극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

이 절차의 전반적인 목표는 1차 쥐 뉴런을 초저온 전자 현미경으로 시각화하는 데 적합한 방식으로 성장시키는 것입니다. 이것은 먼저 1차 뉴런을 도금하기 위해 EM 그리드가 있는 접시를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 EM 그리드에서 1차 뉴런을 준비하고 플레이트링하는 것입니다.

다음으로, EM 그리드에서 뉴런의 유리화(vitrification)가 수행됩니다. 마지막 단계는 초저온 전자 현미경으로 이미지를 수집한 다음 후처리 및 주석을 추가하는 것입니다. 궁극적으로, 초저온 전자 현미경 및 단층 촬영은 얼어붙은 수화 상태에서 신경돌기의 미세 구조를 보여주는 데 사용됩니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 화학 정착제를 사용하지 않고 나노미터 분해능으로 얼어붙은 수화 신경돌기의 3D 시각화에 사용할 수 있다는 것입니다. 따라서 기본 상태에 더 가까운 형태학적 특성의 평가를 용이하게 합니다. 금 EM 그리드에서 거룩한 탄소의 무결성을 검사하여 이 절차를 시작합니다.

최소 25배 배율의 광학 현미경을 사용하여 탄소 구멍이 손상되지 않은 98% 이상인지 확인하십시오. 1차 뉴런을 도금하기 위해 분젠 버너를 사용하여 EM 그리드를 화염 살균하고 동시에 친수성으로 만듭니다. 즉시 탄소 면이 유리 중앙까지 위로 향하도록 그리드를 옮깁니다.

바닥 접시, 접시당 하나의 EM 그리드를 놓고 미리 살균된 유리 바닥 접시만 사용하십시오. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 그리드 무결성을 확인하면서 조직 배양 후드의 유리 바닥 접시 내부에 EM 그리드를 유지하고 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 적절한 코팅 물질 250마이크로리터를 적용합니다. 천천히 그리고 조심스럽게 적절한 코팅 물질이 전체 E EM 그리드를 덮고 있는지 확인하십시오.

그 후, 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 실온에서 1시간 동안 표본을 배양합니다. 다음으로, 후드의 진공관에 부착된 멸균 피펫 팁으로 접시의 모든 폴리올 라이신 혼합물을 흡인합니다. E EM 그리드와의 직접적인 접촉을 피하십시오.

그런 다음 조절 가능한 공기 변위 피펫을 사용하여 250마이크로리터의 멸균 PBS를 조심스럽게 도포하여 각 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 있는 EM 그리드를 완전히 덮습니다. 그런 다음 각 요리에서 PBS를 흡인합니다. 그 후 절차를 세 번 반복합니다.

EM 그리드가 있는 접시를 조직 배양 후드에서 15분 동안 건조시킵니다. 광학 현미경으로 확인합니다. 완전히 건조되고 그리드에 수분 거품이 없는지 확인하십시오.

그렇지 않으면 EM 그리드 옆에서 조심스럽게 흡인하여 이 여분의 수분을 제거하고 코팅된 그리드를 즉시 사용하여 뉴런을 도금해야 합니다. 이 절차에서는, 50의 농도를 달성하기 위하여 각 접시를 위한 세포의 적합한 양을 산출하십시오, 접시 당 밀리리터 당 000의 세포. 최대 적용량은 전체 접시가 아닌 중앙 유리 영역만 채우기 위해 250마이크로리터여야 합니다.

다음으로, 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 30분 동안 접시를 배양하여 세포가 회복하고 부착될 수 있도록 30분 후에 따뜻하게 한 세포 배지 1.5ml를 각 접시에 천천히 추가하고 해마 뉴런의 EM 그리드를 건드리지 않도록 합니다. 다음 날 미디어를 변경한 다음 14일 동안 2일마다 미디어의 절반을 변경합니다. 이 절차에서는 습도 챔버가 있는 유리화 장치, 칼슘이 없는 여과지, 한 쌍의 긴 플랫 포인트 핀셋, 유리화 기계용 한 쌍의 미세 포인트 특수 핀셋, 액체 질소 doer, 냉각수 용기 및 EM 그리드 보관 상자.

