표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 역행 염료 라벨링을 통해 구심성 뉴런을 식별하고 패치 클램프 전기생리학 및 면역화학을 사용하여 이러한 뉴런의 이온 채널을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 표적 조직에 DAI를 주입하여 신경 분포 구심성 뉴런을 라벨링함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 등쪽 뿌리 신경절에서 구심성 뉴런을 분리하는 것입니다.

다음으로, 라벨링된 뉴런은 게이트 이온 채널을 기록하기 위해 패치 클램핑되며, 마지막 단계는 면역화학을 사용하여 라벨링된 뉴런에서 발현된 이온 채널을 식별하는 것입니다. 궁극적으로 patch, clamp 및 immunochemistry의 조합을 사용하여 구심성 뉴런에서 이온 채널의 기능적 특성뿐만 아니라 발현 패턴을 식별할 수 있습니다. 다른 기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 비침습적 방법이며 우리가 사용하는 DAI, DAI I은 신경 말단에 의한 빠른 흡수로 알려져 있다는 것입니다.

뉴런 사이의 전달 부족과 우리가 주입하는 뉴런 내의 장기 유지. 절차를 시연하는 것은 저와 우리 실험실의 염료 주입 연구 기술자인 Stephanie가 맡을 것입니다. 먼저 전기 면도기를 사용하여 마취된 쥐의 양쪽 다리에 있는 종아리 부분의 털을 면도합니다.

다음으로, 1CC 멸균 주사기에 200마이크로리터의 1.5%Dai 용액을 채웁니다. 각 위근육의 장축과 평행하게 바늘을 천천히 삽입하고 근육에서 바늘을 빼내기 전에 근육에 100마이크로리터의 다이를 주입합니다. 염료가 팁에서 더 이상 흐르지 않도록 주사기 플런저를 뒤로 당깁니다.

10초 동안 기다렸다가 근육에서 바늘을 빼냅니다. 해부를 위해 염료 분포를 설정하는 데 4-5일이 걸립니다. HBSS 10밀리리터, 35mm 페트리 접시, 100mm 페트리 접시가 담긴 비커를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 콜라겐 분해 효소 7mg, DNA 1mg, 트립신 10mg의 무게를 달아 흔들리는 수조를 섭씨 37도로 예열하고 10ml의 EBSS가 들어 있는 15ml 원심분리기 튜브를 수조에서 예열합니다. 해부 전에 쥐를 안락사시킨 후 동물 등의 피부를 빠르게 잘라냅니다. 그런 다음 더 나은 노출을 위해 척추를 따라 결합 및 근육 조직을 제거합니다.

그런 다음 척추의 요추 부분을 제거합니다. 다음으로, 100mm 페트리 접시에 격리된 척추를 놓습니다. 멸균 목초지 피펫을 사용하여 냉각된 HBSS 용액을 바르고 준비물을 촉촉하고 차갑게 유지합니다.

척추 측면에서 근육을 자릅니다. 룽거(龍花)나 가위를 사용하여 뼈를 부드럽게 제거하고 등뿌리 신경절(dorsal root ganglia)이 있는 오목부를 봉합하여 등쪽 후판 절제술을 시행합니다. 자꾸. 이 과정에서 얼음처럼 차가운 HBSS를 바르십시오.

현미경으로 말초 신경과 중추 신경을 절단하여 DRG를 분리하고 신경절의 처리를 용이하게 하기 위해 1-2mm의 신경을 남겨둡니다. 그런 다음 분리된 DRG를 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액이 들어 있는 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 L 4 및 L 5 DRG가 분리될 때까지 절차를 반복합니다.

마이크로 가위와 집게를 사용하여 과도한 신경과 혈관을 제거하십시오. 효소에 더 잘 노출되도록 DRG를 절단하되 DRG 뉴런 해리를 위해 DRG를 피복하지 마십시오. 효소를 따뜻한 EBSS 매체에 첨가한 다음 와류를 용해하고 여과하여 살균합니다.

다음으로 모든 DRG를 멸균 목초지 파이프 헤드가 있는 효소 용액에 넣습니다. 그 후 플라스크를 95% 산소와 5% CO2로 60초 동안 거품을 일으킨 후 플라스크를 단단히 닫습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 진탕 수조에서 240RPM으로 60분 동안 플라스크를 배양합니다.

