Name: 극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 극저온 전자 현미경을 위한 원시 쥐 뉴런 격판덱 준비 방법을. 유리질 얼음 상태에서 신경 돌기의 초미세 구조를 3D로 시각화하여 생리학적 상태에 가까운 형태학적 특성을 평가할 수 있습니다.

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이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다. SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다. 이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.

1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비 <ol><li> 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은&gt; 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 ​​렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데리러 핀셋을 사용합니다. 주의 : 자동 조명 분젠 버너를 두지 마십시오, 이러한 단계를 수행하는 동안 플라스틱 부품에 장갑이나 핀셋을 사용하지 마십시오 : <ol><li> 분젠 버너를 점화하기 전에 최소한의 개방 위치에 공기 및 가스 조정을 설정합니다. </li><li> 스트라이커 부싯돌 또는 부탄 라이터를 사용하여 분젠 버너에 불을. </li><li> 키도 크고, 밝은 블루 / 바이올렛 불꽃 내 작은 파란색 내부 불꽃을 달성하기 위해 공기 및 가스 조정을 수정합니다. 내부 불꽃의 끝이 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다. 아래의 손잡이버너의 총신이 공기가 버너 들어가는 양을 조절하기 위해 설정 될 수있는 반면 니스 버너, 가스 버너 튜브들이의 양을 조절한다. 공기 조절 시계 방향으로 돌리면 (보라색 불꽃의 결과로) 공기를 감소하고 반 시계 방향 (노란색 불꽃이 발생) 공기를 증가시킨다. </li><li> 탄소면이 위로 향하도록 두 번 불꽃을 통해 신속하게 전달, EM 그리드를 개최 금속 핀셋 (아무 플라스틱 부품)를 사용. 탄소 측 무광택 (이하 반짝)를 표시하고, 다른 쪽보다 칙칙한 색조의 더 많은 것을 가진 것입니다. </li><li> 즉시 분젠 버너의 10cm 이내에 배치 된 유리 바닥 접시의 중심으로 그리드 (탄소 쪽까지)를 전송합니다. 접시 당 하나의 EM 그리드 (그림 1)를 사용합니다. 만 presterilized하는 유리 바닥 요리, 즉 통해 감마 방사선을 사용합니다. </li></ol></li><li> 여전히 유리 BOTT 내부의 EM 그리드를 유지하는 동안 그리드 무결성 (탄소 구멍 그대로)을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여OM 접시 (오염을 방지하기 위해). 신경과 접촉 할 그리드 또는 아무것도에 어떤 물질을 적용 할 때, 멸균 절차 및 멸균 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 멸균 절차를 사용하여 조직 문화 후드에서, 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 차분히 적절한 코팅 물질의 250 μl를 적용합니다. 적절한 코팅 물질이 전체 EM 그리드를 포함해야합니다. <ol><li> 해마의 신경 세포의 경우, 이전에 19 바와 같이 제조 코팅 물질로서 폴리-L-라이신 (PLL, 1 ㎎ / ㎖)을 사용한다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. 후근 신경절 (DRG) 뉴런의 경우, 다음과 같이 준비, 코팅 물질로 (재료 및 시약의 표 참조) Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용합니다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 주식 병을 녹여4 ℃에서 하룻밤 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물의 </li><li> 차가운 유지 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포 및 얼음에 그들을 유지하여 즉, 솔루션을 만드는 데 사용되는 모든 구성 