다음으로 유리화 장치를 켭니다. 습도를 100%로 설정하고 온도를 섭씨 32도로 설정합니다. 옵션 섹션에서 블록 시간을 0초로 설정합니다.

이를 통해 습도 챔버의 측면 창을 통해 수동으로 블로팅할 수 있습니다. 그런 다음 칼슘이 없는 여과지 3개를 쌓습니다. 스택을 약 2cm 길이의 0.5cm 너비의 스트립으로 자르고 용지의 한 섹션이 0.5cm x 0.5cm가 되도록 90도 각도로 구부립니다.

이 섹션은 표본을 블로팅하는 데 사용됩니다. 중간 종이를 제거하고 사용할 때까지 다른 칼슘이 없는 여과지 위에 올려 놓습니다. 다음으로, 핀셋에 특수 유리화를 사용하여 접시에서 EM 그리드를 조심스럽게 선택합니다.

뉴런이 성장하고 있는 EM 그리드의 측면을 주목하십시오. 이 위치는 다음 단계에서 중요할 것입니다. 그런 다음 핀셋의 검은색 슬라이딩 잠금 장치를 사용하여 핀셋을 EM 그리드에 단단히 잠급니다. 이제 핀셋을 유리화 기계에 삽입하여 뉴런이 부착된 EM 그리드의 측면이 유리화 기계 측면의 원형 개구부에서 왼쪽을 향하도록 합니다.

그런 다음 EM 그리드를 고정하는 핀셋을 유리화 기계에 집어넣습니다. 그 후, 적절한 LN 2와 액체 에탄으로 채워진 냉각수 용기를 유리화 기계의 적절한 스크린 명령을 사용하여 유리화 기계의 적절한 홀더에 놓습니다. 플랫 포인트 핀셋으로 습도 챔버 바닥과 같은 높이가 될 때까지 냉각수 챔버를 위로 올립니다.

필터 용지의 한쪽 가장자리를 잡고 짧은 면이 핀셋에 수직이 되도록 합니다. 이 면은 블로팅을 위해 EM 그리드와 직접 접촉하게 됩니다. 이제 여과지를 습도 챔버의 측면 구멍에 조심스럽게 삽입하고 용지를 EM 그리드에 10초 동안 대고 용지를 버리고 즉시 뛰어듭니다.

유리화 기계의 자동화를 사용하여 액체 에탄에서 표본을 동결합니다. 그런 다음 동결된 수화 EM 그리드를 그리드 스토리지의 슬롯 중 하나로 조심스럽게 옮깁니다. 이것은 쥐의 1차 뉴런이 2주 동안 성장한 EM 그리드의 중심 영역을 10배 배율로 측정한 광학 현미경 이미지입니다.

다음은 뉴런과 뉴라이트의 돌기가 관찰되는 아쿠아 박스(aqua box)의 확대된 모습입니다. 이것은 4K 배율에서 뉴런체에서 바깥쪽으로 돌출된 신경돌기의 전자 현미경 사진입니다. 파란색 상자는 여기에서 20K 배율에서 신경돌기 내부 특징이 명확하게 보이는 곳에서 자세히 볼

이 비디오는 쥐 해마 뉴런의 1차 배양에서 추출한 신경돌기의 현미경 사진을 3D로 재구성한 것을 보여줍니다. 단층 촬영을 사용하여 이미지화한 다음 해당 3D 색상 주석을 사용합니다. 다음은 초저온 전자 단층촬영을 사용하여 수집된 쥐 등뿌리 신경절 축삭돌기의 3D 재구성 이미지 스택을 보여주는 또 다른 비디오이며, 여기에 표시된 것은 20K 배율로 촬영한 별도의 쥐 등뿌리 신경절 축삭돌기의 4개의 2D cryo-EM 이미지의 몽타주입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 초저온 전자 단층촬영을 사용하여 얼어붙은 수화 상태에서 뉴런을 시각화하는 데 적합한 방식으로 전자 현미경 그리드에서 기본 뉴런을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.