Name: 의 상호 작용을 연구 황색 포도상 구균 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 학습하세요 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 PSM 독소가 호중구 활성화에 미치는 영향을 유동 세포 계측법과 형광 현미경으로 분석하는 방법. 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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<p class="jove_content"&gt; RN 부분적으로 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램, 프로젝트 번호 268324에서 마리 퀴리 유럽의 재 통합 보조금 (ERG)에 의해 재정 지원되었다.</p&gt;

1. 밀도 원심 분리하여 인간의 혈액에서 PMNs의 분리 <ol><li> 헤파린 정맥 혈액의 3.5 9 ML 튜브를 그립니다. </li><li> 다음과 같이 듀얼 레이어 Ficoll 그라디언트 (5 관 혈액 4 그라디언트) 준비 : 50 ML 튜브의 밀도 1.119 g / ㎖ ficoll 용액 12 mL를 상단에 밀도 1.077 g / ㎖ ficoll 솔루션 조심스럽게 층을 10 ㎖를 붓고. </li><li> PBS의 동일한 볼륨 혈액을 희석. </li><li> 레이어 듀얼 레이어 Ficoll 기울기에주의 희석 된 혈액, 그라데이션 당 20-25 ML. </li><li> 스윙 버킷 회, 22 ° 제동없이 C에서 396 XG에서 20 분 원심 분리기. </li><li> 포함하는 차가운 RPMI를 준비 0.05 % 사람 혈청 알부민 (RPMI-HSA). 또한 9 ML 살균 이온 H 2 O를 준비 전 차가운 얼음에 RPMI와 H 2 O 양. </li><li> (멸균 피펫 팁을에 넣어 진공 펌프의 사용과 혈장 (노란 색)과 PBMC를 포함하는 상위 Ficoll 계층 및 Ficoll의 두 번째 계층 (화이트 컬러)를 대기음피펫). </li><li> 작은 플라스틱 피펫 (매 2 그라디언트 PMN 분수 1 관)을 사용하여 50 ML 튜브에 PMNs를 수집하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 4에서 249 XG에서 10 분 동안 50 ML과 원심 분리기의 총 볼륨 차가운 RPMI-HSA를 추가 ° C. </li><li> 진공 펌프와 소용돌이 부드럽게 펠렛 (적혈구 및 PMNs)의 사용으로 상층 액을 제거한다. </li><li> 9 ML 살균 이온 H 2 O를 추가하고 타이머를 시작합니다. 1 ML 10 배 농축 PBS를 추가하여, 정확히 30 초 후 하이퍼 삼투 충격을 중지합니다. 참고 : 30 초는 매우 중요하다. </li><li> 4에서 249 XG에서 10 분 동안 50 ML과 원심 분리기의 총 볼륨 차가운 RPMI-HSA를 추가 ° C. </li><li> 진공 펌프의 사용과 상층 액을 가지고 정의 된 볼륨 (1-2 ML) RPMI-HSA와 1 관에서 PMN 펠렛을 수집합니다. </li><li> 세포의 양을 결정하고 1.10 7 세포 / ㎖로 농도를 조정합니다. 기증자에 따라 격리 PMNs의 수율은 betwe을 것입니다혈액의 각 10 ML 튜브에서 EN 5 × 10 6, 3 × 10 7 PMNs </li></ol> 2. 인간 PMNs에서 칼슘 동원의 평가를위한 유세포 분석 <ol><li> 2 μM과 짐 세포 (5 × 10 6 세포 / ML) 플루오-3-AM 예를 들어 빛으로부터 보호 락을 플랫폼 쉐이커를 사용하여, 실내 온도 요동에서 20 분 천천히 대한 RPMI-HSA와 부화한다. </li><li> 반면에 배 최종 농도 자극의 연속 희석 (예를 들어 3 배)를 준비. PSMα3이 프로토콜에서 사용되지만 백혈구에 작용하는 GPCR 자극이 적당하다. </li><li> RPMI-HSA에있는 수용체의 10 배 집중 억제를 준비합니다. 억제제는 실온에서 10 분 동안 억제제의 동일한 볼륨 자극 (PSMα3에 예 HDL) 사전 부화 25 μL 자극에 작용합니다. </li><li> 상온에서 249 XG에 대해 10 RPMI-HSA ml의 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오. 5 X에 세포를 resuspend10 6 세포 / ML. </li><li> 그냥 실험을하기 전에, 2 × 10 6 세포 / RPMI-HSA에 ML로 세포를 희석 FACS 튜브 당 200 μl의 세포를 추가합니다. 