Name: 마이크로 RNA 현장에서 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 포르말린 고정 신장 조직에서 현장 하이브리드화를 이용한 microRNA 발현 정량화 방법을. digoxigenin 표지 프로브와 NBT-BCIP 기질을 사용하여 신장 네프론 세그먼트에서 microRNA 위치를 파란색으로 시각화하고 정량 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다 HL082798 및 HL111580을 부여합니다.

1. 신장 조직 섹션 <ol><li> 포르말린 - 고정 (10 %) 파라핀 신장 섹션 슬라이드 분석 전에 몇 달 동안 저장 될 수 마이크로 미터 HM (355)를 사용하여 S. 5mm 두께로 현미경 슬라이드 상으로 절단된다. </li></ol> 2. 솔루션 준비 <ol><li> 고압 증기 멸균 나사 정상 병에 DDH 2 O에 1X PBS의 1 L를 준비합니다. DDH 2 O 1 L로 다른 병 채우기 각 병, 덮개에 DEPC의 1 ML을 추가하고 격렬하게 흔들어. 솔루션 RNAses을 파괴 한 후 오토 클레이브 실온에서 밤새 앉아 보자. PBS-T 만들기 위해 400 ㎖의 트윈 20 1X PBS의 L 1에 추가합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 K 버퍼 (50 mMTris 염산, pH를 8.0 DEPC에 1 ㎜ 염화칼슘 처리 된 물)을 준비합니다. </li><li> PBS-T에서 0.2 % 글리신의 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 3. 조직 준비 <ol><li> 혼성화 완충액 대량 50 % 포름 아미드로 이루어진 (50 ~ 100 ㎖), 5X SSC, 0.1 % 트윈, 9.2 준비pH가 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 및 DEPC에 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 MM의 구연산은 DDH 2 O를 처리 C. º -80에서 1 ㎖ 분량 씩 분주하여 보관하여 </li><li> 5 분마다 신선한 크실렌의 3 배를 세척하여 조직에서 파라핀을 제거합니다. </li><li> DDH 2 O. 에탄올 농도 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %)를 감소에서 5 분 배양하여 조직 절편을 재수 </li><li> 완전 1 분 동안 조직 절편 (약 0.4 ~ 0.5 ml)에 충당하기에 충분한 DEPC로 슬라이드를 취급한다. 확인 조직은 건조하지 않습니다. </li><li> DEPC의 슬라이드는 적절한 처리에 대한 DEPC 포함 된 폐기물을 수집, 5 분 동안 두 번 PBS-T를 처리 씻어. 모든 시약은 DEPC이 시점에서 RNAses을 제거하는 치료를해야한다. </li><li> Prewarm 테 K 버퍼링 및 10 μg / ML의 최종 농도에 단백질 분해 효소의 K를 추가합니다. 단백질 분해 K 솔루션으로 조직 섹션을 덮고 5 분 동안 37 º C에서 알을 품다. </li><li> 빨리 proteinas 제거전자 K 솔루션 30 초 동안 PBS-T에서 0.2 % 글리신을 추가합니다. </li><li> DEPC에 린스 슬라이드는 30 초마다 두 번 PBS-T를 처리. </li><li> 10 분 동안 갓 4 % 파라 포름 알데히드의 부분을 수정. </li></ol> 4. 이종 교잡 <ol><li> 하이브리드 버퍼의 50 μL (50 % 포름 아미드, 배 SSC, 0.1 % 트윈, pH를 6, 50 ㎍ / ㎖의 헤파린, 500 ㎍ / ㎖의 효모 RNA에 조정을위한 9.2 MM의 구연산) 조직 섹션 당을 추가하고 이는 RNAse 무료 HybriSlips 커버 조직 섹션보다 더 큰 단지 컷. </li><li> 3 &#39;제닌 표지 프로브 (탐침의 보통 DNA TM에 대해 결정 하이브리드의 온도에서 2 시간 동안 습도 제어 하이브리드 오븐에서 Prehybridize 섹션 -21 ° C ~, 미르 - 382에 대한 (즉, 54 ° C는 DNA TM = 75 ° C를 조사 ), 챔버를 유지하기 위해 50 % formamide/50 %의 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 와이프를 사용하여 가습. </li><li> miRNA의 프로브, 양성 대조군 (U6 작은 핵 RNA)과 대조군 (스크램블을 희석하이브리드 버퍼에 40 nm의 순서는 () 버퍼의 75 μL)는 섹션 당 필요합니다. </li><li> 5 분 동안 65 º C에서 혼성화 버퍼 프로브를 가열한다. </li><li> 하이브리드 오븐에서 슬라이드를 제거하고 예비 혼성화에서 커버 슬립 과잉 하이브리드 버퍼를 제거합니다. </li><li> 직접 조직에, 조직 섹션 당 프로브를 포함하는 버퍼의 75 μl를 추가합니다. 