작업은 National Institutes of Health Grant AR059397(KSE)의 지원을 받았습니다.

참고: 모든 동물 작업은 기관 및 동물 관리 지침에 따라 수행되어야 합니다.
1. 동물의 준비와 라벨링
<ol>
	<li>쥐 마취: 케타민(체중 50mg/kg), 자일라진(5mg/kg) 및 아세프로마진(1mg/kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 쥐(일반적으로 150-400g)를 마취합니다. 발을 꼬집어 반사 신경을 확인하고 반응이 없을 때까지 기다립니다. 마취 반응은 동물마다 다르기 때문에 통증 반사를 테스트하여 마취제의 효과를 결정하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>DiI 용액: DiI 분말의 무게를 측정하고 멸균 100% DMSO에 용해시켜 1.5% 용액(15mg/ml)을 얻습니다. 용액을 사용할 때까지 건조한 분위기의 실온에 보관하십시오.</li>
	<li>DiI 주사: 전기 면도기를 사용하여 마취된 쥐의 양쪽 다리에 있는 종아리 부위의 털을 면도합니다.
	<ol>
		<li>1ml 멸균 주사기(11/4 in 27G 바늘)에 200μl의 1.5% DiI 용액을 채웁니다. 각 비복근의 장축과 평행하게 바늘을 천천히 삽입하고 근육에서 물러나지 않고 바늘을 근육에서 천천히 밀어내면서(~10초) 근육에 100μl DiI를 주입합니다.</li>
		<li>근육에서 바늘을 빼내기 전에 주사기 플런저를 뒤로 당겨 염료가 팁에서 더 이상 흐르지 않는지 확인하고 10초 동안 기다린 다음 근육에서 바늘을 빼냅니다. 이 단계는 바늘에서 피부로 DiI가 누출되는 것을 방지하며, 이는 피부 구심성을 표시할 수 있습니다.</li>
		<li>다른 쪽 다리에 대해서도 반복합니다.</li>
		<li>DiI가 근육에서 DRG로 운반되는 데 4-5일이 소요됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 해부 및 신경 세포 격리
<ol>
	<li>솔루션:
	<ol>
		<li>제조업체의 지침에 따라 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)과 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)을 준비하고 여과, 살균 및 4°C에서 보관합니다.</li>
		<li>배양 배지(MEM Plus): 89ml 최소 필수 배지(MEM), 10ml 소 태아 혈청(FBS), 1ml 페니실린-스트렙토마이신 용액을 혼합하고 필터 살균 및 4°C에서 보관합니다.</li>
		<li>폴리리신 용액: 폴리-L-라이신 브롬화 수소 분말(10mg/100ml)을 pH 8.1의 0.1M 붕산나트륨 용액에 용해시키고 필터를 살균하여 -20°C에서 분취액을 보관합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>커버 슬립 코팅
	<ol>
		<li>유리 커버슬립(12mm 라운드)을 70% 에탄올로 3-4시간 동안 세척하고 멸균 배양 후드에서 자연 건조합니다.</li>
		<li>건조된 커버슬립을 폴리리신 용액 O/N에 넣습니다.</li>
		<li>폴리리신 용액에서 제거하고 멸균 증류수로 2회씩 5회 세척하여 과도한 폴리리신을 제거합니다.</li>
		<li>커버 슬립을 분리하고 배양 후드에서 건조시킨 다음 4 oC에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해부를 위한 설정
	<ol>
		<li>얼음 위에 HBSS 10ml가 담긴 비커, 35mm 페트리 접시, 100mm 페트리 접시를 놓습니다.</li>
		<li>효소의 무게를 잰다: 콜라겐분해효소 7mg, DNAse 1mg, 트립신 10mg.</li>
		<li>흔들리는 수조를 37°C로 예열하고 10ml의 EBSS가 들어 있는 15ml 원심분리기 튜브를 수조에 넣어 예열합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해부:
	<ol>
		<li>IACUC 승인 프로토콜에 따라 쥐를 희생시킵니다. Carbon dioxide는 쥐를 안락사시키는 데 사용되었습니다.</li>
		<li>등의 피부를 절개하여 등을 빠르게 제거하고, 더 나은 노출을 위해 척추를 따라 결합 및 근육 조직을 제거하고, 척추의 요추 부분(흉부 부위 끝에서 장골골까지; 그림 1).</li>
		<li>분리된 척추를 100mm 페트리 접시에 넣고 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 식힌 HBSS 용액을 바르고 준비물을 촉촉하고 차갑게 유지합니다.</li>
		<li>척추 측면에서 근육을 자릅니다. 롱거(rongeurs) 또는 가위를 사용하여 등쪽 후판 절제술을 시행하고 DRG를 포함하는 오목부를 둘러싸고 있는 뼈를 부드럽게 제거합니다.</li>
		<li>이 과정에서 얼음처럼 차가운 HBSS(~1ml)를 반복적으로 바릅니다.</li>
		<li>말초 신경과 중추 신경을 절단하여 DRG를 분리합니다(신경절 처리를 용이하게 하기 위해 1-2mm의 신경을 남겨둡니다).</li>
		<li>분리된 DRG를 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 넣습니다.</li>
		<li>모든 L-4 및 L-5 DRG가 분리될 때까지 반복합니다. 흉부 DRG는 DiI 라벨링을 위한 음성 대조군으로 별도로 분리 및 처리할 수 있습니다.</li>
		<li>분리된 DRG가 있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 마이크로 가위와 집게를 사용하여 과도한 신경과 혈관을 제거합니다.</li>
		<li>효소에 더 잘 노출되도록 DRG를 자르되 DRG를 제거하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG 뉴런 해리:
	<ol>
		<li>효소를 따뜻한 EBSS 배지에 추가합니다(수조에 보관). 짧게 흔들어 녹이고 여과하여 살균합니다.</li>
