배양 및 유지

이 절차의 전체적인 목표는 분변 샘플에서 C difficile을 분리하여 배양함으로써 장기 보관용 글리세롤 스톡을 조제하고, 다양한 후속 응용 분석을 위한 포자 스톡을 준비 및 정량하는 것입니다. 이는 먼저 선택 배지에 도말하여 분변 샘플로부터 C difficile을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 액체 배지에서 C difficile을 배양하고, 글리세롤 내에 C difficile 장기 보관 스톡을 유지하는 것입니다.

다음으로, 동결 글리세롤 스톡에서 C difficile을 회수하여 한천 배지에 도말합니다. 마지막 단계에서는 이러한 프로토콜에 따라 최종적으로 C difficile 포자 스톡을 조제하고 정량합니다. C difficile은 다양한 배지에서 배양하여 정체성을 검증 및 확인하고, 성공적으로 배양 및 유지할 수 있습니다.

이러한 글리세롤 스톡과 배양물은 동물 실험 및 추가적인 분자 생물학 연구를 포함한 수많은 하위 응용 분야에 더욱 활용될 수 있습니다. 캔들 자(candle jar)를 사용하는 것과 같은 다른 방법들에 비해 비닐 혐기성 챔버를 사용하여 c difficile을 배양할 때의 주요 장점은 엄격한 혐기성 환경을 유지할 수 있어 c difficile의 일관되고 신뢰할 수 있는 성장을 가능하게 한다는 점입니다. 일반적으로 이러한 기술이 처음인 사람들은 장갑으로 인해 챔버 내에서 정교한 조작이 어렵거나, 실험을 사전에 철저히 계획해야 하는 필요성 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Jose Suarez가 시작하겠습니다. 본 절차는 호기성 조건에서 수행될 수 있습니다. 먼저, 대변 샘플의 무게를 측정하십시오.

이는 대변 내 c difficile의 수를 측정하기 위해 필요합니다. 그다음 대변 샘플을 1 XPBS에 다시 현탁시키고, 대변 샘플이 완전히 재현탁되도록 볼텍싱합니다. 이어서, 이후 적절한 분리 또는 대변 g당 집락 형성 단위(CFU) 측정을 위해 재현탁된 대변 샘플을 1 XPBS로 단계 희석합니다.

C difficile의 영양 세포가 산소에 노출되지 않도록 혐기성 조건에서 실험을 수행하십시오. 본 실험에 사용된 혐기성 챔버는 37 °C로 유지됩니다. 무균 조작법을 사용하십시오.

각 단계별 희석액 100 µL를 Toro collate oxetane, cyclo Seine, fructose agar 또는 T-C-C-F-A 플레이트에 도말합니다. 이 플레이트들은 잔류 산소를 완전히 제거하기 위해 혐기 챔버 내에서 최소 1~2시간 동안 미리 환원시킨 것입니다. 이는 정확한 계수나 다른 하위 응용 분석을 위해 콜로니를 분리하기 위함입니다.

멸균된 백금이를 사용하여 도말한 배양액을 T-C-C-F-A 플레이트 표면에 고르게 펴 바릅니다. 48시간 후, 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 혐기성 배양합니다. 영양 세포 상태의 c difficile이 산소 노출로 인해 사멸되지 않았는지 확인하기 위해, 평평하고 불규칙한 간유리 모양의 외형을 바탕으로 c difficile 콜로니를 식별합니다.

후속 응용 분석을 위한 콜로니 분리용 플레이트는 항상 혐기 챔버 내부에 보관해야 합니다. 콜로니 수 측정의 경우, 플레이트를 혐기 챔버 외부로 꺼낼 수 있습니다. 플레이트를 챔버 외부로 꺼내면 영양 세포 상태의 c difficile이 산소에 노출되어 사멸한다는 점에 유의하십시오.

이 C difficile 콜로니들은 플레이트를 챔버로 다시 되돌려 놓더라도 회복될 수 없습니다. 각 희석 단계의 C difficile 콜로니 수를 세고, 대변 샘플 g당 CFU 수를 계산하여 C difficile을 배양하고 글리세롤 스톡을 제작하십시오. 멸균된 백금이를 사용하여 개별 콜로니를 채취한 후, 사전 환원된 뇌심장침출액(pre reduced brain heart infusion) 배지에 도말하십시오.

효모 추출물이 첨가된 BHIS 한천 배지 또는 0.03% cysteine이 첨가된 BHIS 한천 배지에, 각 구역마다 새로운 멸균 접종 루프를 사용하여 개별 콜로니를 획선 도말하고 4분할 도말합니다. 배지를 37 °C의 혐기성 조건에서 16 내지 24시간 동안 배양합니다. BHIS 한천 배지에 단일 콜로니가 나타나면, 개별 단일 콜로니를 채취하여 0.03% L cysteine이 첨가된 10 mL의 사전 환원된 BHIS 액체 배지에 재현탁한 후 하룻밤 동안 배양합니다.