조직 섹션을 포함 할 정도로 그냥 큰 HybriSlips과 조직을 커버. </li><li> 슬라이드 홀더 수준을 유지, 4.2 단계 (약 16 시간)의 온도에서 하룻밤 배양을위한 하이브리드 오븐으로 돌아갑니다. </li></ol> 5. 엄격한 세척 <ol><li> 조직에서 커버 슬립을 해제하는 데 도움이 단지 커버 슬립 중 하나 가장자리에서 하이브리드 온도로 가열 200 μL 2X SSC를 추가합니다. 슬라이드를 기울여 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 30 분 각각의 혼성화 온도의 3 배에 50 %의 포름 아미드, 50 % 2X SSC 200 μL에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 헹구기슬라이드는 저속에서 진탕에 5 분 각각 실온에서 PBS-T에서 5 배. </li></ol> 6. 검출 <ol><li> 저속에서 진탕에 실온에서 1 시간 동안 버퍼 (2 % 염소 또는 말 혈청, 2 ㎎ / ㎖ PBS-T에 BSA를) 차단에 슬라이드를 품어. </li><li> 1:100에서 버퍼를 차단하는 안티-DIG-AP Fab 단편을 희석. 조직 섹션 당 100 μl를 추가하고 HybriSlips 커버는 부분을 커버하기에 충분한 단지 큰 잘라. </li><li> 4 ° C 하룻밤 (약 16 시간)에 가습 실에 항체를 품어. </li><li> 낮은 속도로 진탕에 5 분마다, PBS-T 7 배에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 5 분마다, 3 배 (100 ㎜ TrisHCl의 pH 9.5, 50 mM의 MgCl2를 100mm 크기의 NaCl, 0.1 % 트윈 20) AP 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> AP 버퍼에 NBT / BCIP 솔루션을 추가 (200 μl/10 ML 버퍼) </li><li> 완전히 모든 조직 섹션을 포함하는 각각의 슬라이드에 희석 NBT / BCIP 솔루션의 400 ~ 500 ML을 추가합니다. 어두운, 레벨, humidif에 개발4 ~ 5 시간 동안 폭발물 실. </li></ol> 7. 장착 슬라이드 <ol><li> 5 분마다 에탄올 농도 (25 %, 50 %, 75 %, 100 %)을 증가하는 섹션 탈수. </li><li> 섹션을 취소하기 위해 크실렌 배에 품어. </li><li> 마운트 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 설치 매체 건조 하룻밤에 슬라이드. </li></ol>

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<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
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</ol>

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이 문서의 목적은 포르말린 고정 신장 조직에서 잘 작동 현장 하이브리드 화에 miRNA를위한 프로토콜을 설명했다. 이 프로토콜을 작업하는 동안 염색 유물의 몇 가지 중요한 소스가 확인되었습니다. 이러한 점에주의는 염색 유물을 방지하고 성공적인 ISH 실행의 가능성을 높일 수 있습니다. 가 조직 섹션 긴 배양 중에 건조 할 때 염색 유물의 가장 예방 가능한 원인 중 하나가 발생할 수 있습니다. 이 경우 건조되어 조직의 부분은 NBT / BCIP 개발 (그림 1) 동안 매우 어둡게 얼룩 것입니다. 이 프로토콜을 통하여 그 조직 절편이 완전히 모든 배양을 통해와 슬라이드가 완전히 수준 유지되는 액체에 의해 보호 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 조직 절편은 완전히 같은 혼성화 단계만큼 배양 중에 HybriSlips 의해 덮여 및 유지되어야<html> 액체 손실을 방지하기 위해 항체 배양. 조직 절편의 부분 또는 완전 건조가 관찰...