		<li>멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 DRG를 효소 용액에 넣습니다. HBSS는 효소 혼합물을 희석하므로 DRG와 함께 첨가되는 HBSS의 부피를 최소화합니다.플라스크를 95% O2 및 5% CO2로 60초 동안 가스화한 후 플라스크를 단단히 캡핑합니다.</li>
		<li>37°C로 설정된 진탕 수조에서 240rpm에서 60분 동안 플라스크를 배양합니다.</li>
		<li>배양이 끝나면 플라스크를 50x 세게 흔들어 DRG5를 분리합니다.</li>
		<li>멸균 상태에서 플라스크에 MEM Plus 5ml를 첨가하여 효소를 중지합니다.</li>
		<li>플라스크 내용물을 멸균 15ml 원심분리기 튜브에 옮기고 16 x g에서 6분 동안 원심분리기를 가열합니다.</li>
		<li>상층액을 제거하여 버리고 샘플에 MEM Plus 5ml를 추가합니다. 펠릿을 분해하기 위해 피펫으로 부드럽게 분쇄합니다.</li>
		<li>원심분리 단계를 반복하여 상층액을 제거 및 폐기하고 MEM Plus 500μl를 첨가합니다. 1ml 피펫 팁을 피펫에 올려 부드럽게 분쇄하여 세포 현탁액을 만듭니다.</li>
		<li>폴리라이신 코팅된 유리 커버슬립 하나를 빈 멸균 35mm 접시에 넣습니다. 세포 현탁액을 커버슬립 중앙에 한 방울(~50μl) 떨어뜨립니다.</li>
		<li>세포 용액이 소진될 때까지 반복합니다.</li>
		<li>35mm 접시를 37°C 및 5% CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 뉴런이 커버슬립에 부착되도록 합니다.</li>
		<li>각 접시에 2ml의 미디어를 추가하고 인큐베이터로 다시 넣습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 패치 클램프 녹음
<ol>
	<li>녹음을 위한 솔루션: 이 솔루션은 NaV 전류를 기록하기 위한 것입니다. 조성이 다른 용액의 예는 다음 참고 문헌5-7에서 찾을 수 있습니다.
	<ol>
		<li>외부 용액: (mM 단위) 45 NaCl, 100 N-methyl-d-glucamine (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES 및 10 포도당, pH = 7.4 및 삼투압 = 320 mOsm.</li>
		<li>내부 용액: (mM) 104 NMG•Cl, 14 크레아틴•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA 및 0.3 Tris2•GTP(pH 7.4 및 삼투압 = 300 mOsm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이온 전류 측정:
	<ol>
		<li>전극 풀러의 유리 모세관에서 기록 전극을 당기고 마이크로포지를 사용하여 팁을 열 연마합니다. 전극의 저항은 일반적으로 2-3MΩ입니다.</li>
		<li>DiI 표지된 DRG 뉴런을 상피 형광이 있는 현미경과 TRITC 큐브를 사용하여 식별합니다. DiI의 여기 파장은 550nm이고 방출 파장은 570nm입니다.</li>
		<li>유리 전극에 내부 용액(전극 팁의 ~ 1cm만 채워짐)을 채우고 부드럽게 두드려 갇힌 기포를 제거합니다. 전극 홀더에 넣고 미세 조작기를 사용하여 셀로 이동합니다.</li>
		<li>전극이 셀에 닿으면 단단한 밀봉이 형성될 때까지(전극 저항의 증가에 따라 결정됨) 흡입 튜브를 통해 부드럽게 흡입합니다.</li>
		<li>멤브레인 전압을 원하는 유지 전위(일반적으로 -60 - -120mV)로 고정합니다.</li>
		<li>전극 끝의 멤브레인 패치를 제거하기 위해 더 강한 흡입을 가하여 전체 세포 패치 cl을 얻습니다. 전체 셀 구성으로의 전환은 정전 용량 전류의 증가로 전기적으로 관찰됩니다8-10.</li>
		<li>패치 cl의 보상 회로를 사용하여 직렬 저항을 보상합니다.amp 증폭기(최소 80% 보상 사용)8,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 면역세포화학
<ol>
	<li>4% 파라포름알데히드로 커버슬립의 뉴런을 1시간 동안 고정한 다음 2% Tween 20 in phosphate buffered saline(PBS)으로 10분 동안 투과화합니다.</li>
	<li>고정 세포 O/N을 차단 용액(일반 혈청 또는 소 혈청 알부민)과 특정 관심 항원에 결합하기 위해 개발된 항체인 1차 항체를 배양합니다.</li>
	<li>1차 항체가 결핍된 차단 용액에서 뉴런 O/N의 대조군 세트를 배양합니다.</li>
	<li>PBS 버퍼로 커버슬립을 5분 동안 3회 세척한 다음 1% Tween 20으로 각각 5분씩 2회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>적절한 형광 태그가 지정된 2차 항체로 테스트 및 제어 커버슬립을 배양하고, 이 항체는 1차 항체에 결합하여 시각화를 가능하게 합니다.</li>
	<li>PBS 3x로 커버슬립을 5회 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>장착 매체를 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.</li>
	<li>커버슬립 가장자리에 투명 매니큐어를 바르고 제자리에 고정합니다. 건조되면 형광 현미경과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 뉴런을 시각화하고 이미지를 캡처합니다. 
	참고: 이 작업에서는 Nikon 현미경을 NIS-elements BR 3.2 소프트웨어와 함께 사용했습니다. 노출 시간은 제어 슬라이드와 테스트 슬라이드에 대해 최적화되고 동일하게 유지되었습니다.</li>
	<li>ImageJ(rsbweb.nih.gov/ij/index.html)와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 개별 뉴런에서 형광 강도와 세포 크기를 측정합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