희석 PMNs은 매우 허약하다. 이 농도에서 너무 오래 그들을 유지하는 것은 자동 활성화로 이어질 것입니다, 같은 격렬한 흔들림이나 피펫 팅을 위해 보유하고 있습니다. </li><li> 흐름 cytometer에에 튜브를 연결, 3 초를 기다렸다가 수집을 시작합니다. 고정 기간 (예 : 13 초) 한 후, 튜브를 타고 빠른 속도로 샘플 50 μL 자극을 추가합니다. 즉시 샘플 홀더에 튜브를 다시 연결하고 인수를 계속합니다. </li><li> 자극의 높은 농도와 가장 낮은과 끝 시작합니다. RPMI-HSA 각 실행 후 정기적으로 흐름 cytometer에 바늘을 씻으십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 자극의 추가 후에 그에게 자극뿐만 아니라 이전의 평균 형광 신호를 비교하고 교류를 계산하기위한 적절한 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하여측정 된 각 희석 tivati​​on 강도. </li></ol> 또는 억제제 억제제 수용체 사전 부화 세포에 작용합니다. 3. PMNs에 의해 탐식 후 박테리아 GFP 발현의 형광 현미경 분석 <ol><li> S. 성장 국물에 밤에 그 기자 구문을 (플라스미드 기자를 유지하는 데 필요한 항생제)를 포함 구균의 변종. 이 경우 변형 MW2 PSMα GFP 기자 구조는 LB 배양액 5 ml의 50 ML 플라스틱 관에서 자란 10 사용된다 포함한다. </li><li> O / N 표현식에서 모든 GFP를 제거하려면, OD 660 0.01 문화를 희석 OD 660 0.1 성장합니다. 이 문화 1:30 Redilute, 그리고 문화 0.1의 OD 660에 도달 할 때까지 성장을 모니터링 할 수 있습니다. 원심 분리하여 박테리아를 수집하고 DPBS에 한 번 씻는다. OD 1.0 660 또는 R를 얻기 위해 원본 볼륨의 1:10 resuspend을하여 깨끗이 5.10 8 CFU / ㎖. </li><li> 1.5 ML의 모세관에있는 RPMI-HSA (비 10시 1분)에서 갓 고립 PMNs (1.10 6 / ML)와 박테리아 (1.10 7 / ㎖) 혼합 및 10 %의 최종 농도에 풀링 된 혈청을 추가합니다. 37 10 분 동안 흔들어 플랫폼에 흔들 ° C 식균 작용을 촉진합니다. 5.10 5 PMNs / ㎖와 8 잘 챔버 커버 슬립의 잘 피펫 250 μL에 세균로드 PMNs를 희석. </li><li> 현미경 세균 이미지 PMNs합니다. 40X/0.85 NA의 목적으로되어 거꾸로 현미경은 잘 작동하고 37 안정적 환경을 유지하기 위해 어두운 환경 챔버에 넣어해야 ° C. 카메라에게 밝은 필드와 시간에 GFP 생산을 따르도록 GFP 채널 모두에서 모든 50-10 분을 사용하여 사전 설정 위치의 수에 대한 이미지를 획득. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
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<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
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<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 방법에 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 우리는 여기서이 강조 표시됩니다. 밀도 기울기 원심 분리하여 호중구의 분리의 경우는 원심 분리 단계 도중 또는 이후 레이어를 방해하지 않는 것이 중요합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 호중구를 흡입 할 때, 세포의 층에서 동안으로 배출 액체 층을 방해 할 풍선을 짜내하지 있는지 확인하십시오. 또한, 시각적으로 삼투 충격과 원심 분리 단계 이후 호중구의 펠렛을 검사합니다. 펠렛은 아직이면 붉은 적혈구 용해 충분한 효과가없고, 한 번 더 반복해야합니다. 이 정기적으로 발생하면,보다 완벽한 적혈구 용해를 얻기 위해 5 초 정도가 탈 H 2 O와 배양 시간을 증가시킨다. 칼슘 동원 방법을 위해 그것을 신선한 격리되어 호중구을 가지고하는 것이 중요합니다. 일반적으로, 세포에 냉장고에 저장되어있는 것을오 오래뿐만 아니라 응답하지 않습니다. 그들은 하나를 이미 추...