마이크로 RNA는 내생 적으로 생산되는 RNA를 비 암호화 (약 22 뉴클레오티드) 작은 수 있습니다. 그들은 일반적으로 번역 억압 또는 mRNA의 분해를 통해 단백질 발현을 억제하는 기능을한다. 완전 보완와 mRNA의 대상에있는 miRNA 바인딩, 그것이 가능한 하나의 miRNA가 여러 대상을 억제하기 위해 만드는. 세포의 종류와 구조의 miRNAs을 표현 이해 메커니즘을 이해의 중요한 부분 인을 통해 miRNA의 발현에 영향을 미치는 세포와 조직의 표현형의 변화. 이러한 miRNA의 시퀀싱, qPCR에 노던 블로 팅 등의 방법은 전체 조직에서의 miRNA의 검출에 사용 할 수 있지만,이 방법은 하나가 특정 조직 내에서 온 어떤 특정 세포 유형을 결정하는 것을 허용하지 않습니다. 이러한 방법을 사용하여 분석 전에 셀룰러 및 구조 구성 요소의 해부는 매우 어려울 수 있습니다 적절한 아이솔레이션을 달성하기 위해 필요한 조건은 알을 초래할 수 있습니다유전자 발현 또는 RNA를 저하에 terations. 원위치 혼성화에서 마이크로 RNA는 조직에서 마이크로 RNA 위치 및 발현 수준을 가시화하기 위해 사용하는 방법이다. 이 기술은 신장 등 이종 구조, 구성 조직에 특히 유용합니다. 마이크로 RNA는 신장 개발 2,3 생리학 4에서 규정하는 역할을하는 것으로 나타났다. 마이크로 RNA 발현의 변화는 또한 섬유증 5-10, 당뇨병 성 신증 7, 신장 암 11, 12, 급성 신장 손상은 13 신장 병리에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서는 신장 조직에 대한 현장 하이브리드 마이크로 RNA를 최적화하는 것이 건강과 질병 (14) 모두에 miRNA의 표현의 정확한 구조 위치를 결정하기위한 가치있는 것을 발견했다. 다른 마이크로 RNA의 관 및 세포 발현의 결정은 중요하기 때문에 타 자신의 규제rgets는 세포 기능에 의존 할 수있다. 병에 걸린 상태에서 그것은 miRNA의 발현의 변경 기능에 영향을 될 수있는 방법을 결정하는 것도 중요하다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 Kloosterman 등. 15, 16, 17, 다른 연구자에 의해 개발 된 기존 ISH 방법론에 따라 구축 할 수 있었고, 사람들은 Exiqon 1에 의해 제안 된 포르말린 고정 신장 조직하는 방법을 최적화 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 일방적 인 요관 폐색 (18)와 신장 마이크로 RNA 미르 - 382 식의 지역적인 차이를 식별하기 위해이 방법을 사용했습니다. 이러한 접근은 추가적인 최적화뿐만 아니라 다른 조직으로 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>시그마</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>시그마</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>울트라 퓨어</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>수명 Technologies</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>효모 RNA</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>프로테라제 K</td><td>발효</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- miRNA 프로브</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- 스크램블 miR 프로브</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- U6 miR 프로브</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>Fit