삼두근에서 유래한 근육 구심성 신경(예: 비복근)은 운동 압박 반사(EPR)13를 조사하기 위해 여러 연구에서 사용되었습니다. EPR을 매개하는 감각 뉴런을 연구하는 데 대한 관심을 감안할 때 비복근은 염료 주입을 위해 선택되었습니다. DiI는 친유성 특성과 온전한 원형질막을 통한 확산에 의해 뉴런에서 손실되지 않기 때문에 선택되었습니다3,14. 이 방법을 가이드로 사용하여 관심 있는 표적 기관에 염료를 주입하여 신경 포괄하는 구심성 뉴런을 식별할 수 있습니다. 문헌 검색은 최상의 주사 부위와 분리할 DRG를 찾는 데 필요한 정보를 제공합니다 13,15,16.
DiI의 주입은 의도한 조직만 주입하도록 주의해서 이루어져야 합니다. 염료가 조직 내에 잘 분포되어 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 세로 근육 축을 따라 주입하여 근육의 염료 분포를 최적화했습니다. 바늘을 근육에 삽입하고 근육을 따라 바늘을...

Dorsal root ganglia (DRG)는 신체의 여러 부분에 분포하는 구심성 뉴런의 체질(soma)로 구성되어 있으며, 서로 다른 신경 분포 표적을 가진 감각 뉴런을 연구함으로써 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다1. 구심성 뉴런을 분리하고 식별하기 위해 다양한 간접 또는 침습적 방법이 사용됩니다(예: 플루오로골드1과 같은 마커를 신경에 주입, 외과적 방법2로 근육에 염료 주입). 뉴런과 뉴런 관을 표지하는 데 성공적으로 사용된 다양한 염료 중 DiI와 같은 형광 염료는 뉴런 말단의 빠른 흡수, 뉴런의 장기 체류 및 뉴런 간 전달 부족으로 인해 신경 해부학적 추적에 널리 사용됩니다3. DiI로 표지된 구심성 뉴런은 자세한 연구를 위해 형광 현미경을 사용하여 쉽게 시각화할 수 있습니다. 그러나 한 가지 한계는 세포 내 항원결정기(epitopes)를 사용한 면역세포화학(immunocytochemistry)에 필요한 세포 투과화(cell percebilization) 과정에서 DiI과 같은 marker가 세포에서 손실될 수 있다는 것입니다4. 여기에서는 DRG에서 근육 구심성 뉴런을 식별하기 위해 골격근에 주입된 DiI를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한 항체가 세포 내 항원결정기에 접근할 수 있도록 하는 동시에 뉴런에서 DiI을 유지하는 세포 투과화 방법에 대해서도 설명합니다. 우리는 이렇게 식별된 뉴런을 연구하기 위해 패치 클램프 전기생리학과 면역세포화학을 모두 사용하는 방법을 보여주고, 뉴런 흥분성을 제어하는 이온 채널을 연구하는 데 있어 각 기술의 뚜렷한 이점을 설명합니다. 마지막으로, 전기생리학적 데이터의 해석을 방해할 수 있는 잠재적인 문제에 대해 설명합니다. 우리는 이러한 방법을 사용하여 근육 및 피부 구심성 뉴런을 확인하고 이렇게 식별된 뉴런에서 발현되는 전위의존성 나트륨(NaV) 채널을 결정했습니다8. 그러나 이러한 방법은 특정 표적 조직 또는 뇌핵을 신경 분포시키는 뉴런의 식별된 하위 집합을 연구하기 위한 다양한 준비에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 및 1.9</td><td>Alamone Labs, 예루살렘, 이스라엘</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

감각 뉴런은 신체의 여러 부분에서 중추 신경계로 신호를 전달합니다. 이 뉴런의 소마(soma)는 척추를 둘러싸고 있는 등뿌리 신경절(dorsal root ganglia)에 있습니다. 이러한 감각 구심성 뉴런이 발현하는 수용체와 채널을 이해하면 질병에 대한 새로운 치료법으로 이어질 수 있습니다. 첫 번째 단계는 관심 있는 감각 뉴런의 특정 하위 집합을 식별하는 것입니다. 여기에서는 형광 염료 DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)를 사용하여 역행 표지를 통해 근육에 신경을 분포시키는 구심성 뉴런을 식별하는 방법을 설명합니다. 근육 구심성의 흥분에 대한 이온 채널의 기여를 이해하면 말초 혈관 질환 또는 심부전과 같은 특정 질병 상태에 의해 유발되는 과도한 흥분성을 더 잘 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 이러한 뉴런에 의해 발현되는 전압 의존 이온 채널을 식별하기 위해 패치 클램프 전기생리학과 면역세포화학의 두 가지 접근 방식을 사용했습니다. 전기생리학과 약리학적 차단제는 기능적 이온 채널 유형을 식별할 수 있지만, 당사는 특정 차단제를 사용할 수 없는 채널을 식별하고 세포 집단의 이온 채널 분포 패턴을 더 잘 이해하기 위해 면역세포화학을 사용했습니다. 이러한 기술은 특정 신경 세포를 연구하기 위해 신경계의 다른 영역에 적용할 수 있습니다.