요소에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물. </li><li> 얼음, 1:20 희석액을 수득 Neurobasal 배지에서 젤라틴이 단백질 혼합물을 희석하면서 (즉 Neurobasal 10 ㎖에 젤라틴 단백질 혼합물의 500 μL 희석). </li><li> 나누기는 1 ㎖ 분량 씩에 젤라틴 단백질 혼합물을 희석하고, 즉시 -20 ℃ 여분의 분량 씩 저장 </li><li> 1.4 절에 설명 된대로, 접시 당, EM 그리드 당 250 μl를 적용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상단에 페트리 접시를 덮고 (해마 시편 하나 PLL과 함께, 또는 DRG 표본의 젤라틴 단백질 혼합물) 배양 조직 문화 후드에서 실온에서 1 시간 동안. </li><li> ASPI(해마 표본에 대한) 모든 PLL 또는 요리에서 (DRG 시편) 젤라틴 단백질 혼합물을 평가. 이를 위해, 조직 배양 후드에서 진공 시스템을 사용한다. 진공 튜브에 부착 된 멸균 피펫 팁을 사용합니다. EM 그리드와의 직접적인 접촉을 피하십시오. </li><li> 주의 깊게 EM 그리드가 완전히 PBS에 포함되도록 각 페트리 접시의 중앙 유리 지역에 EM 그리드에 멸균 PBS (인산염 완충 식염수)의 250 μl를 적용하는 조정 가능한 공기 변위 피펫을 사용합니다. 그런 다음 각 접시에서 PBS를 대기음. 3 회 반복합니다. </li><li> EM 그리드와 함께 요리를 15 분의 조직 문화 후드에서 건조하도록 허용합니다. 그들은 조직 문화 방에있는 광학 현미경으로 검사하여 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 반드시 그리드의 수분 기포가 없는지 확인합니다. 이 경우,주의 깊게 대기음 다음 EM 그리드에이 여분의 수분을 제거한다. 코팅 된 그리드는 신경을 도금 즉시 사용되어야한다. </li></ol> 2. 준비 및 PLEM 그리드에 ating 차 뉴런 <ol><li> 이전 19 설명한 바와 같이, 각각의 세포에 해마 (또는 18 일 된 쥐 배아의 후근 신경절을) 해리 기본 뉴런, 첫 해부를 Trypsinize (2.5 % 트립신을 사용하여) 씹다를 판에. <ol><li> 씹다 특히 화재 연마 팁 유리 피펫을 사용하여, 각각의 세포로 세포의 해리 덩어리를 설명하는 신경 생물 학자에 의해 사용되는 일반적인 용어입니다. 결과는 조심스럽게 천천히 피펫을 (~ 30), 상하, 여러 번 세포를 그리기 및 방출에 의해 달성된다. </li></ol></li><li> 마우스에 대한 더 적합한 제안 효소 (파파인, 콜라게나 / 디스 파제)를 사용하는 대신, 쥐 DRG 뉴런을 분리 (HBSS에) 0.25 % 트립신을 사용하여 메모를 복용 등의 이전에 DRG의 해부 및 세포 분리 (24)에 대해 설명한 절차에 따라 DRG 뉴런. </li><li> (즉 혈구를 사용하여) 절연 뉴런의 수를 계산및 접시 당 50000 세포 / ml의 농도를 달성하기 위해 각 접시에 적용하는 세포의 적절한 부피를 계산하기 위해이 값을 사용한다. 적용 할 수있는 최대 볼륨이 250 μL이다. 이것은 단지 중앙 유리 영역 전체가 아니라 요리를 채우는 것에주의. </li><li> 37 ℃의 CO 2 배양기에서 30 분 동안 접시를 품어 세포를 복구하고 준수 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 EM 그리드 방해가되지 않게주의하면서 각각의 요리에 가온 미디어 1.5 ML를 추가합니다. 미디어 유형은 세포 분류 (해마 또는 DRG)에 의존한다. <ol><li> 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 예열하는 해마의 신경 세포 19 또는 지느러미 루트 신경절 신경 세포 (24), 중 하나에 해당하는 매체를 준비합니다. CO 2 배양기에서 하룻밤 요리를 품어. </li><li> 해마 신경 세포의 경우, 다음날 미디어를 변경합니다. 14 일 동안 이틀 이후 미디어의 절반을 변경합니다. 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게. </리&gt; <li> DRG 뉴런의 경우, 해부 / 도금 다음 날, 항 유사 분열 제 (우리 딘 5&#39; - 플루오로-2&#39;-데 옥시 우리 딘) 개별적으로, 각각 10 mM의 원액을 가진 매체의 신선한 재고를 준비, 최종를 사용 각각 10 μM의 농도. DRG 미디어 (875 μL)의 절반을 제거하고 항 유사 분열 제와 신선한 매체 875 μl를 추가합니다. <ol><li> DRG 뉴런를 들어, 첫 번째 주에 대한 매 2 일, 다른 항 유사 분열 미디어 및 표준 DRG 미디어 사이에 미디어를 변경. 