to tissue size</td><td></td></tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>인슬라이드 아웃 하이브리드화 오븐</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 트레이 어셈블리</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 랙 인서트</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 rna<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

이 문서에서 우리는 마이크로 RNA 프로브를 태그 제닌과 현장 하이브리드 화에를 통해 신장의 miRNA의 비색 검출하는 방법을 설명합니다. 원래 Kloosterman 및 Exiqon miRNA의 프로브 1 폭 넓은 사용을 위해 동료에 의해 ​​개발 된이 프로토콜은, 신장 조직에서의 miRNA 분석에 내재 된 문제를 극복하도록 수정되었습니다. 여기에는 구조 식별 및 잔류 조사 및 항체를 제거하기 어려운 문제가 있습니다. 비교적 얇은 사용, 두께 5mm, 강한 프로브 신호가 세포 내에 유지하면서, 신장 구조의 명확한 시각화를 허용 조직 섹션. 또한, 프로브 농도와 배양 조건은 낮은 배경 및 비특이적 신호 마이크로 RNA 발현의 시각화를 용이하게하기 위해 최적화되었다. 여기서, 최적화 프로토콜은 프로 시저의 끝에서 슬라이드 실장 통해 초기 티슈 콜렉션 및 준비를 덮고, 설명한다. 기본 compone이 프로토콜의 국세청은 다른 조직과 세포 배양 모델 응용 프로그램에 대해 변경 될 수 있습니다.

혼성화, 배양 중에 건조 또는 NBT / BCIP를 개발하는 동안 더 어둡게 염색 결국 전체적으로 같이 세척 될 조직 절편의 영역. 1 HybriSlip가 가장자리 떨어져 미끄러 된 신장 부분의 일부를 보여준다 그것은 부분적으로 탈수가 될 수 있도록 조직. 나머지 단계에서 재수 커버리지에도 불구하고, 탈수 부에서의 신호는 인위적으로 높다. NBT-BCIP 개발 시간을 제어의 중요성은도 2a 및도 2b에 설명되어있다. 신장 (그림 2A)를 통해 스크램블 - 미르 제어 탐색 할 조직의 발음 비특이적 발색에 4 ~ 5 시간의 결과보다 긴 개발 기간. 예 U6 작은 핵 RNA 제어와 같은 높은 풍부 대상, 조사해서 신장, (4-5 시간 이상 더 이상 배양 개선 신호가 발생하지 않는도<html> 우레 2B). <p class="...

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

다음 실험의 전반적인 목표는 신장 조직 내에서 micro RNA 발현 위치를 찾고 이를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 신장 조직 내의 특정 micro RNA에 diggen 및 태그가 부착된 프로브를 하이브리드화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 알칼리성 인산분해효소가 접합된 digogenin 항체를 조직과 함께 배양합니다.다음으로, 하이브리드화된 micro RNA 프로브 부위에서 청색 생성물이 발색되어 micro RNA의 위치를 시각화할 수 있도록 조직에 N-B-T-B-C-I-P 기질을 첨가합니다. 이를 통해 micro RNA 상보적 프로브의 하이브리드화에 기반하여 신장 부위 및 네프론 분절의 어느 곳에서 microRNAs가 발현되는지 보여주는 결과를 얻습니다. 이 절차에는 5 µm 두께로 현미경 슬라이드에 부착된 포르말린 고정 파라핀 매립 신장 절편이 사용됩니다. 분석을 위해 신장 절편을 준비하려면, 먼저 신선한 xylene으로 5분 동안 3회 세척하여 조직에서 파라핀을 제거합니다.이중 증류수가 포함된 단계별로 감소하는 농도의 에탄올 용액에 5분간 담가 각 조직 절편을 재수화합니다. 