호중구 (PMNs)는 황색 포도상 구균 1에 타고난 면역 반응에 중요한 역할을 전문가 식세포이다. 호스트 및 미생물 사이의 지속적인 전투는 양쪽의 군비 경쟁을 주도하고있다. meticillin 내성 S.의 최근 사회 관련 (CA) 균주 구균 (MRSA)은 호중구 살해 2,3의 우회에 매우 효율적있을 것 등장했습니다. CA-MRSA의 과도한 페놀 용해 modulin (PSMS) 생산은 4,5 높은 독성과 관련되어있다. 인간 호중구 수용체 6 결합이 G-단백질의 활성화로 이어질 FPR2를 통해 이러한 PSMS를 인식 할 수 있습니다. 최초의 이벤트 중 하나는 칼슘의 세포 내 저장 (칼슘 2 +)의 동원이다. 칼슘 2 + 탈과립 및 식균 7 등 PMNs의 이펙터 기능의 다양한 보조 메신저 역할을합니다. 따라서 칼슘 2 +의 매우 중요한 지표이다PMNs를 활성화 PSMS의 기능 용량. 호중구에 PSMS의 효과를 연구하기 위해 신선한 호중구는 칼슘 동원에 형광하는 염료로 고립로드됩니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 호중구에 대한 독성 및 기타 구성 요소의 직접적인 효과를 연구하고, 이러한 활성화 된 가장 낮은 농도를 측정 할 수 있습니다. 우리를 위해, 그것은 S.에 의해 만들어진 여러 단백질의 효과를 연구하기 위해 매우 유용한 도구입니다 구균은 FPR2 억제 단백질 (FLIPr) 8, 7 FLIPr 같은, 그리고 황색 포도상 구균 (CHIPS) 9 주 화성 억제 단백질로 면역 회피에 참여. 이러한 모든 단백질은 작용제를 인식 수용체에 결합하여 호중구의 칼슘 동원을 억제하기 위해 표시되었습니다. 최근 우리 그룹은 PSMS가 기능적으로 10 혈청 지질 단백질에 의해 억제되는 것을 설명하고있다 &lt;/&gt;을 먹다. 이 지단백은 PSMS 주로 세포 내 환경에서 그 기능을 발휘을 나타내는 혈액과 인체 조직 내에 다량으로 존재한다. 칼슘 동원 분석의 가용성은 우리가 정확하게 혈청의 매우 낮은 농도로 상당한 억제에 표시된 PSMS에 의한 호중구의 활성화에 혈청 지단백의 효과를 측정 할 수있었습니다. PSMS가 기능적으로 혈청에 의해 억제되기 때문에, 우리는 세포 내 독소 PSMS위한 중요한 기능이 있다는 가설을 세웠다. 따라서 우리는 식균 작용 후 PSMS의 역할을 결정하는 모색. 세포 사이 공간에 PSMS의 발현을 조사하기 위해, 우리는 GFP의 psmα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포했다, 표현의 유도는 형광 현미경 10을 사용하여 관찰 하였다. 물론이 절반hnique은 S.의 유전자의 다수의 표현의 연구를 수 식균 작용 후 구균이나 다른 병원균. S.에 대한 이후 간 틈새 시장에서 살아 남기 구균이 틈새 시장에서 활성화 유전자의 역할을 공부 타고난 면역 시스템 11 10 12를 극복하는 것이 매우 중요하다 그 독성을 이해하는 매우 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>분자 프로브 / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>밀도 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>밀도 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>25 함유 25 mM HEPES 및 L-글루타민</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 현미경</td><td>Leica Microsystems, The Netherlands</td><td>TCS SP5</td><td>objective: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>측정 과정에서 튜브를 제거하고 교체할 수 있는 것이 매우 중요합니다.</td></tr></tbody></table>