둘째 주 들어 이틀 표준 DRG 미디어를 변경합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. EM 그리드에 신경을 유리화 <ol><li> 극저온에서 금메달 EM 그리드 냉동 및 저장 장비와 모든 재료를 준비 습도 챔버 (17)와 유리화 장치, 액체 질소의 유리화 기계, 긴 평탄 점 핀셋, 듀어 (들)에 대한 좋은 점 전문 핀셋 (LN 2), Coolant 용기, EM 그리드 스토리지 박스, 칼슘 무료 필터 종이. </li><li> 유리화 장치를 시작합니다. 32 ° C.에 100 % 및 온도에 습도를 설정 &quot;콘솔&quot;섹션에서 0 초로에 오점 시간을 설정합니다. 이 유리화 기계의 습도 챔버의 사이드 창을 통해 블로 팅 매뉴얼을 할 수 있습니다. </li><li> 세 논문이 누적되는 등을 레이어드, 장갑 칼슘 무료 필터 용지를 처리​​ 할 수​​ 있습니다. ~ 2cm 긴 0.5 cm 폭 스트립으로 스택을 잘라. 용지 한면이 × 0.5 cm의 얼굴 (그림 2) 0.5 cm가되도록 90 ° 각도를 구부린다. 핀셋을 사용하여, 중간 종이를 제거하고 사용할 때까지 다른 칼슘 무료 필터 종이에 놓습니다. </li><li> 유리화 챔버 내에서 버튼 홀더에 그리드 스토리지 버튼을 놓습니다. 액체 질소를 냉매 용기의 내부 챔버를 입력하고 완전한 증발 될 때까지 기다립니다. 일의 외부 챔버를 채우액체 질소와 E 냉매 용기는 다음 단계로 진행하기 위해 안정적인 온도를 달성 할 때까지. 냉각 된 챔버 내에서 액체 상태로 응축됩니다 고순도 가스 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. </li><li> 바로 인근에 유리화 방에 수송을위한 대형 100mm 폴리스티렌 접시에 인큐베이터에서 접시 (들) 이동하지 않을 경우. 조심스럽게 접시에서 EM 그리드를 선택하는 전문 유리화 핀셋을 사용합니다. 뉴런은 EM 그리드에 성장하는 쪽면에, 위치는 다음 단계에 문제가됩니다. 안전하게 EM 그리드에 핀셋을 잠 핀셋 블랙 슬라이딩 잠금 장치를 사용합니다. </li><li> 유리화 기계 신경 세포가 떨어져 유리화 기계의 사이드 오픈 구멍에서 왼쪽으로 얼굴을 부착되어있는 EM 그리드 등 그 옆에 핀셋을 삽입합니다. 유리화 기계로 전문 족집게 후퇴. </li><li> 해당 홀더에 냉각수 용기를 올려유리화 기계. 그것은 적절한 LN 2와 액체 에탄으로 가득해야합니다. 이 습도 챔버의 하부로 플러시 될 때까지 유리화 기계의 적절한 화면 명령을 이용하여, 상향 냉각제 챔버를 올린다. </li><li> 평탄 점 핀셋, 짧은 쪽 (0.5 센티미터 × 0.5 cm 얼굴) 핀셋에 수직이되도록 필터 종이의 한쪽 끝을 잡고. 이 얼굴 (그림 2B)를 모래 바닥에 EM 그리드와 직접 접촉한다. 조심스럽게 유리화 기계의 습도 챔버의 측면 구멍 (그림 2A)에 종이 필터를 삽입합니다. 안정적으로 10 초 동안 (측면 멀리 표본에서 마주) EM 그리드에 대한 용지를 개최합니다. 이후 용지를 취소하고 즉시 유리화 기계의 자동화를 사용하여 액체 에탄의 표본을 뛰어 동결. </li><li> 조심스럽게 하나의 슬롯 중 하나에 냉동 - 수화 EM 그리드 전송그리드 스토리지 버튼. 요리의 추가 EM 그리드에 대해이 과정을 반복합니다. 이 실험에서 사용 된 EM 그리드 저장 버튼 체류 냉동 - 수화 EM 그리드를 저장할 수있다. </li></ol> 4. 이미지 수집, 처리, 및 주석 <ol><li> 2-D의 전자 현미경 사진 및 / 또는 저용량 조건 극저온 전자 현미경을 사용하여 신경 돌기의 3-D 틸트 시리즈 5를 수집 진행. 2-D 이미지는 3-D 틸트 시리즈 편리하게 얼음 두께 및 가능 영역의 관점에서 그리드의 품질을 평가하도록 하였다. <ol><li> 이 경우, 모든 이미지 / 12 μM 및 4.4의 샘플링 언더 포커스 대상에서 20K 현미경 배율에서 단일 경사 액체 질소 크라이 전사 홀더를 구비 한 200 kV의 전자 현미경에 부착 된 4K X 4K CCD 카메라를 사용하여 수집되었다 픽셀. </li><li> 증분 샘플​​ AL 틸팅 동안 샘플의 3 차원 단층 화상을 얻기 위해서는, 투영 이미지의 시리즈를 취할투과형 전자 현미경 (TEM)의 하나의 축 옹. 틸트 각도와 다른 실험 설정을 감안할 때, 자동으로 틸트 시리즈 5를 수집 사용할 수있는 여러 가지 다른 소프트웨어가있다. 