여기에 설명된 방법을 사용하여 DRG 내의 근육 구심성 뉴런을 식별하였으며, 이어서 이 뉴런들이 발현하는 전압 개폐성 나트륨 통로(NaV)를 결정하였습니다. DiI로 라벨링된 근육 구심성 뉴런(그림 1C)은 DRG 내 전체 신경세포 집단에서 적은 비율을 차지했으며, 평균 16%(1047개 중 167개)의 신경세포가 표지되었습니다. 정량 분석은 먼저 ImageJ를 사용하여 형광을 측정하고, 강도 데이터의 히스토그램을 작성하여 양성 표지된 신경세포의 임계값을 결정함으로써 수행되었습니다. 임계값은 표지되지 않은 신경세포의 큰 피크에 가우시안 분포를 적합시켜 평균 강도와 표준편차(SD)를 산출함으로써 결정되었습니다.그림 1D). 임계값은 평균 강도에 2배의 표준편차(SD)를 더한 값으로 설정하여, 강도가 &gt; 임계값은 표시된 것으로 나타납니다.11,12 .
전기생리학:
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구심성 감각 뉴런은 주변부에서 중추 신경계로 감각 정보를 알립니다. 특정 구심성 뉴런을 식별하는 것은 그들의 생리학을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 우리는 구심성 뉴런을 식별하기 위한 역행 라벨링 방법을 설명하고, 패치 클램프 전기생리학 및 면역세포화학을 사용하여 이러한 뉴런의 전위의존성 이온 채널을 연구합니다.