37 °C에서 혐기적으로 배양하거나 배양이 탁해질 때까지 배양합니다. 다음 날, 50% glycerol 333 µL와 c difficile 배양액 666 µL를 1.8 mL 냉동 보관 튜브에 넣습니다. 분리 균주의 15% glycerol 스톡을 만들기 위해 냉동 보관 튜브의 캡을 단단히 닫고 혼합합니다.

스톡을 즉시 혐기성 챔버에서 꺼내어 장기 보관을 위해 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 본 절차를 시작하려면, -80 °C 냉동고에서 냉동된 C. difficile 글리세롤 스톡을 꺼내십시오. 해동을 방지하기 위해서입니다.

사용 전 -80 °C에서 보관한 쿨링 랙에 냉동 글리세롤 스톡을 즉시 놓습니다. 무균 조작법과 멸균 백금이를 사용하여 쿨링 랙에 담긴 냉동 글리세롤 스톡을 혐기 챔버 내부로 옮깁니다. 스톡의 소량을 플레이트에 묻힌 뒤, 플레이트의 한 구역에 스트리킹합니다.

플레이트를 90도 회전시키고, 새로운 멸균 백금이를 사용하여 두 번째 구역에 스트리킹합니다. 단일 콜로니의 분리를 보장하기 위해 세 번째와 네 번째 구역에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 냉동 글리세롤 스톡을 혐기성 챔버에서 즉시 꺼내어 -80 °C 냉동고로 되돌려 놓습니다.

c difficile 배양액에서 포자를 정제하기 위해 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 혐기성 배양합니다. 동결 글리세롤 스톡의 균주를 사전 환원된 BHIS 플레이트에 접종합니다. 이전 세그먼트에서 시연된 절차를 따릅니다.

다음 날 37 °C에서 하룻밤 동안 혐기 배양합니다. 개별 콜로니를 여러 개의 pre-reduced 70 30 플레이트에 다시 스트리킹합니다. 37 °C에서 24~48시간 동안 혐기 배양합니다.

포자가 형성되면, 플레이트를 혐기성 챔버에서 꺼냅니다. 멸균된 백금이를 사용하여 플레이트를 긁어낸 후, 세포를 10 milliliters의 멸균된 1X PBS에 재현탁합니다. 플레이트는 폐기하고, 3000 G에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

상층액을 제거하고 1 mL의 1X PBS resus를 첨가한 후, 현탁하고 다시 원심분리하여 펠렛을 만드는 과정을 반복합니다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 다음 날 영양 세포와 모세포의 용해를 돕습니다. 이후 70 °C에서 20분 동안 배양하여 남아 있는 영양 세포를 모두 사멸시킵니다. mL당 CFU를 결정하기 위해, 각 포자 조제물을 1X PBS로 연속 희석하여 0.1% Sodium Toro collate가 첨가된 pre-reduced BHIS 플레이트에 도말하고, 콜로니 수를 측정하기 전 37 °C에서 최소 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

포자는 단기 보관 시에는 실온에서, 장기 보관 시에는 4 °C에서 1X PBS에 보관할 수 있습니다. A. BHIS 및 Columbia anaerobic sheep blood agar 배지에서 배양된 c. difficile의 예시를 여기에서 확인할 수 있습니다.

C difficile은 두 배지 모두에서 뚜렷하게 나타나는 평평하고 지면 유리(ground glass) 모양의 불규칙한 콜로니를 형성합니다. 패널 A는 농축 비선택 배지인 BHIS 한천 배지에서 24시간 동안 배양한 에리스로마이신 감수성 임상 분리균 c difficile 630 E를 보여줍니다. 37 °C에서 Columbia 혐기성 양 혈액 한천 배지에서 배양한 콜로니(패널 B)는 백색광 아래에서 BHIS에서 배양된 것과 유사하게 보입니다.

하지만 이 배지를 사용하면 패널 C에 표시된 것처럼 장파장 자외선 아래에서 C difficile이 나타내는 녹색 또는 시트러스 색의 형광을 검출할 수도 있습니다. 이 절차 이후에 액체 배지에서의 성장 곡선, DNA 및 RNA, 단일 콜로니 분리, PCR 및 기타 분자 생물학적 기법과 C difficile에 적합한 조작, 그리고 동물 실험을 위한 C difficile 포자 활용과 같은 다른 방법들을 수행하여 추가적인 분자 생물학적 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 혐기성 환경에서 C difficile의 영양 세포와 포자를 분리, 배양 및 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

C. difficile은 위장관 질환을 유발할 수 있는 인간 및 동물 병원균임을 잊지 마십시오. C. difficile을 이용한 실험은 적절한 생물안전 2등급(biosafety level two) 조건 하에서 수행되어야 합니다.