여기에 표시된 3 차원 기울기 시리즈는 ~ 60 E / 2의 누적 복용량을 가진 5 ° 씩 60 ° -60 °의 범위에서 반자동 기울기 시리즈 수집 소프트웨어 (26)를 사용하여 동일한 현미경에 수집되었다. </li></ol></li><li> 앞서 다른 샘플 5,29 대해 기재된 화상 처리 소프트웨어 (21)를 사용하여 신경 돌기의 틸트 시리즈를 재구성. </li><li> 제 단층 화상을 분할하기 이전에 5 바와 같이 3-D 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 표면 모델을 작성하여 신경 돌기의 3-D 기능 색깔 주석. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세한. 그들의 연구는 해마의 신경 돌기를 시각화 크라이 ET의 사용을 개척하고있는 동안 또한, 우리의 연구는 신경 세포의 표본 하나 이상의 유형을 알아내는-ET의 적용 가능성을 탐구한다. 여기, 우리는 EM 최적 얇은 얼음을 달성하기 위해 그들을 모래 바닥, 해마 및 후근 신경절 (DRG) 뉴런 하나와 그리드 준비에 대한 자세한 프로토콜을 설명하고 플 런지 냉동 크라이 ET으로 이미징을. 최적 블롯 시간은, 관통하는 전자 빔을 위해 너무 두꺼운 얼음을...

뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석​​을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다. 기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기반으로합니다. 더욱이, 전자빔 침투, 절편은 1 내지 12 ㎛보다 큰 두께를 나타내는 생물체 또는 세포 돌기 요구된다. 마지막으로, 신경 돌기의 신장 기능의 성가신 정의하고, 개별 슬라이스 특정 데이터 세트의 컬렉션에 조직의 결과를 단면 또는 가공. 비록 극저온-EM위한 냉동 수화 시험편을 구획하는 것이 가능하는, 상기 방법은 압축 ARTIF 도입1 역할을합니다. 최근 몇 년 동안, 연구자들은 EM 그리드 및 플래시 동결 이후 크라이 ET 8,10,18,23를 사용하여 신경 돌기를 시각화하는 액체 에탄을 직접 해마의 신경 세포를 성장하는 방법을 배웠습니다. 그러나, 이러한 연구는 맞춤 장치 10,23, 또는 일상적인 시각화 (8, 18) 얇은만큼 유리 같은 얼음을 생성하는 모래 바닥 단계에 부족 세부 사항을 사용 하나. 예를 들어, 한 연구는 EM 그리드 (10)를 모래 바닥에 대한 30 ~ 40 초를 사용할 것을 권장하지만,이 값은 일반적으로 사용하지 최적화되어 있지만, 사용자 정의 - 만든 플 런지 냉동 장치에 대해 특정입니다. 플 런지 동결하는 샘플을 이전의 습도를 유지하기위한 사용자 정의 만든 장치가 아닌 시중에서 한 17를 사용하여 광범위한 재현성에 대한 장애물을 초래할 수 있습니다. 이 연구는 극저온 ET으로 신경 돌기를 시각화에 획기적인되었지만, 우리는 AP를 탐험 한 단계 더 촬영했습니다신경 세포의 표본 (해마와 후근 신경절 신경 세포)의 다양한 크라이 ET의 plicability. 또한, 우리는 최선과 차선의 결과뿐만 아니라, 하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 이슈를 모두 설명합니다. 네이티브에 가까운 상태로 보존하고 나노 미터 규모로 전체의 신경 돌기를 시각화에 대한 상세한 기술을 정의하는 것은 미세 구조 연구를 수행하기 위해 더 많은 연구에 대한 능력을 향상시킬 것입니다. 이를 위해, 우리는 신경 돌기를 시각화하는 정착, 흠 뉴런을 제조 시판 장비를 이용하여 효율적이고 상세한 프로토콜을 설명한다. 이것은 건강한 신경 돌기의 미세 구조를 자세히 설명하고 구조적 차이가 신경계 질병 모델에 존재하는 것을 이해하기위한 토대를 마련하기 위해 향한 중요한 첫 번째 단계입니다. CRYO-ET는 나노 미터 스케일에서 3-D에 고정되지 않은, 흠없는 신경 돌기의 기능을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 가능한 결코로하게 될 것입니다neuritic 건축 (12)를 정의하는 앞.