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

본 절차의 전반적인 목적은 역행성 염색법을 통해 구심성 뉴런을 식별하고, 패치 클램프 전기생리학 및 면역화학법을 사용하여 이러한 뉴런의 이온 채널을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 표적 조직에 DAI를 주입하여 신경을 지배하는 구심성 뉴런을 염색합니다. 두 번째 단계는 후근 신경절에서 구심성 뉴런을 분리하는 것입니다.다음으로, 표지된 뉴런에 패치 클램프를 적용하여 게이트 제어 이온 통로를 기록하며, 마지막 단계로 면역화학법을 사용하여 표지된 뉴런에서 발현된 이온 통로를 확인합니다. 최종적으로 패치 클램프와 면역화학법을 결합함으로써, 구심성 뉴런 내 이온 통로의 발현 패턴과 기능적 특성을 모두 식별할 수 있습니다. 기존의 다른 방법과 비교하여 이 방법의 주요 장점은 비침습적인 방식이라는 점이며, 사용된 DAI인 DAI I은 뉴런 말단으로의 흡수가 매우 빠른 것으로 알려져 있습니다.뉴런 간 전이의 부재와 우리가 주입한 뉴런 내에서의 장기 유지 능력을 확인합니다. 염색약 주입 절차는 본인과 저희 실험실의 연구 기술자인 Stephanie가 시연하겠습니다. 먼저, 마취된 쥐의 양쪽 다리 종아리 부위 털을 전기 면도기를 사용하여 제모합니다.다음으로, 1 CC 멸균 주사기에 1.5% Dai 용액 200 µL를 채웁니다. 각 위장근의 장축과 평행하게 바늘을 천천히 삽입하고, 바늘을 근육에서 빼내기 전에 100 µL의 dai를 근육 내에 주입합니다. 주사기 플런저를 뒤로 당겨 염료가 팁에서 더 이상 흐르지 않는지 확인합니다.10초 동안 기다린 후 근육에서 바늘을 뽑습니다. 해부를 위한 염료 분포가 이루어지기까지 4~5일이 소요됩니다. 10 milliliters의 HBSS가 담긴 비커, 35 millimeter 페트리 접시 및 100 millimeter 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.다음으로, collagenase 7 mg, DNA 1 mg, trypsin 10 mg을 각각 칭량합니다. 진탕항온수조를 37 °C로 예열하고, 10 mL의 EBSS가 들어있는 15 mL 원심분리 튜브를 수조 내에서 가온합니다. 해부 전 쥐를 안락사시킨 후, 동물의 등 쪽 피부를 빠르게 절개합니다. 그다음, 척추관이 잘 드러나도록 척추를 따라 결합 조직과 근육 조직을 제거합니다.그 후, 척추의 요추 부분을 제거합니다. 다음으로, 분리된 척추를 100 millimeter 페트리 접시에 놓습니다. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 냉각된 HBSS 용액을 가해 준비물이 촉촉하고 차갑게 유지되도록 합니다.척추 기둥 양측의 근육을 절개합니다. 론저(rongeurs) 또는 가위를 사용하여 뼈를 조심스럽게 제거하고 배측 신경절(dorsal root ganglia)이 포함된 함몰 부위를 폐쇄함으로써 배측 척추궁 절제술(dorsal laminectomy)을 수행합니다. 이 과정을 반복하십시오. 이 절차를 수행하는 동안 얼음처럼 차가운 HBSS를 도포합니다.현미경 하에서 말초 신경과 중추 신경을 절단하여 DRG를 분리하며, 이때 신경절의 취급을 용이하게 하기 위해 신경을 1~2mm 정도 남깁니다. 그 다음 분리된 DRG를 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼가 담긴 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 L4 및 L5 DRG가 분리될 때까지 이 절차를 반복합니다.마이크로 가위와 핀셋을 사용하여 불필요한 신경과 혈관을 제거합니다. 효소가 더 잘 작용할 수 있도록 DRG를 절개하되, DRG 뉴런 해리를 위해 DRG의 초(sheath)를 제거하지는 마십시오. 따뜻한 EBSS 배지에 효소를 추가한 후, 볼텍싱하여 녹이고 필터 멸균합니다.다음으로 멸균된 파스퇴르 피펫 팁을 사용하여 모든 DRG를 효소 용액에 넣습니다. 그 후 플라스크를 95% oxygen과 5% CO2로 60초 동안 버블링한 다음 플라스크의 캡을 단단히 닫습니다. 그런 다음 37 °C의 진탕 수조에서 240 RPM으로 60분 동안 플라스크를 배양합니다.배양 종료 후, 멸균 조건에서 DRG를 해리시키기 위해 플라스크를 50회 격렬하게 흔들어 줍니다. 효소 활성을 중단시키기 위해 플라스크에 MEM plus 5 mL를 추가합니다.