Name: 배양 및 유지 클로 스트 리듐 디피 혐기성 환경에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 Clostridium difficile을 혐기성 환경에서 분리하고 배양하는 방법을. 대변 샘플에서 균을 분리하고 글리세롤 주식을 준비하여 장기 보존하는 기술을 익힐 수 있습니다.

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우리는 친절하게 혐기성 챔버의 사진을 제공 수줍어 연구소에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 DK087763 (SMM) 및 STEP / HHMI 교육 과정 개발 원정대 (ANE)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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<li>Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Treatment of Clostridium difficile infection.</a> Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).</li>
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<li>Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+anaerobic+systems+for+the+isolation+of+anaerobic+bacteria+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens.</a> Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).</li>
<li>Bacic, M. K., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+and+cultivation+of+bacteroides+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).</li>
<li>Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proficiencies+of+three+anaerobic+culture+systems+for+recovering+periodontal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).</li>
<li>Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+Treponema+microdentium+as+surface+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies.</a> Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li>
<li>Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Clostridium+difficile+by+normal+hamster+cecal+flora+and+prevention+of+antibiotic-associated+cecitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis.</a> Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).</li>
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<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
<li>Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+gram-stained+stool+smears+in+diagnosis+of+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis.</a> J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).</li>
<li>Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferable+tetracycline+resistance+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).</li>
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<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에서 설명하는 방법은 C의 간단하고 신속하게 복구 할 수 인간, 마우스, 햄스터, C. 등의 장기 저장을 포함한 분변 시료의 다양한에서 디피 글리세롤 또는 포자 주식으로 어울리지. C. 어울리지 경작하기 어려운 유기체가 될 수 있지만주의 혐기성 환경의 유지 보수 및 무균 기술의 응용 프로그램은 강력한 성장과 오염의 감소를 제공 할 수 있습니다. 혐기성 챔버 : 고려 사항 및 유지 보수 단단한 챔버 또는 비닐 실 : 혐기성 챔버의 두 가지 유형이 있습니다. 초대형 챔버는 전형적 가성 화학 물질의 사용을 허용하는, 알루미늄 또는 경질 중합체 (예 : 플렉시 유리 또는 아크릴 재질)로 만든다. 엄밀한 챔버 gloveless 스타일로 변환 자국에 덜 경향이 될 수 있지만, 누수 감지하고 발견하기 어렵고 딱딱한 챔버는 몇 가지 방법이 필요사용중 가스 변위를...

클로 스트 리듐 디피는 의무를 혐기성 미생물과 인간과 동물의 잠재적으로 치명적인 위장 병원체 그람 양성, 포자를 형성하는 박테리아입니다. 처음에는 신생아 1, C.에서 배설물 샘플에서 발견 공생 생물로 1935 년에 설명 어울리지는 나중에 항생제 치료 2와 관련된 위 막성 대장염의 원인 물질로 증명되었다. C.에게 남과 어울리지 않는 감염 (CDI)는 일반적으로 C에 대한 틈새 시장을 창조하는 정상 결장 식물의 중단 결과 항생제 치료가옵니다 어울리지 2 번창한다. C. 어울리지는 분변 - 경구 경로를 통해 휴면 포자로 전송 이후에 여러 가지 독소를 생성하고 심각한 질병 및 대장염 3을 일으킬 수있는 식물 세포를 생산, 위장 내에서 발아한다. CDI는 종종 기존의 치료와 이들의에 불응fections 자주 4를 반복합니다. 그 결과, CDI는 미국 5-7 의료 비용의 최대 48억달러에 대한 책임이 있습니다. C. 남과 어울리지 않는 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. C.에 대한 어울리지 않는 환경에서 지속하고 효율적으로 호스트에 호스트로부터 전송, 대사 적으로 비활성 포자의 형성이 중요 8입니다. 때문에 C.의 실험실 유지 및 조작 어울리지 이러한 기술은 혐기성 챔버의 사용을 필요로, 제어, 혐기성 환경이 필요합니다. 혐기성 챔버의 사용은 증가 된 회복 의무를 혐기성 9-11 단리 초래하였으며, 혐기성 분위기에서 수행 될 분자 기술의 수가 허용했다. C. 외에도 어울리지는 여기에 설명 된 혐기성 챔버의 사용 및 유지 보수가 적용됩니다같은 다른 클로스 트리 디움 종 (예를 들면 C. 퍼프 린 젠스), 다른 위장 종 (예를 들어 테로이 12 종) 및 치주 병원균 (예 Peptostreptococcus 종 13) 등의 의무를 혐기성 균에.