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 핀셋</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72803-01</td><td>EM 그리드 처리용</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>성장하는 샘플용</td></tr><tr><td>전자 현미경 그리드</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>성장하는 샘플용</td></tr><tr><td>칼슘-프리 여과지</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>블로팅 샘플용</td></tr><tr><td>대형 플랫 포인트 롱 핀셋</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>블로팅 샘플용&nbsp;</td></tr><tr><td>유리화 장치 및 핀셋</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>샘플 냉동</td></tr><tr><td>용 Minigrid 보관 상자</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>EM 그리드 저장용</td></tr><tr><td>극저온 전사 홀더</td><td>Gatan</td><td>626 단일 틸트 액체 질소 극저온 전사 홀더</td><td>이미징 샘플용</td></tr><tr><td>반자동 틸트 시리즈 수집 소프트웨어</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>이미징 샘플용</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>이미지 처리용</td></tr><tr><td>CryoEM</td><td>JEOL, Tokyo</td><td>200-kV JEM2100 <>sub6 전자 현미경</td><td>이미징 샘플용</td></tr><tr><td>4k x 4k CCD 카메라</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>이미징 샘플용</td></tr><tr><td>3D 주석 소프트웨어</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>3D 데이터 처리용</td></tr><tr><td>2D 이미지 디지털 스티칭용</td><td>소프트웨어 Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>2-D 데이터 DMEM</td></tr><tr><td>, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>해마 배양을 위해</td></tr><tr><td>Boric acid Sigma</td><td>Aldrich</td><td>B-0252</td><td>해마 배양을 위해</td></tr><tr><td>테트라보레이트 나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>해마 배양을 위해</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>해마 배양용</td></tr><tr><td>필터 시스템</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>해마 배양용</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>DRG 배양</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>재조합 쥐 b-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>556-NG</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>유리딘</td><td>시그마</td><td>U3003-5G</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>5'-플루오로-2'-데옥시우리딘</td><td>시그마</td><td>F0503-100MG</td><td>DRG 배양용</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>DRG 배양용</td></tr></tbody></table>

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.

이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하는 구멍 투성이의 탄소 필름으로 구성되어있다. 이 구멍은 외부 프로젝트를 신경 돌기있는 비교적 큰, 어두운, 전자 밀도가 높은 물체 (그림 3C)와 같은 신경 세포의 시체를 보여줍니다 4K 배율에서 찍은 저용량 크라이 EM 이미지에 분명하다. 탄소에 구멍 위의 신경 돌기 휴식의 일부는 그림 3C에서 컬러 상자에서 선택하고, 확대 된 그림 3D의 높은 배율 (20K...