배양의 끝에, 격렬하게. 플라스크를 50회 흔들어 멸균 조건에서 DRG를 해리합니다. 플라스크에 MEM plus 5ml를 첨가하여 효소 활성을 중단합니다.

플라스크 내용물을 멸균 15ml 원심분리 튜브에 옮기고 16배 G로 6분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 버립니다. 샘플에 MEM plus 5ml를 첨가하고 피펫으로 부드럽게 삼중염화합니다.

펠릿 반복 원심분리 단계를 분리하려면 상층액을 제거 및 폐기하고 500마이크로리터의 MEM을 추가하고 피펫에 1밀리리터 피펫 팁으로 부드럽게 삼중화하여 세포 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 폴리리신으로 코팅된 유리 커버 슬립을 비어있는 멸균 35mm 접시에 넣습니다. 그런 다음 커버 슬립의 중앙에 셀 현탁액을 한 방울 떨어뜨립니다.

세포 용액이 소진될 때까지 이 절차를 반복합니다. 35mm 접시를 섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 뉴런이 1시간 후에 입술을 덮는 덮개에 부착되도록 합니다. 각 접시에 2ml의 미디어를 추가로 추가하고 인큐베이터에 다시 넣어 패치 클램프 기록을 수행합니다.

먼저, epi 형광이 있는 현미경을 사용하여 DRG 뉴런으로 표지된 염료를 식별합니다. 다음으로, 유리 전극에 내부 용액을 채웁니다. 부드럽게 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.

그런 다음 전극 홀더에 전극을 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 셀로 내립니다. 전극이 셀에 닿으면 단단히 밀봉될 때까지 흡입 튜브를 통해 부드럽게 흡입합니다.

그런 다음 멤브레인 전압을 원하는 유지 전위로 고정합니다. 더 강한 흡입을 가하여 전체 세포 패치 클램프 구성을 얻습니다. 전극 끝에서 멤브레인 패치를 제거하려면 전체 셀 패치 클램프 구성이 설정되면 기록을 시작합니다.

이 절차에서는 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 커버 슬립의 뉴런을 고정합니다. 그런 다음 10분 동안 PBS에서 2%tween 20으로 뉴런을 퍼밍합니다. 다음으로, 차단 용액에서 세포를 1시간 동안 배양합니다.

테스트 세포는 차단 용액과 1차 항체에서 밤새 배양됩니다. 뉴런의 대조군은 일차 항체 없이 차단 용액에서 밤새 배양하도록 남겨둡니다. 다음 날, PBS 버퍼로 커버 슬립을 각각 5분씩 3회 세척한 다음 1%tween 20으로 각각 5분씩 2회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.

그런 다음 테스트 및 대조군 커버 슬립을 적절한 형광 태그가 지정된 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하고, 이 항체는 1차 항체에 결합하여 시각화를 허용합니다. 그 후, PB S3로 커버 슬립을 각각 5분씩 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다. 그런 다음 장착 매체를 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.

그런 다음 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 바르고 제자리에 고정합니다. 건조되면 뉴런을 시각화하고 형광 현미경과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이것은 위근육으로의 다이 주입과 근육에서 DRG로의 역행 수송을 표현한 것입니다.

L 4 및 L 5 DRG는 여기에 레이블이 지정되어 있습니다. 구심성 뉴런은 명시야 이미지에 표시되며 이 형광 이미지는 근육 구심성 뉴런이라고 표시된 하나의 염료를 보여줍니다. 이 히스토그램은 감각 뉴런의 DII 형광 강도를 보여줍니다.

큰 피크는 레이블이 지정되지 않은 뉴런에서 가져온 것으로, 평균 강도와 표준 편차를 결정하기 위해 가우스 방정식이 피팅됩니다. 파선 수직선은 DAI 라벨링의 임계값을 나타냅니다. 히스토그램은 1047개의 뉴런에서 얻은 데이터로 구성되며, 167개는 dai로 표시됩니다.

다음은 막 전압을 잘 조절하는 대표적인 근육 구심성 뉴런입니다. 마이너스 20, 마이너스 10 및 0 밀리 볼트의 나트륨 전류는 왼쪽에 표시되고 전류 전압 관계는 오른쪽에 표시됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 DRG를 빠르고 부드럽게 해부하고 얼음 코드 hbss에서 준비물을 반복적으로 촉촉하게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다른 원심성 뉴런을 라벨링하고 식별하여 생리학에서 그들의 역할을 이해할 수 있습니다.