<table><tbody><tr><td>프로테오스 펩톤 번호 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (무수)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Sodium taurocholate</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-cycloserine</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitin</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion medium</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>시그마</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>박토펩톤</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>콜롬비아 양 혈액 한천</td><td>피셔</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>멸균 접종 루프</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면봉</td><td>Fisher</td><td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>Coy 비닐 혐기성 챔버 및 액세서리</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>고객 지정</td><td>이 품목은 실험실의 필요에</td></tr><tr> 따라 맞춤 주문됩니다 <td colspan ="4 ">Materials</td></tr><tr>< colspan = "4 "> TCCFA 한천 프로테오스 펩톤 no. 2 (Difco) 40 g < / > Na 2 HPO 4 5 g KH 2 PO 4 1 g NaCl 2 g MgSO 4(무수) 0.1 g < / > 과당 6 g 한천 20 g < > 121 °deg에서 탈 이온수 및 오토 클레이브와 함께 1L로 가져옵니다. C 20 분 살균 . < / > 오토 클레이브 후, 추가 : 10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml, 필터 멸균 (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %) 10 mg / ml á'...-cycloserine, 필터 살균 (물에 용해, 최종 농도, 250 &mu; g/ml) 10 mg/ml 세폭시틴 1.6 ml, 여과기 살균하는 (물에 녹입니다; 마지막 농도, 16 &mu; g/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g 효모 추출물 5 g 플레이트의 경우 한천 15g을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C 살균 20 분 . 옵션 (오토 클레이브 후 추가) : < / > 10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %) 10 % (w / v) 타우로 콜산 나트륨 10ml (물에 용해, 최종 농도, 0.1 %) SMC 포자 형성 매체 BactoPeptone 90 g 프로테아제 펩톤 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g 121°°C에서 탈이온수와 오토클레이브를 1L로 가져옵니다. C 살균 20 분 . 옵션 (오토 클레이브 후 추가) : 10 % (w / v) L- 시스테인 3ml (물에 용해, 최종 농도, 0.03 %) < / > < 강> 70 : 30 매체 < / 강>< > < / > 박토 펩톤 63 g < > 프로테아제 펩톤 3.5 g < / > 뇌 심장 주입 11.1 g < > 효모 추출물 1.5g (NH4)2SO4 0.7g 트리스 베이스 1.06g 플레이트의 경우 15g 한천을 추가합니다. 탈이온수와 함께 121°C에서 1L로 가져오고 오토클레이브를 사용합니다. C를 20분 동안 살균합니다. 오토클레이브 후 10%(w/v) L-시스테인(최종 농도, 0.03%). Blood agar 3ml를 추가합니다.미리 만들어진 Columbia 혐기성 양 혈액 한천 플레이트(Fisher Scientific, L21928)35를 사용하는 것이 좋습니다. 1X 인산염 완충 식염수(PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g 탈이온수로 1L로 가져오고 HCl로 pH를 7.4로 조정합니다. 사용하기 전에 살균하십시오.</td></tr></tbody></table>

배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

클로 스트 리듐 디피 항생제 관련 설사 (AAD)의 주된 책임이며 중요한 병원 내 병원체 그람 양성, 혐기성, sporogenic 세균이다. C. 남과 어울리지 분리 및 배양하는 악명 어려운 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. 여기에, C.를 분리하는 방법 대변 ​​샘플에서 어울리지 이후에 배양 C. 장기 저장을위한 글리세롤 주식의 준비를위한 어울리지이되게됩니다. 현미경과 동물 연구 등의 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 실험실에서 포자 주식을 준비하고 열거하는 기술도 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 일관성있는 혐기성 환경을 유지하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 성장. 우리는 CA없이 챔버 안팎으로 물질을 전달하기위한 프로토콜을 제공한다효율적이고 일관성있는 C.에 해당하는 혐기성 환경을 유지하기 위해 필요한 정기적 인 유지 보수에 대한 제안과 함께 중요한 산소 오염을 사용하여 남과 어울리지 재배.