플라스크의 내용물을 멸균된 15 milliliters 원심분리 튜브로 옮기고, 16 times G에서 6분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상층액을 제거하여 버립니다. 샘플에 5 milliliters의 MEM plus를 추가하고 피펫으로 부드럽게 트리투레이션(tritrate)합니다.펠렛을 분쇄하려면 원심분리 단계를 반복하고, 상층액을 제거하여 버린 후 500 µL의 MEM plus를 추가합니다. 그 다음, 피펫의 1 mL 피펫 팁으로 부드럽게 트리투레이션하여 세포 현탁액을 만듭니다. 그런 다음, 폴리라이신이 코팅된 유리 커버슬립을 빈 멸균 35 mm 디쉬에 넣습니다. 이어서 커버슬립 중앙에 세포 현탁액 한 방울을 떨어뜨립니다.세포 용액이 모두 소진될 때까지 이 과정을 반복합니다. 뉴런이 커버슬립에 부착될 수 있도록 35 mm 디쉬를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 1시간 후, 각 디쉬에 배지 2 mL를 추가로 넣고 패치 클램프 기록을 수행하기 위해 다시 인큐베이터로 옮깁니다.먼저, 에피 형광 현미경을 사용하여 염색된 DRG 뉴런을 확인합니다. 다음으로, 유리 전극에 내부 용액을 채웁니다. 가볍게 두드려 갇혀 있는 기포를 제거합니다.그런 다음 전극을 전극 홀더에 장착합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 세포 쪽으로 내립니다. 전극이 세포에 닿으면, 밀착된 씰이 형성될 때까지 흡입 튜브를 통해 부드럽게 흡입합니다.그 다음 막 전압을 원하는 유지 전위로 고정합니다. 더 강한 흡입력을 가하여 whole cell patch clamp 구성을 형성합니다. whole cell patch clamp 구성이 완료되면, 전극 팁의 막 패치를 제거하고 기록을 시작합니다.본 절차에서는, 4% para formaldehyde를 사용하여 커버스립 위의 뉴런을 1시간 동안 고정합니다. 그런 다음 PBS에 2% tween 20을 첨가한 용액으로 뉴런을 10분 동안 투과화합니다. 이어서, 세포를 블로킹 용액에서 1시간 동안 배양합니다.시험 세포를 블로킹 용액과 1차 항체가 혼합된 용액에서 하룻밤 동안 배양합니다. 대조군 뉴런 세트는 1차 항체 없이 블로킹 용액에서만 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 커버슬립을 PBS 버퍼로 5분씩 3회 세척한 후, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 1% tween 20으로 5분씩 2회 세척합니다.그런 다음, 시각화를 가능하게 하기 위해 1차 항체와 결합하는 적절한 형광 표지 2차 항체와 함께 실험군 및 대조군 커버슬립을 30분 동안 배양합니다. 그 후, 과잉의 2차 항체를 제거하기 위해 PBS로 커버슬립을 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 마운팅 용액을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 마운팅합니다.그 다음, 커버슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 발라 고정합니다. 건조 후, 형광 현미경용 소프트웨어를 사용하여 뉴런을 시각화하고 이미지를 캡처합니다. 이는 위근(gastro muscle)으로의 Dai 주입과 근육에서 DRG로의 역행성 수송을 나타냅니다.여기에서 L4 및 L5 DRG가 표시되어 있습니다. 구심성 뉴런은 명시야 이미지에 나타나 있으며, 이 형광 이미지에서는 하나의 염료로 표지된 근육 구심성 뉴런을 보여줍니다. 이 히스토그램은 감각 뉴런의 DII 형광 강도를 나타냅니다.큰 피크는 라벨링되지 않은 뉴런에서 기인한 것이며, 평균 강도와 표준 편차를 결정하기 위해 가우스 방정식으로 피팅되었습니다. 점선 수직선은 DAI 라벨링의 임계값을 나타냅니다. 히스토그램은 1047개 뉴런의 데이터를 포함하며, 그중 167개가 dai로 라벨링되었습니다.막 전압 제어가 양호한 전형적인 근육 구심성 뉴런입니다. -20, -10 및 0 mV에서의 나트륨 전류가 왼쪽에 표시되어 있으며, 전류-전압 관계가 오른쪽에 표시되어 있습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, DRG를 빠르면서도 조심스럽게 분리하고, 얼음처럼 차가운 HBSS를 사용하여 표본을 반복적으로 습윤하게 유지하는 것이 중요합니다.이 절차를 통해 다른 원심 뉴런을 표지하고 식별함으로써 생리학적 역할을 이해할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