의 상호 작용을 연구<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

우리는 호중구에서 황색 포도상 구균에 의해 생산 분비 페놀 용해 modulins (PSMS) 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시한다. 우리는 밀도 기울기 원심 분리를 사용하여 신선한 호중구를 분리 호중구에 PSMS의 효과를 연구합니다. 이러한 호중구는 칼슘 동원에 형광 염료로로드됩니다. PSMS에 의한 호중구의 활성화는 무료로 세포 내 칼슘 농도의 신속하고 일시적인 증가를 시작합니다. 유동 세포 계측법 실험이 신속하게 동원은 무료 칼슘의 증가 농도 +에 반응하는 사전로드 된 염료의 형광을 모니터링하여 측정 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 우리는 호중구를 활성화하고 호중구 활성화의 특정 및 일반 억제제의 효과를 측정하는 데 필요한 PSM 농도를 확인할 수 있습니다. 세포 내 공간 W에 PSMS의 발현을 조사하기전자 GFP에 PSMα 오페론의 프로모터의 기자 융합을 건설했다. 언제 S. 이러한 기자 변종 구균은 호중구에 의해 phagocytosed 세포 아르, 표현의 유도는 형광 현미경을 사용하여 관찰 할 수있다.

인간의 PMNs 칼슘 동원의 평가를위한 유세포 분석 FL-1 신호의 증가에 의해 표시되는 칼슘 플럭스에 의해 측정 급속한 활성화의 결과로 합성 PSMα3의 농도 일련의 호중구을 배양. 0.01 %의 합성 PSMα3의 사전 배양, 0.1 % 또는 1 % 혈청이 크게 칼슘 플럭스 (그림 1)을 유도 할 수있는 능력을 저해. 형광 현미경을 사용하여 PMNs하여 식균 작용 후 박테리아 GFP 발현 분석 PSMα-GFP 기자를 포함 phagocytosed 세포 박테리아 PSMα 프로모터의 발현을 나타내는 식균 작용 후 녹색 1 ~ 2 시간을 형광을 10 시작 구성. 호중구 외부 박테리아는 형광 또는 세포 박테리아 밀도 microcolonies (그림 2) 형성 한 후에 만 형광 표시되지 않습니다. 이들데이터 PSM...

우리는에 의해 분비 PSMS 및 기타 독소의 효과를 연구하는 방법을 제시<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 형광 현미경을 사용하여 호중구합니다.