C.의 예 BHIS 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 매체에 성장 어울리지는 그림 2에서 볼 수 있습니다. C. 어울리지는 평면이며 모두 미디어에 분명하다 지상 유리 외관을 가지고 불규칙한 식민지를 형성한다. 여기에, C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리 남과 어울리지 않는, 630E (30)는 37 ° C (그림 2A)에서 24 시간 동안, BHIS 한천, 농축, 비 선택 배지에서 재배된다. 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천에 식민지 흰색 빛 (그림 2B)에서 BHIS에 성장 것과 유사하게 나타납니다하지만,이 매체의 사용은 C.에 의해 전시 된 녹색 또는 연두색 형광 검출을 제공한다 남과 어울리지 장파 자외선에서 (UV) 빛 (15) (그림 2C). <e...

클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

이 절차의 전체적인 목표는 분변 샘플에서 C difficile을 분리하여 배양함으로써 장기 보관용 글리세롤 스톡을 조제하고, 다양한 후속 응용 분석을 위한 포자 스톡을 준비 및 정량하는 것입니다. 이는 먼저 선택 배지에 도말하여 분변 샘플로부터 C difficile을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 액체 배지에서 C difficile을 배양하고, 글리세롤 내에 C difficile 장기 보관 스톡을 유지하는 것입니다.다음으로, 동결 글리세롤 스톡에서 C difficile을 회수하여 한천 배지에 도말합니다. 마지막 단계에서는 이러한 프로토콜에 따라 최종적으로 C difficile 포자 스톡을 조제하고 정량합니다. C difficile은 다양한 배지에서 배양하여 정체성을 검증 및 확인하고, 성공적으로 배양 및 유지할 수 있습니다.이러한 글리세롤 스톡과 배양물은 동물 실험 및 추가적인 분자 생물학 연구를 포함한 수많은 하위 응용 분야에 더욱 활용될 수 있습니다. 캔들 자(candle jar)를 사용하는 것과 같은 다른 방법들에 비해 비닐 혐기성 챔버를 사용하여 c difficile을 배양할 때의 주요 장점은 엄격한 혐기성 환경을 유지할 수 있어 c difficile의 일관되고 신뢰할 수 있는 성장을 가능하게 한다는 점입니다. 일반적으로 이러한 기술이 처음인 사람들은 장갑으로 인해 챔버 내에서 정교한 조작이 어렵거나, 실험을 사전에 철저히 계획해야 하는 필요성 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.이 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Jose Suarez가 시작하겠습니다. 본 절차는 호기성 조건에서 수행될 수 있습니다. 먼저, 대변 샘플의 무게를 측정하십시오.이는 대변 내 c difficile의 수를 측정하기 위해 필요합니다. 그다음 대변 샘플을 1 XPBS에 다시 현탁시키고, 대변 샘플이 완전히 재현탁되도록 볼텍싱합니다. 이어서, 이후 적절한 분리 또는 대변 g당 집락 형성 단위(CFU) 측정을 위해 재현탁된 대변 샘플을 1 XPBS로 단계 희석합니다.C difficile의 영양 세포가 산소에 노출되지 않도록 혐기성 조건에서 실험을 수행하십시오. 본 실험에 사용된 혐기성 챔버는 37 °C로 유지됩니다. 무균 조작법을 사용하십시오.각 단계별 희석액 100 µL를 Toro collate oxetane, cyclo Seine, fructose agar 또는 T-C-C-F-A 플레이트에 도말합니다. 이 플레이트들은 잔류 산소를 완전히 제거하기 위해 혐기 챔버 내에서 최소 1~2시간 동안 미리 환원시킨 것입니다. 이는 정확한 계수나 다른 하위 응용 분석을 위해 콜로니를 분리하기 위함입니다.멸균된 백금이를 사용하여 도말한 배양액을 T-C-C-F-A 플레이트 표면에 고르게 펴 바릅니다. 48시간 후, 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 혐기성 배양합니다. 영양 세포 상태의 c difficile이 산소 노출로 인해 사멸되지 않았는지 확인하기 위해, 평평하고 불규칙한 간유리 모양의 외형을 바탕으로 c difficile 콜로니를 식별합니다.후속 응용 분석을 위한 콜로니 분리용 플레이트는 항상 혐기 챔버 내부에 보관해야 합니다. 콜로니 수 측정의 경우, 플레이트를 혐기 챔버 외부로 꺼낼 수 있습니다. 플레이트를 챔버 외부로 꺼내면 영양 세포 상태의 c difficile이 산소에 노출되어 사멸한다는 점에 유의하십시오.이 C difficile 콜로니들은 플레이트를 챔버로 다시 되돌려 놓더라도 회복될 수 없습니다. 각 희석 단계의 C difficile 콜로니 수를 세고, 대변 샘플 g당 CFU 수를 계산하여 C difficile을 배양하고 글리세롤 스톡을 제작하십시오. 멸균된 백금이를 사용하여 개별 콜로니를 채취한 후, 사전 환원된 뇌심장침출액(pre reduced brain heart infusion) 배지에 도말하십시오.효모 추출물이 첨가된 BHIS 한천 배지 또는 0.03% cysteine이 첨가된 BHIS 한천 배지에, 각 구역마다 새로운 멸균 접종 루프를 사용하여 개별 콜로니를 획선 도말하고 4분할 도말합니다. 배지를 37 °C의 혐기성 조건에서 16 내지 24시간 동안 배양합니다. BHIS 한천 배지에 단일 콜로니가 나타나면, 개별 단일 콜로니를 채취하여 0.03% L cysteine이 첨가된 10 mL의 사전 환원된 BHIS 액체 배지에 재현탁한 후 하룻밤 동안 배양합니다.37 °C에서 혐기적으로 배양하거나 배양이 탁해질 때까지 배양합니다. 