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

이 절차의 전반적인 목표는 저온 전자현미경(cryo-electron microscopy)으로 시각화하기에 적합한 방식으로 일차 쥐 신경세포를 배양하는 것입니다. 이를 위해 먼저 일차 신경세포를 플레이팅할 EM 그리드가 포함된 디쉬를 준비합니다. 두 번째 단계는 일차 신경세포를 준비하여 EM 그리드 위에 플레이팅하는 것입니다.다음으로, EM 그리드 상에서 뉴런의 유리화가 수행됩니다. 마지막 단계는 cryo-전자현미경으로 이미지를 수집하고, 이후 후처리 및 어노테이션을 진행하는 것입니다. 최종적으로, cryo-전자현미경 및 토모그래피를 사용하여 냉동 수화 상태에서 뉴라이트의 초미세 구조를 보여줍니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 화학적 고정제 없이 나노미터 해상도로 냉동 수화된 신경돌기의 3D 시각화에 사용할 수 있다는 점입니다. 따라서 천연 상태에 더 가까운 형태학적 특성의 평가를 용이하게 합니다. 금 EM 그리드 상의 holy carbon의 무결성을 검사함으로써 이 절차를 시작하십시오.최소 25배율의 광학 현미경을 사용하여 카본 홀의 98% 이상이 손상되지 않고 온전한지 확인하십시오. 일차 뉴런을 도말하기 위해 분젠 버너로 EM 그리드를 화염 멸균하는 동시에 친수성으로 처리하십시오. 처리 직후 그리드의 카본 면이 위로 향하도록 하여 유리의 중앙으로 옮기십시오.바닥면이 평평한 접시에 접시당 하나의 EM grid를 넣고, 반드시 멸균 처리된 유리 바닥 접시만을 사용하십시오. 그 다음, 조직 배양 후드 내에서 EM grid를 유리 바닥 접시에 둔 상태로 광학 현미경을 사용하여 grid의 무결성을 확인하고, 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 적절한 코팅 물질 250 µL를 도포하십시오. 천천히 그리고 주의 깊게, 적절한 코팅 물질이 전체 EM grid를 완전히 덮도록 하십시오.그 후, 페트리 접시의 뚜껑을 덮고 시료를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 후드 내 진공 튜브에 부착된 멸균 피펫 팁을 사용하여 접시의 폴리올 라이신 혼합물을 모두 흡입하여 제거합니다. 이때 EM 그리드에 직접 닿지 않도록 주의하십시오.그 후, 조절 가능한 공기 치환 피펫을 사용하여 각 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 있는 EM 그리드를 완전히 덮을 수 있도록 멸균 PBS 250 µL를 조심스럽게 도포합니다. 그런 다음 각 접시에서 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이후 이 과정을 세 번 반복합니다.EM 그리드가 담긴 디쉬를 조직 배양 후드 내에서 15분 동안 건조시킵니다. 광학 현미경으로 확인하여 완전히 건조되었는지, 그리드에 수분 방울이 남아 있지 않은지 확인하십시오.그렇지 않은 경우, EM 그리드 옆의 과도한 수분을 제거하기 위해 조심스럽게 흡입하십시오. 코팅된 그리드는 뉴런 도말을 위해 즉시 사용해야 합니다. 이 과정에서는 디시당 50,000 cells/mL의 농도를 달성하기 위해 각 디시에 적절한 세포 부피를 계산하십시오. 도포하는 최대 양은 전체 디시가 아닌 중앙 유리 영역만 채울 수 있도록 250 µL여야 합니다.다음으로, 세포가 회복되고 부착될 수 있도록 디쉬를 37°C의 CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 각 디쉬에 데워진 세포 배지 1.5 mL를 천천히 첨가하며, 해마 뉴런의 경우 EM 그리드에 닿지 않도록 주의합니다. 다음 날 배지를 교체하고, 이후 14일 동안 2일마다 배지의 절반을 교체합니다. 