의 상호 작용을 연구 황색 포도상 구균 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

다음 실험의 전반적인 목표는 포도상구균 페놀, 용해성 모들린 또는 PSM이 인간 호중구에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 인간 혈액에서 호중구를 분리하여 후속 체외 분석을 통해 달성됩니다. 다음으로, 호중구는 형광 염료로 장전되고 억제제가 있거나 없는 PSM의 농도 시리즈와 혼합되거나, PSM 알파 프로모터인 GFP 리포터 구축물을 포함하는 S 레우스 박테리아를 식세포화할 수 있습니다.

궁극적으로 PSM 자극에 의한 호중구의 활성화는 유세포 분석으로 모니터링하고 식세포작용에 의한 GFP의 발현을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법으로 형광 현미경으로 박테리아를 분석할 수 있습니다. 포도상구균, 페닐, 콩, 몰린 또는 호중구의 영향을 연구할 수 있습니다.

물론, 이 방법은 다른 많은 세포 유형, 자극 및 길항제에 적용될 수 있습니다. 우리는 호중구 내부에서 PSM의 영향을 관찰하는 방법을 논의할 때 이 방법의 현미경 부분에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 박테리아 GFP 발현 구조와 타임 랩스 현미경을 사용하면 정확히 이를 수행할 수 있습니다.

헤파린화된 정맥혈 튜브 5개를 채취한 후 12밀리리터당 1.119그램 밀도의 파이얼 용액을 50밀리리터 튜브에 붓고 10밀리리터의 1.077그램 밀도 FI 콜 용액을 조심스럽게 오버레이합니다. 다음으로, 동일한 부피의 PBS로 혈액을 희석하고 각 이중 층 fi call gradient에 20-25ml의 혈액을 조심스럽게 층을 이룹니다. G의 396배와 섭씨 22도에서 깨지지 않고 20분 동안 그래디언트를 원심분리합니다.

그런 다음 멸균 피펫 팁이 장착된 진공 펌프를 사용하여 상단 노란색 플라즈마 및 PBMC 층을 흡인합니다. 그리고 세 번째 흰색 레이어입니다. 이제 작은 플라스틱 피펫을 사용하여 각 튜브의 다형성 핵 호중구 또는 PMN 분획을 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 인간 혈청 알부민 또는 R-P-M-I-H-S-A가 보충된 갓 준비한 사전 냉각 PMI를 추가하여 총 부피를 50ml로 만듭니다. 그런 다음 세포를 회전시키고 진공 펌프로 상층액을 흡인하고 적혈구와 PMN이 함유된 펠릿을 부드럽게 와류로 만듭니다. 다음으로, 9ml의 멸균 탈이온수를 세포에 추가하고 타이머를 시작합니다.

정확히 30초를 추가합니다. 고삼투압 쇼크를 멈추기 위해 10배 농축된 PBS 1ml를 첨가하십시오. 그런 다음 총 50ml의 차가운 R-P-M-I-H-S-A로 세포를 세척합니다.

상층액을 제거한 후 각 입천장에 1ml의 R-P-M-I-H-S-A를 첨가하면 적혈구의 용해로 인해 흰색이 됩니다. 그런 다음 다시 호흡하고 피펫팅으로 매달아 펠릿을 하나의 튜브에 결합합니다. 이제 세포를 세고 농도를 10 곱하기 밀리리터당 7번째 세포로 조정합니다.

이제 5 곱하기 10을 2 마이크로 몰 독감으로 밀리리터 당 여섯 번째 세포를로드합니다 오 3:00 AM R-P-M-I-H-S-A. 그리고 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로, 교반 하의 온도에서 20분 동안 세포를 배양합니다.

그 동안, 최종 농도의 10배에서 자극을 3배 연속 희석할 준비를 합니다. 그런 다음 30 마이크로 리터의 자극을 동일한 부피의 새로 준비된 10 배 농축 억제제 또는 완충액으로 실온에서 10 분 동안 사전 배양합니다. 다음으로, 10 밀리리터의 R-P-M-I-H-S-A로 세포를 세척하고 새로운 R-P-M-I-H-S-A에서 10 곱하기 밀리리터당 6 번째 세포로 세포를 재현탁합니다.