다음 날, 50% glycerol 333 µL와 c difficile 배양액 666 µL를 1.8 mL 냉동 보관 튜브에 넣습니다. 분리 균주의 15% glycerol 스톡을 만들기 위해 냉동 보관 튜브의 캡을 단단히 닫고 혼합합니다.스톡을 즉시 혐기성 챔버에서 꺼내어 장기 보관을 위해 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 본 절차를 시작하려면, -80 °C 냉동고에서 냉동된 C. difficile 글리세롤 스톡을 꺼내십시오. 해동을 방지하기 위해서입니다.사용 전 -80 °C에서 보관한 쿨링 랙에 냉동 글리세롤 스톡을 즉시 놓습니다. 무균 조작법과 멸균 백금이를 사용하여 쿨링 랙에 담긴 냉동 글리세롤 스톡을 혐기 챔버 내부로 옮깁니다. 스톡의 소량을 플레이트에 묻힌 뒤, 플레이트의 한 구역에 스트리킹합니다.플레이트를 90도 회전시키고, 새로운 멸균 백금이를 사용하여 두 번째 구역에 스트리킹합니다. 단일 콜로니의 분리를 보장하기 위해 세 번째와 네 번째 구역에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 냉동 글리세롤 스톡을 혐기성 챔버에서 즉시 꺼내어 -80 °C 냉동고로 되돌려 놓습니다.c difficile 배양액에서 포자를 정제하기 위해 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 혐기성 배양합니다. 동결 글리세롤 스톡의 균주를 사전 환원된 BHIS 플레이트에 접종합니다. 이전 세그먼트에서 시연된 절차를 따릅니다.다음 날 37 °C에서 하룻밤 동안 혐기 배양합니다. 개별 콜로니를 여러 개의 pre-reduced 70 30 플레이트에 다시 스트리킹합니다. 37 °C에서 24~48시간 동안 혐기 배양합니다.포자가 형성되면, 플레이트를 혐기성 챔버에서 꺼냅니다. 멸균된 백금이를 사용하여 플레이트를 긁어낸 후, 세포를 10 milliliters의 멸균된 1X PBS에 재현탁합니다. 플레이트는 폐기하고, 3000 G에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.상층액을 제거하고 1 mL의 1X PBS resus를 첨가한 후, 현탁하고 다시 원심분리하여 펠렛을 만드는 과정을 반복합니다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 다음 날 영양 세포와 모세포의 용해를 돕습니다. 이후 70 °C에서 20분 동안 배양하여 남아 있는 영양 세포를 모두 사멸시킵니다. mL당 CFU를 결정하기 위해, 각 포자 조제물을 1X PBS로 연속 희석하여 0.1% Sodium Toro collate가 첨가된 pre-reduced BHIS 플레이트에 도말하고, 콜로니 수를 측정하기 전 37 °C에서 최소 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.포자는 단기 보관 시에는 실온에서, 장기 보관 시에는 4 °C에서 1X PBS에 보관할 수 있습니다. A. BHIS 및 Columbia anaerobic sheep blood agar 배지에서 배양된 c. difficile의 예시를 여기에서 확인할 수 있습니다.C difficile은 두 배지 모두에서 뚜렷하게 나타나는 평평하고 지면 유리(ground glass) 모양의 불규칙한 콜로니를 형성합니다. 패널 A는 농축 비선택 배지인 BHIS 한천 배지에서 24시간 동안 배양한 에리스로마이신 감수성 임상 분리균 c difficile 630 E를 보여줍니다. 37 °C에서 Columbia 혐기성 양 혈액 한천 배지에서 배양한 콜로니(패널 B)는 백색광 아래에서 BHIS에서 배양된 것과 유사하게 보입니다.하지만 이 배지를 사용하면 패널 C에 표시된 것처럼 장파장 자외선 아래에서 C difficile이 나타내는 녹색 또는 시트러스 색의 형광을 검출할 수도 있습니다. 이 절차 이후에 액체 배지에서의 성장 곡선, DNA 및 RNA, 단일 콜로니 분리, PCR 및 기타 분자 생물학적 기법과 C difficile에 적합한 조작, 그리고 동물 실험을 위한 C difficile 포자 활용과 같은 다른 방법들을 수행하여 추가적인 분자 생물학적 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 혐기성 환경에서 C difficile의 영양 세포와 포자를 분리, 배양 및 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.C. difficile은 위장관 질환을 유발할 수 있는 인간 및 동물 병원균임을 잊지 마십시오. C. difficile을 이용한 실험은 적절한 생물안전 2등급(biosafety level two) 조건 하에서 수행되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Li, J., et. al., Clostridioides difficile에 대한 유충 제브라피쉬 감염 모델 개발. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 제브라피쉬 유충의 장에서 Clostridioides difficile 박테리아를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 감염된 장을 해부하고 균질화한 후 항생제가 함유된 선택적 혐기성 배지에서 배양합니다. 이러한 조건은 경쟁 미생물을 억제하고 생존 가능한 세포의 성장을 촉진합니다.