이 과정에서는 습도 챔버가 포함된 유리화 장치, 칼슘 제거 필터 페이퍼, 긴 평면 팁 핀셋 한 쌍, 유리화 장치용 미세 팁 특수 핀셋 한 쌍, 액체 질소 용기, 냉각제 컨테이너, 그리고 EM 그리드 보관 상자를 포함하여 금 EM 그리드를 극저온에서 동결 및 보관하기 위한 장비와 모든 재료를 준비합니다.다음으로 유리화 장치를 켭니다. 습도는 100%, 온도는 32 °C로 설정하십시오. 옵션 섹션에서 블록 시간을 0초로 설정합니다.이를 통해 습도 챔버의 측면 창을 통해 수동으로 블로팅을 수행할 수 있습니다. 그다음 칼슘 제거 필터 페이퍼 3장을 겹칩니다. 겹쳐진 페이퍼를 폭 0.5 centimeter, 길이 약 2 centimeter의 스트립 형태로 자른 후, 페이퍼의 한 섹션이 0.5 centimeter by 0.5 centimeter가 되도록 90도 각도로 굽힙니다.이 섹션은 시료의 블로팅(blotting)에 사용됩니다. 중간의 거름종이를 제거하여 사용 전까지 다른 칼슘 프리(calcium free) 여과지에 놓아둡니다. 그다음, 전용 유리화 핀셋을 사용하여 디시에서 EM 그리드를 조심스럽게 집어 올립니다.뉴런이 성장하고 있는 EM 그리드의 면을 확인하십시오. 이 위치가 다음 단계에서 중요하기 때문입니다. 그런 다음 핀셋의 검은색 슬라이딩 잠금 장치를 사용하여 핀셋을 EM 그리드에 단단히 고정하십시오. 이제 뉴런이 부착된 EM 그리드 면이 왼쪽을 향하고, 유리화 장치 측면의 원형 개구부 반대 방향이 되도록 핀셋을 유리화 장치에 삽입하십시오.그런 다음 EM 그리드를 잡고 있는 핀셋을 유리화 장치 안으로 다시 끌어당깁니다. 이후, 유리화 장치의 적절한 스크린 명령을 사용하여 충분한 양의 LN2와 액체 에탄이 채워진 냉각 용기를 유리화 장치의 적절한 홀더에 배치합니다. 평단면 핀셋을 사용하여 냉각 챔버가 습도 챔버의 바닥면과 일치할 때까지 위로 들어 올립니다.핀셋과 짧은 면이 수직이 되도록 거름종이의 한쪽 가장자리를 잡습니다. 이 면이 블로팅을 위해 EM 그리드와 직접 접촉하게 됩니다. 이제 거름종이를 습도 챔버의 측면 구멍에 조심스럽게 삽입하여 고정합니다. 거름종이를 EM 그리드에 10초 동안 밀착시킨 후, 종이를 버리고 즉시 플런징합니다.유리화 장비의 자동화 기능을 사용하여 액체 에탄에 시편을 급속 동결합니다. 그 후, 동결된 수화 EM 그리드를 그리드 보관함의 슬롯 중 하나로 조심스럽게 옮깁니다. 이것은 쥐 일차 뉴런을 2주 동안 배양한 EM 그리드 중심 영역을 10배 배율로 촬영한 광학 현미경 이미지입니다.뉴런과 그 뉴라이트 돌기가 관찰되는 하늘색 상자를 확대한 모습입니다. 이것은 4K 배율에서 뉴런 세포체로부터 바깥쪽으로 뻗어 나가는 뉴라이트의 전자현미경 사진입니다. 여기서는 파란색 상자를 근접 촬영하여 20K 배율에서 뉴라이트의 내부 특징이 명확하게 보입니다.이 영상은 쥐 해마 신경세포의 일차 배양에서 얻은 신경돌기의 현미경 사진을 3D로 재구성한 스택을 보여줍니다. 이는 토모그래피를 사용하여 촬영되었으며, 이어서 해당하는 3D 컬러 주석이 표시됩니다. 여기 쥐 후근 신경절 축삭을 저온 전자 토모그래피로 수집하여 3D로 재구성한 이미지 스택을 보여주는 또 다른 영상이 있으며, 이어서 해당하는 3D 컬러 주석이 표시됩니다. 또한 20 K 배율로 촬영한 별도의 쥐 후근 신경절 축삭의 2D 저온 전자 현미경(cryo-EM) 이미지 4장을 몽타주로 구성하여 보여줍니다.이 영상을 시청하고 나면, 저온 전자 토모그래피(cryo-electron tomography)를 사용하여 동결 수화 상태의 뉴런을 시각화하는 데 적합하도록 전자 현미경 그리드 위에 일차 뉴런을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

배우세요 극저온 전자 현미경을 위한 원시 쥐 뉴런 격판덱 준비 방법을. 유리질 얼음 상태에서 신경 돌기의 초미세 구조를 3D로 시각화하여 생리학적 상태에 가까운 형태학적 특성을 평가할 수 있습니다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

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