흐름 분석 직전에 세포를 R-P-M-I-H-S-A에서 밀리리터당 6번째 셀의 2배로 10배로 희석하고 팩스 튜브당 200마이크로리터의 셀을 추가합니다. 유세포분석기의 첫 번째 튜브를 흔들거나 피펫팅하여 세포를 활성화하지 않도록 주의하십시오. 3초 동안 기다린 다음 고정된 시간(예: 8초) 후에 수집을 시작하고 튜브를 제거하고 자극의 가장 낮은 희석액 50마이크로리터를 샘플에 빠르게 추가합니다.

즉시 튜브를 재장전하고 수집을 계속하십시오. 희석 시리즈가 완료되면 새 시리즈를 측정하기 전에 새 R-P-M-I-H-S-A로 유세포 분석기 바늘을 세척합니다. 마지막 샘플을 실행한 후 유세포 분석 소프트웨어로 데이터를 분석하여 박테리아 GFP 발현을 분석합니다.

PMN phagocytosis가 국물에서 관심있는 리포터 구조체를 포함하는 S ous 균주를 하룻밤 동안 성장시킨 후, 세포를 OD 6 60 0 0.01로 희석하여 하룻밤 배양 중에 발현된 모든 GFP를 제거합니다. 문화를 OD 6 60 0 0.1로 성장시킵니다. 세포를 1 내지 30으로 희석한 다음 배양액이 다시 한 번 0.1의 OD 6 60에 도달할 때까지 성장을 모니터링합니다.

그런 다음 원심 분리로 박테리아를 수집합니다. DPBS와 Resus에서 세포를 한 번 세척합니다. 문화를 중단하십시오.

원래 부피의 1에 1을 더하면 1.0의 OD 6 60 또는 밀리리터당 8번째 CFU에 약 5배 10을 곱합니다. 이제 박테리아를 R-P-M-I-H-S-A에서 갓 분리한 PNS와 10:1 비율로 혼합합니다. 그런 다음 세포 용액 내에 있는 pooled human serum의 총 10분의 1 말단 부피에 pooled human serum을 추가합니다.

세포 혼합물을 섭씨 37도에서 10분 동안 흔들어 식세포작용을 자극합니다. 그런 다음 장전된 박테리아를 10의 5배로 10배로 희석하여 밀리리터당 5번째 세포로 희석하고 250마이크로리터의 세포를 8개의 웰 챔버 커버 슬립의 각 웰로 이동합니다. 마지막으로, 40 x 대물렌즈가 장착되고 어두운 환경 챔버에 둘러싸인 도립 현미경에서 세포를 이미지화하고 명시야와 GFP 채널 모두에서 5-10분마다 커버 슬립 챔버의 여러 위치에서 이미지를 획득하여 박테리아 GFP 생산을 실시간으로 추적하고 합성 PSM 알파 3의 농도 시리즈로 호중구를 배양하면 용량 의존적인 빠른 활성화가 가능합니다. 칼슘 플럭스로 측정된 세포.

0.01%0.1% 또는 1%인간 혈청과 함께 PSM 알파 쓰리 펩타이드를 사전 배양하면 칼슘 반응을 유도하는 자극의 능력을 유의하게 억제했습니다. 다시 1% 혈청의 복용량에 따라 다릅니다. 이러한 PSM 알파 3 농도에서는 활성화가 거의 보이지 않습니다.

이 이미지에서는 A PSM alpha GFP 리포터 구축물을 포함하는 식세포균을 포함하는 두 개의 호중구가 표시됩니다. 박테리아는 PSM 알파 프로모터에서 GFP의 발현을 나타내는 식세포작용 약 1시간 후에 형광을 발하기 시작합니다. 호중구 외부의 박테리아는 형광을 발하지 않는데, 이는 박테리아가 식세포작용(phagocytosation)될 때만 PSM 알파 발현이 빠르게 활성화된다는 것을 나타냅니다.

이 절차를 시도할 때 최적의 결과를 위해 항상 새로운 호중구를 사용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후 유세포 분석으로 칼슘 플럭스를 측정하는 방법과 형광 현미경을 사용하여 진핵 세포 내부의 박테리아 유전자 발현을 측정하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다.