가 동시에 여러 이온 채널을 통해 전류 흐름을 측정하는 기술적인 장애가되며, transmembrane 전류 이후 안목 어떤 부분은 각 채널의 종류에 의한 것입니다. 이 필요를 해결하기 위해,이 방법은 특정 주파수 구성 요소를 사용하여 개별 채널 유형의 IV 곡선을 생성하는 방법을 보여줍니다.

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

여기에서는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 설명합니다. ChR2를 발현하는 뉴런은 청색광에 대한 반응으로 식별됩니다. 이 방법은 표준 세포 외 기록 장비를 사용하며 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 저렴한 대안으로 사용됩니다.

에 가이드 생체 단일 단위 기록

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

장기 특이적 감각 뉴런은 식별하기 어렵습니다. Fast Blue 추적은 세포 분류를 위해 기도에 신경을 분포시키는 노도즈(nodose) 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다. 분류된 노도즈(nodose) 뉴런은 염기서열분석을 위해 고품질 리보핵산(RNA)을 추출하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 기도 특이적 뉴런의 유전자 발현을 측정합니다.

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

신경 막 프로테아좀(NMP)은 최근 체감각 뉴런의 하위 집합에서 촉각, 통증 및 가려움증 인식의 주요 조절자로 확인되었습니다. 이 기사에서는 세포 분류, 전사체 프로파일링 및 배양 기반 면역형광 분석을 사용하여 세포 유형 특이적 NMP 발현 및 기능을 분석하기 위한 강력한 워크플로우를 제시합니다.

체감각 뉴런에서 신경막 프로테아좀의 세포 아형 특이적 분석

학습하세요 척수후각신경절에서 감각신경세포를 퇴행성 염료 표지로 식별하고 패치클램프 전기생리학 및 면역화학을 이용하여 이온 채널을 연구하는 방법을. 이 비침습적 기법은 신경세포 생리학적 특성을 포괄적으로 이해하는 데 도움을 줍니다.

표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

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