시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

다음 실험의 전반적인 목표는 작용의 변화, 잠재적 발화 빈도 및 상부 핵 뉴런의 세포 내 칼슘 농도와 같은 전압 또는 전류의 변화 간의 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이는 칼슘에 민감한 프로브로 채워진 미세 전극을 사용하여 SMA 핵 뉴런을 기록하기 위해 뇌 절편을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 마이크로 전극은 신경 세포막으로 밀봉됩니다.

다음으로, 마이크로 전극으로 밀봉된 신경세포막을 파열하여 칼슘 형광 프로브를 개별 뉴런에 도입하고 멤브레인과 함께 전기활성 결과를 기록하여 전압 또는 전류를 측정하고 두 파장에서 칼슘 프로브 형광의 이미지를 얻고 이러한 파장에서 형광 비율의 변화는 뉴런 내 세포 내 칼슘의 변화를 반영합니다. 세포의 칼슘 농도를 결정하기 위해 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시냅스 활성화에 의해 생성된 막 전기 활동과 세포 내 칼슘의 변화를 개별 미용 핵 뉴런에서 동시에 측정할 수 있다는 것입니다.

이 기술을 시연하는 사람은 제 동료인 로버트 어윈 박사입니다. 유리 페트리 접시에 슬라이스 용액을 적신 원형 여과지에 쥐의 뇌를 놓고 얼음 위에 올려 놓고 소뇌와 뇌간을 제거하기 위해 뇌 코로나를 자르고 피질의 오른쪽과 왼쪽 부분을 잘라내어 시상 하부를 포함하는 뇌 블록을 남기고 SCN 시신경과 시신경을 포함하는 뇌의 복부 쪽을 조심스럽게 보존합니다. 그 후, 얼음처럼 차가운 마이크로톰 슬라이싱 챔버에 뇌와 아로스 블록을 부착할 수 있을 만큼 큰 사노 아크릴 접착제를 얇게 펴 바릅니다.

얼음처럼 차가운 뇌 블록을 접착제 위에 아래로 향하게 하여 SCN이 포함된 면을 먼저 절단하고 시신경을 V자로 형성하여 다른 세 면에 aros 블록을 놓습니다. 그런 다음 챔버를 얼음 차가운 슬라이스 버퍼로 채우고 발탄원으로 지속적으로 거품을 일으킵니다. Sano 아크릴 접착제는 수분으로 응고되어 뇌와 aros 블록을 제자리에 고정합니다.

그런 다음 SCN이 포함된 관상 시상하부 절편을 220-250미크론 두께로 자릅니다. 절단 중에 왼쪽 aros 블록이 분리되었습니다. 이것은 접착제가 충분하지 않은 경우 발생할 수 있습니다.

그런 다음 SCN이 포함된 슬라이스를 식별합니다. 일반적으로 시신경이 약 2-4mm 너비로 흰색 띠처럼 보이는 슬라이스를 선택하고 SCN은 등쪽에 제3심실 양쪽의 시신경에 두 개의 작은 움푹 들어간 곳으로 나타납니다. 슬라이스를 현미경 스테이지에 장착된 섭씨 36도의 기록 챔버로 옮깁니다.

챔버는 분당 2밀리리터의 속도로 연속적으로 흐르는 녹음 용액으로 채워져 있습니다. 95% 탄화로 폭기되고 인라인 히터로 예열되었습니다. 제3뇌실의 양쪽에 있는 두 개의 반투명 SCN 핵을 관찰하여 SCN을 식별하며, 투과광에 의해 조명될 때 검은색 띠처럼 보이는 시신경의 등쪽

기록을 위해 마이크로 전극을 준비하려면 마이크로필 튜브를 통해 4mm 주사기 필터로 여과된 칼슘 프로브가 포함된 내부 용액으로 다시 채웁니다. 그런 다음 마이크로 전극을 마이크로 전극 홀더에 놓습니다. 다음으로, 전극에 소량의 연속 양압을 가합니다.

적색광 조명의 안내에 따라 마이크로 전극을 기록 챔버로 내립니다. 그런 다음 저전력 대물렌즈를 사용하여 SCN 위에 마이크로 전극을 놓습니다. 그런 다음 현미경을 고배율 배율로 전환하여 SCN의 하위 영역과 개별 SCN 뉴런을 선택합니다.

마이크로 전극이 세포 표면으로 전진할 때 마이크로 전극에 부드러운 양압을 계속 가합니다. 일단 표면에 놓이면 부드러운 음압을 가하여 3-10기가 옴의 저항으로 밀봉을 형성합니다. 그런 다음 멤브레인 전압을 마이너스 60밀리볼트로 조정하십시오.

그런 다음 전극에 추가 음압을 가하여 세포막을 파열시켜 전체 세포 패치 클램핑을 형성합니다. 전체 세포 모드에 들어가면 SCN 뉴런 소마와 수상돌기가 형광 프로브로 채워집니다. 전류 클램프 모드에서 멤브레인 전압을 측정하거나 전압 클램프 모드에서 전류를 측정합니다.

칼슘 프로브 이미지 데이터가 모니터링 및 저장되는 동안 획득된 이미지를 340나노미터 및 380나노미터 비율의 형광 데이터 그래프와 함께 볼 수 있습니다. 실험 중에는 모노 크로노미터를 사용하여 SCN을 자외선에 빠르게 노출시켜 칼슘 측정값을 정량적으로 얻습니다. 340나노미터 및 380나노미터에서 여기광은 UG 11 광학 필터를 통과하여 400나노미터 이상의 고조파 파장을 제한하고 400나노미터 DCLP 이색성 거울은 빛을 조직에 반사합니다.

방출된 빛은 510나노미터 방출 필터를 통과하여 카메라에 포착됩니다. 결과를 분석하려면 초기 이미지에서 관심 영역을 선택하고 상대 형광 강도 단위로 변환할 배경 영역을 선택합니다. 관심 영역 데이터는 실험 중에 실시간으로 표시됩니다.

배경은 나중에 후속 데이터 분석에서 사용됩니다. 다음은 SCN과 시신경을 포함하는 시상하부의 관상 절편의 명시야 이미지입니다. BISRA 2를 포함하는 내부 용액으로 채워진 유리 마이크로 전극이 단일 뉴런에 밀봉되어 있습니다.

다음은 전압 클램핑 SCN 뉴런에서 기록된 일련의 50가지 전압 단계에 대한 칼슘 반응입니다. 전압 개폐 나트륨 전류는 0.5 마이크로몰 TTX로 억제되었으며, 이는 칼슘 반응에 해당하는 체세포 및 수지상 관심 영역의 화면 캡처 이미지입니다. 다음은 다양한 수의 전압 단계에 대한 칼슘 반응의 예입니다.

이 그림은 막 전압과 세포 내 칼슘의 동시 기록을 보여줍니다. SCN 뉴런에서 전류 클램프 실험은 50 마이크로몰 리톡신이 있는 상태에서 수행되었습니다. 막 전위의 작은 탈분극은 여러 차례의 작용을 촉발했으며, 이에 따라 세포 내 칼슘의 상승과 그에 따른 하락으로 잠재력이 발화되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 건강한 미용 상부 핵 뇌 절편을 준비하고 전기 생리학 및 이미징 실험을 동시에 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.