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

다음 실험의 전반적인 목적은 포도상구균 페놀 가용성 모듈린(staphylococcal phenol soluble modulin) 또는 PSM이 인간 호중구에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 혈액에서 호중구를 분리하여 이후 인비트로(in vitro) 분석을 수행합니다. 다음으로, 호중구에 형광 염료를 로딩한 후 억제제 유무에 따른 다양한 농도의 PSM과 혼합하거나, PSM alpha 프로모터 GFP 리포터 컨스트럭트를 포함하는 S. aureus 박테리아를 식세포 작용으로 섭취하도록 유도합니다.최종적으로 PSM 자극에 의한 호중구의 활성화는 유세포 분석법으로 모니터링할 수 있으며, 식세포 작용으로 섭취된 박테리아의 GFP 발현은 형광 현미경으로 분석할 수 있습니다. 이 방법을 통해 포도상구균 페닐 소이 몰린(phenyl, soy, molins) 또는 호중구의 영향을 연구할 수 있습니다.물론 이 방법은 다른 많은 세포 유형, 자극 및 길항제에도 적용될 수 있습니다. 저희는 호중구 내부에서 PSM의 효과를 관찰하는 방법을 논의하던 중 이 방법의 현미경 관찰 부분에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 박테리아 GFP 발현 컨스트럭트와 타임랩스 현미경을 사용하면 정확히 이를 수행할 수 있습니다.헤파린 처리된 정맥혈 5개 튜브를 채취한 후, 밀도가 1.119 g/mL인 Ficoll 용액 12 mL를 50 mL 튜브에 붓고, 그 위에 밀도가 1.077 g/mL인 Ficoll 용액 10 mL를 조심스럽게 층으로 쌓습니다. 다음으로, 혈액을 동일한 부피의 PBS로 희석하고, 희석된 혈액 20~25 mL를 각 이중층 Ficoll 밀도 구배 위에 조심스럽게 층을 이뤄 올립니다. 층이 깨지지 않도록 22 °C에서 396 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.그런 다음 멸균 피펫 팁이 장착된 진공 펌프를 사용하여 상단의 노란색 혈장 및 PBMC 층을 흡입하여 제거합니다. 이어서 세 번째 흰색 층을 제거합니다. 이제 소형 플라스틱 피펫을 사용하여 각 튜브의 다형핵 호중구(PMN) 분획을 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.인혈청 알부민이 보충된 냉각된 RPMI 또는 R-P-M-I-H-S-A를 각 튜브에 추가하여 총 부피를 50 milliliters로 맞춥니다. 그 후 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 진공 펌프로 상층액을 흡입한 다음 적혈구와 PMN이 포함된 펠릿을 가볍게 볼텍싱합니다. 다음으로, 세포에 9 milliliters의 멸균 탈이온수를 추가하고 타이머를 시작합니다.정확히 30초를 추가합니다. 고삼투압 쇼크를 중단시키기 위해 10배 농축 PBS 1 mL를 첨가합니다. 그 다음, 차가운 R-P-M-I-H-S-A 총 50 mL로 세포를 세척합니다.상층액을 제거한 후, 적혈구 용해로 인해 현재 하얗게 변한 각 플레이트(palate)에 R-P-M-I-H-S-A 1 mL를 첨가합니다. 그런 다음 피펫팅으로 재현탁하고 펠릿을 하나의 튜브에 모읍니다. 이제 세포 수를 측정하여 농도를 1 × 10⁷ cells/mL로 조정합니다.이제 2 $\mu$M의 fluoh-3 AM이 포함된 RPMI-HSA 배지에서 5 $\times$ 10⁶ cells/mL 농도로 세포를 로딩합니다. 그리고 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 다음으로, 교반 상태에서 해당 온도에서 세포를 20분 동안 인큐베이션합니다.그동안 자극제를 최종 농도의 10배 농도로 3배 연속 희석하여 준비합니다. 그런 다음, 신선하게 준비한 10배 농축 억제제 또는 완충액과 동일한 부피의 자극제 30 µL를 함께 섞어 상온에서 10분 동안 사전 배양합니다. 다음으로, RPMI-1640 10 mL로 세포를 세척하고, 세포 농도가 5×10⁶ cells/mL가 되도록 신선한 RPMI-1640에 세포를 다시 현탁합니다.유세포 분석 직전에 세포를 R-P-M-I-H-S-A에서 2 × 10⁶ cells/mL로 희석하고, 튜브당 200 µL의 세포를 분주합니다. 흔들거나 피펫팅하여 세포가 활성화되지 않도록 주의하며 첫 번째 튜브를 유세포 분석기에 로딩합니다. 3초간 대기한 후 데이터 획득을 시작하며, 정해진 시간(예: 8초) 후에 튜브를 제거하고 샘플에 가장 낮은 희석 배율의 자극제를 50 µL 빠르게 첨가합니다.즉시 튜브를 다시 장착하고 획득을 계속합니다. 희석 시리즈가 완료되면, 새로운 시리즈를 측정하기 전에 신선한 R-P-M-I-H-S-A로 유세포 분석기 바늘을 세척합니다. 마지막 샘플의 실행이 끝나면, 유세포 분석 소프트웨어로 데이터를 분석하여 박테리아의 GFP 발현을 분석합니다.PMN 식세포 작용 후, 관심 리포터 컨스트럭트가 포함된 S ous 균주를 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 중에 발현된 GFP를 제거하기 위해 세포를 OD 600 0.01까지 희석합니다. 배양액을 OD 600 0.1까지 성장시킵니다. 세포를 1:30으로 희석한 다음, 배양액이 다시 OD 600 0.1에 도달할 때까지 성장을 모니터링합니다.그다음 원심분리를 통해 박테리아를 수집합니다. 세포를 DPBS로 한 번 세척하고 재현탁합니다.원액의 1~10배를 첨가하여 OD₆₀₀ 1.0 또는 대략 5×10⁸ CFU/mL를 얻습니다. 이제 박테리아를 RPMI-1640 배지 내에서 갓 분리한 PNS와 10:1 비율로 혼합합니다. 그다음, 세포 용액 내 총 최종 부피의 1/10이 되도록 풀드 인체 혈청(pooled human serum)을 첨가합니다.세포 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 흔들어주어 식세포 작용을 자극합니다. 그런 다음 박테리아가 탑재된 PMN을 5 × 10⁵ cells/mL로 희석하고, 8웰 챔버 커버슬립의 각 웰에 세포 250 µL를 옮깁니다. 마지막으로, 40 x 대물렌즈가 장착되고 암실 챔버로 둘러싸인 도립 현미경에서 세포를 이미징하며, 박테리아의 GFP 생성을 실시간으로 추적하기 위해 5~10분 간격으로 커버슬립 챔버 내 여러 위치에서 명시야 및 GFP 채널 이미지를 획득합니다. 다양한 농도 시리즈의 합성 PSM α3와 함께 호중구를 배양하면 칼슘 플럭스로 측정되는 세포의 농도 의존적인 급격한 활성화가 나타납니다.PSM alpha three 펩타이드를 0.01%, 0.1% 또는 1%의 Human serum으로 사전 배양한 결과, 자극이 칼슘 반응을 유도하는 능력이 유의미하게 억제되었습니다. 1% serum 농도에서 다시 한번 용량 의존적인 양상이 나타났습니다. 이러한 PSM alpha three 농도에서는 활성화가 거의 관찰되지 않았습니다.이 이미지들은 PSM alpha GFP 리포터 컨스트럭트를 포함하고 있으며 포식된 박테리아가 들어 있는 두 개의 중성구(neutrophils)를 보여줍니다. 박테리아는 포식 후 약 1시간 뒤부터 형광을 띠기 시작하며, 이는 PSM Alpha 프로모터로부터 GFP가 발현됨을 나타냅니다. 중성구 외부의 박테리아는 형광을 띠지 않는데, 이는 PSM alpha 발현이 박테리아가 포식되었을 때만 빠르게 활성화된다는 것을 의미합니다.이 절차를 수행할 때 최적의 결과를 얻기 위해 항상 신선한 중성구(neutrophils)를 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청함으로써 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용한 칼슘 플럭스(calcium flux) 측정 방법과 형광 현미경을 이용한 진핵세포 내 세균 유전자 발현 측정 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