다음으로, 조직 절편이 완전히 덮일 만큼 충분한 양의 dathyl, percarbonate 또는 desy를 슬라이드에 처리하여 1분간 둡니다. 이때 조직이 마르지 않도록 주의하십시오.데시케이터를 제거하고 슬라이드를 헹굽니다. PBST로 두 번, 각각 5분 동안 처리하십시오. 폐기물이 담긴 데시케이터가 적절한 처리를 위해 수거되었는지 확인하십시오.이 시점부터 모든 시약은 DSY 처리되어야 합니다. RNA를 제거하기 위해, 미리 데워둔 proteinase K 버퍼에 proteinase K를 최종 농도가 10 micrograms per milliliter가 되도록 첨가합니다. 조직 절편을 proteinase K 용액으로 덮고 37 degrees Celsius에서 5분 동안 배양합니다. proteinase K 용액을 빠르게 제거하고 0.2% glycine in PBST를 30초 동안 처리합니다.슬라이드를 Desy 처리된 PBST로 30초씩 두 번 헹굽니다. 마지막으로, 갓 제조한 4% paraformaldehyde에서 조직 절편을 10분 동안 고정합니다.이 절차를 시작하려면, 조직 절편당 50 µL의 hybridization buffer를 첨가하고 조직 절편보다 약간 더 큰 RNA-free hybrid slips로 덮습니다. 50% formamide와 50% 5X SSC에 적신 실험실용 와이프로 습도를 조절한 챔버 안에 슬라이드를 넣습니다. 3' dig oxygen 표지 프로브에 대해 결정된 hybridization 온도에서 2시간 동안 가습 챔버를 오븐에 넣어 조직 절편을 pre-hybridization 시킵니다. 프로브의 hybridization 온도는 일반적으로 프로브의 DNA melting temperature 또는 Tm에서 21 °C를 뺀 온도입니다.예를 들어, miR-382 프로브의 하이브리다이제이션 온도는 Tm 값이 75 °C이므로 54 °C입니다. 각 마이크로 RNA 프로브와 양성 및 음성 대조군을 하이브리다이제이션 완충액으로 40 nM이 되도록 희석하여 준비합니다. 양성 대조군은 U6 small nuclear RNA이며, 음성 대조군은 스크램블 서열(scrambled sequence)입니다.프로브와 대조군을 65°C에서 5분 동안 가열합니다. 하이브리드화 오븐에서 슬라이드를 꺼냅니다. 사전 하이브리드화 설정에서 하이브리드 슬립과 과량의 하이브리드화 버퍼를 제거합니다.버퍼가 포함된 프로브 75 µL를 각 조직 절편 위에 직접 첨가합니다. 다시 한번, 조직 절편을 덮기에 충분한 크기의 하이브리드 슬립으로 덮어줍니다. 이때 슬라이드 홀더의 수평을 유지하십시오.슬라이드를 적절한 온도로 설정된 하이브리다이제이션 오븐에 다시 넣습니다. 약 16시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션이 완료되면 슬라이드를 하이브리다이제이션 오븐에서 꺼냅니다.커버슬립의 가장자리 바로 아래에 하이브리드화 온도로 가열한 2X SSC 200 µL를 첨가하여 조직으로부터 커버슬립이 잘 떨어지도록 합니다. 슬라이드를 기울여 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립을 제거한 후, 결정된 하이브리드화 온도에서 50% 포름아미드와 2X SSC가 혼합된 용액 200 µL로 슬라이드를 30분씩 3회 세척합니다.슬라이드를 실온에서 저속 오비탈 셰이커를 사용하여 PBST로 5분씩 5회 헹굽니다. 먼저 슬라이드를 블로킹 버퍼에 넣고 실온의 저속 오비탈 셰이커에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 1시간 후, 각 조직 절편에 anti dig AP FAB fragments 100 µL를 첨가하고 하이브리드 슬립으로 덮습니다.섹션을 덮을 수 있을 정도의 크기로 자릅니다. 슬라이드를 가습 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 또는 다음 날 약 16시간 동안 배양합니다. 