유충 제브라피쉬 장에서 Clostridioides difficile 박테리아의 분리 및 배양

출처: Anwar, Z., et al. 소매 식품 샘플에서 Clostridium perfringens 독소형의 농축 및 검출. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오에서는 아황산염 환원균을 아황산염 함유 한천 배지에서 배양하여 혐기성 성장하여 아황산염을 황화수소로 환원하여 철 이온과 함께 검은색 침전물을 형성합니다. 검은 콜로니는 무균 기술을 사용하여 한천 깊이에서 분리되고 지속적인 혐기성 배양을 위해 신선한 배지로 옮겨집니다.

한천 배양에서 아황산염 환원 혐기성 박테리아를 계대 배양

이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련<em&gt; 클로스 트리 디움 디피</em&gt; 스트레인 R20291

항생제 효능은 가장 일반적으로 사멸 역학 연구를 수행하고 집락 형성 단위(CFU)를 측정하여 결정됩니다. 주사전자현미경(SEM)을 이러한 표준 방법과 통합함으로써 다양한 항생제 간의 치료의 약리학적 효과를 구별할 수 있습니다.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

의무 혐기성 유기체는 산소 노출시 성장할 수 없기 때문에 혐기성 배양 기술의 사용은 필수적입니다. 여기서, 우리는 배지 제제로부터 가스 및 휘발성 지방산 정량화에 이르기까지 바이오가스 플랜트로부터 유래된 혼합 배양을 배양하는 간단하고 효과적인 방법을 입증한다.

엄격하게 혐기성 /안산 조건하에서 미생물의 재배를위한 중간 준비

이 논문의 초점은 환경에서 획득한 까다로운 혐기성 미생물을 위한 배지를 만들기 위한 모범 사례를 자세히 설명하는 것입니다. 이러한 방법은 혐기성 배양을 관리하는 데 도움이 되며 찾기 어려운 배양되지 않은 미생물인 "미생물 암흑 물질"의 성장을 지원하는 데 적용할 수 있습니다.

환경적으로 획득한 혐기성 미생물을 배양하기 위한 In Situ Informed Simulated Medium 형식 세트

이 프로토콜은 혐기성 장내 세균의 분리를 개선하기 위한 두 가지 방법론을 제시합니다. 첫 번째는 다양한 배양 배지를 사용하여 다양한 범위의 박테리아를 분리하는 데 중점을 둡니다. 두 번째는 생태학적 중요성을 완전히 이해하기 위해 미오이노시톨을 동화시킬 수 있는 특정 미생물 그룹의 배양 단계에 초점을 맞춥니다.

닭의 위장관에서 혐기성 박테리아의 배양을 강화하기 위한 전략

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

배우세요 Clostridium difficile을 혐기성 환경에서 분리하고 배양하는 방법을. 대변 샘플에서 균을 분리하고 글리세롤 주식을 준비하여 장기 보존하는 기술을 익힐 수 있습니다.

배양 및 유지

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