이 비디오는 호중구-생물막 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 생물막에 내장된 병원성 세균과 분리된 호중구는 형광 표지를 사용하여 태그를 지정하고, 호중구에 의한 면역 반응과 박테리아에 의한 면역 반응 회피를 형광 현미경을 사용하여 평가했습니다.

호중구와 생물막 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

흐름에서 백혈구를 모집 염증이 혈관 내피 세포의 기능은 중간 엽 기질 세포에 의해 조절된다. 우리는 흐름 호중구 모집을 평가하고 간엽 기질 세포가 이러한 과정을 조절하는 것을 재생 역할을 조사하는데 사용될 수있다 일차 인간 세포를 통합 두 시험 관내 모델을 설명한다.

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

본 프로토콜은 호중구-생물막 상호작용의 연구를 기술한다. 황색포도상구 균 생물막은 시험관 내에서 확립되고 말초 혈액 유래 인간 호중구와 함께 배양됩니다. 호중구의 산화 파열 반응은 정량화되고 생물막 내의 호중구 국소화는 현미경으로 결정됩니다.

인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 사이의 상호작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

이 원고에서는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항생제 생존을 평가하고, 플라스미드를 녹농균(P. aeruginosa) 및 S. 아우레우스(S. aureus )로 변환하여 리포터 균주를 생성하고, 타임랩스 형광 현미경 검사로 지속형(persister)와 같은 표현형 변이를 시각화하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형

학습하세요 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 PSM 독소가 호중구 활성화에 미치는 영향을 유동 세포 계측법과 형광 현미경으로 분석하는 방법. 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

의 상호 작용을 연구

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