저속으로 설정된 오비탈 셰이커(orbital shaker) 위에서 실온의 PBST로 슬라이드를 5분씩 7회 세척합니다.다음으로, 슬라이드를 AP buffer로 5분씩 3회 세척합니다. AP buffer 10 milliliters에 N-B-T-B-C-I-P solution 200 microliters를 첨가하여 N-B-T-B-C-I-P 발색액을 준비합니다. 희석된 N-B-T-B-C-I-P solution 400 to 500 microliters를 각 슬라이드에 첨가하여 모든 조직 절편이 완전히 덮이도록 합니다.콜레메트릭 검출이 완료되면, 실온의 암실 가습 챔버에서 4~5시간 동안 발색시킵니다. 농도가 증가하는 에탄올 용액에서 각 5분씩 절편을 탈수시킨 후, 자일렌으로 5분씩 5회 투명화 처리합니다. 마지막으로, PerMount 마운팅 용액을 사용하여 슬라이드를 마운팅하고 하룻밤 동안 건조시킵니다.조직 절편이 마르지 않도록 유지하는 것은 이 인시투 하이브리다이제이션 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 이 그림의 왼쪽 부분은 하이브리드 슬립이 조직 가장자리에서 벗어나 조직이 부분적으로 탈수된 신장 절편의 일부를 보여줍니다. 이후 단계에서 재수화하고 덮어주었음에도 불구하고, 탈수된 부분의 신호는 하이브리드 슬립으로 덮여 있었던 부분에 비해 인위적으로 높게 나타납니다.이 이미지에서 보정 막대는 100 microns를 나타냅니다. 이어지는 그림들은 N-B-T-B-C-I-P 발색 시간 최적화의 중요성을 보여줍니다. 패널 A는 발색 시간이 4~5시간보다 길어질 경우, 신장 전체에 걸쳐 뚜렷한 비특이적 발색이 나타나고 micro RNA 대조군 프로브가 처리된 조직이 무작위로 염색됨을 보여줍니다.패널 B는 U6 small nuclear RNA 대조군과 같이 발현량이 많은 표적에 대해 신장을 탐침할 때, 4~5시간 이상의 배양은 신호의 추가적인 개선을 가져오지 않음을 보여줍니다. 이전 연구에서 인용된 이 수치들은 이 in situ hybridization 방법이 신장 조직의 micro RNA 검출에 적용 가능함을 확인시켜 줍니다. 패널 A는 일측성 요관 폐쇄(unilateral ureteral obstruction, UUO)가 유도된 마우스와 그렇지 않은 마우스의 신장 절편에서 anti-miR-382 또는 anti-scrambled로 처리한 후 in situ hybridization을 통해 얻은 miR-382 발현의 대표 이미지를 보여줍니다. sham plus anti-scrambled 조직과 비교하여 UUO plus anti-scrambled 조직에서 염색이 더 진하게 나타난 것으로 보아, UUO가 miR-382 발현의 증가를 유도했음을 알 수 있습니다.이러한 증가는 anti-ME 3 82 처리로 인해 억제되었습니다. 패널 B의 그래프는 sham 그룹 및 antis scrambled 처리 쥐의 mere 3 82 발현을 평균 통합 광학 밀도(integrated optical density) 백분율로 나타낸 것입니다. 관찰된 픽셀 강도 측정 결과, UUO는 외수질과 내수질에서 mere 3 82 발현을 유의하게 증가시키며, anti-ME 3 82가 이를 차단합니다.이러한 증가는 micro RNA in situ hybridization을 통해 모두 시각화하고 측정할 수 있습니다. 이러한 결과는 여기에 제시되지 않은 qPCR 결과와도 일치하며, 이는 포르말린 고정 신장 조직에서 miR-382 발현을 검출하기 위해 in situ hybridization을 사용하는 것이 qPCR 기반 발현 분석과 일치하는 정량적 결과를 제공할 만큼 충분히 민감함을 나타냅니다. 또한, in situ hybridization을 통해 신장 내 micro RNA 발현의 뚜렷한 지역적 차이를 측정할 수 있습니다.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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