Name: 시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 시교차상핵 뉴런에서 막전위 변화와 세포내 칼슘 농도의 상호작용을 동시에 측정하는 방법을. 패치 클램프와 bis-fura-2 칼슘 지시제를 활용하여 개별 뉴런의 전기생리학적 활동과 칼슘 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, GM096972)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. 시상하부 뇌 절편의 준비
<ol>
	<li>동물과 관련된 모든 절차에 대해 사전에 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받으십시오. 여기에 설명된 동물 절차는 2013년 동물 안락사에 대한 AVMA 지침과 일치하며 오리건 보건 과학 대학 IACUC의 사전 승인을 받았습니다.</li>
	<li>MgCl2 및 CaCl2 없이 슬라이싱 버퍼 500ml를 준비합니다(표 1). 실온에서 용액을 95%O2 및 5% CO2로 버블링한 다음 계속 폭기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 추가합니다. 자당을 사용하여 삼투압을 300mOsm으로 조정합니다. 삼투압은 증기압 삼투압계로 측정됩니다.</li>
	<li>MgCl2 및 CaCl2 없이 1L의 기록 매체를 준비합니다(표 2). 용액을 95 % O2 및 5 % CO2 로 거품을 일으킨 다음 계속 통기하면서 MgCl2 와 CaCl2 를 첨가합니다. NaOH (10 N)로 pH를 7.2-7.4로 조정하고 자당으로 삼투압을 300 mOsm으로 조정한다. HEPES 완충액의 추가는 선택 사항이며 pH를 더욱 안정화하는 데 사용되었습니다.</li>
	<li>슬라이싱 및 기록 용액은 사용하기 전에 며칠 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>아가로스 3%를 준비하고 멸균 페트리 접시(깊이 6mm)에 붓고 냉장 보관합니다.</li>
	<li>아가로스 큐브 3개를 약 6mm x 6mm x 6mm로 자릅니다.</li>
	<li>4주에서 8주 된 Sprague-Dawley 쥐를 이소플루란으로 깊이 마취시킵니다. 마취 깊이를 테스트합니다. 마취의 깊이는 발바닥을 꼬집은 후 뒷다리의 철수 반사가 없을 때 적절한 것으로 간주됩니다. 일단 적절하게 마취되면, 쥐는 신속한 참수로 안락사된다. </li>
	<li>먼저 시신경을 절단하도록 주의하면서 뇌를 빠르게 제거하고 5% CO2 및 95% O2로 포화된 얼음처럼 차가운 슬라이싱 용액에 넣고 2-3분 동안 식힙니다.</li>
	<li>뇌를 다듬습니다. 얼음 위에 놓인 유리 페트리 접시 위에 축축한(슬라이스 용액이 있는) 원형 여과지에 집게를 사용하여 뇌를 놓습니다.</li>
	<li>뇌를 관상상으로 절단하여 남아 있는 소뇌와 뇌간을 제거한 다음 상부 피질과 측면을 제거하여 시상하부를 포함하는 뇌 블록을 남기고 SCN, 시신경 및 시신경이 포함된 측면을 조심스럽게 보존합니다.</li>
	<li>뇌와 아가로스 블록을 부착할 수 있을 만큼 큰 시아노아크릴 접착제를 얼음처럼 차갑지만 건조한 마이크로톰 슬라이싱 챔버에 얇게 펴 바릅니다.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 뇌 블록 꼬리 쪽을 접착제 위에 아래로 옮기고 SCN이 포함된 면이 먼저 절단되도록 하고 시신경이 "V"자 모양을 위로 향하게 합니다.</li>
	<li>다른 3면에 아가로스 블록을 놓습니다. 챔버를 5% CO2 및 95% O2로 연속적으로 기포된 얼음처럼 차가운 슬라이싱 버퍼로 채웁니다. 시아노아크릴 접착제는 뇌와 아가로스 블록을 제자리에 고정하는 수분으로 응고됩니다.</li>
	<li>진동 블레이드 마이크로톰으로 SCN을 포함하는 관상 시상하부 절편(220-250μm 두께)을 자릅니다. 일반적으로 시신경이 약 2-4mm 너비인 곳에서 절편이 선택되며, SCN은 등쪽에 있는 SCN이 3번째 뇌실의 양쪽에 있는 시신경에 두 개의 작은 "움푹 들어간 곳"으로 나타나는 흰색 띠처럼 나타납니다(그림 1A).</li>
	<li>Leica DMLFS 현미경의 스테이지에 장착된 레코딩 챔버(36°C)에 슬라이스를 놓습니다. 챔버는 95% O2 및 5% CO2로 폭기되고 인라인 히터로 예열된 연속 유동 기록 용액(2ml/분)으로 채워집니다.</li>
	<li>절편 준비 후 0.5-8시간 후에 SCN 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 및 칼슘 이미징 기록을 수행합니다.</li>
</ol>
2. 패치 클램프 녹음
<ol>
	<li>전극 용액(세포 내) 용액을 총 최종 물 부피의 절반으로 준비합니다.</li>
	<li>용액을 KOH(1N)로 pH 7.3으로 조정합니다.</li>
	<li>남은 물을 넣으십시오. 용액의 최종 삼투압은 280-290mOsm 범위여야 합니다.</li>
	<li>전극 용액을 0.2μm 필터에 통과시키고 부분 표본(0.5ml)을 마이크로분리 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>1mg bis-fura-2 육사칼륨 염과 0.2μm 여과수 99.29μl를 혼합하여 칼슘 프로브 bis-fura-2 육사칼륨 염 원료 용액(10mM)을 준비합니다.</li>
	<li>별도의 튜브 (각각 2-5 μl)로 부분 표본을 넣고 동결 (-20 ° C)합니다.</li>
	<li>사용 직전에 내부 용액과 Ca2+ 프로브의 분취액을 해동합니다. 2μl의 bis-fura-2 원액을 400μl의 내부 용액에 추가하여 최종 50μM 칼슘 프로브 농도를 얻습니다. 용액을 혼합하기 위해 간단히 분쇄합니다. 칼슘 프로브 농도(10-250μM)는 실험 설계 및 이미징 시스템에 따라 다릅니다. bis-fura-2는 두 개의 연결된 fura-2 분자로 구성되어 있습니다.</li>
	<li>세포 내 용액으로 채울 때 약 1μm의 외부 팁 직경과 7-10MΩ의 저항으로 전체 세포 패치 전극을 2단계로 당깁니다.</li>
	<li>Microfil 튜브를 통해 저용량 시료에 대해 4mm 주사기 필터(0.2μm)로 여과된 칼슘 프로브가 포함된 내부 용액 몇 μl를 전극에 다시 채웁니다.</li>
	<li>전극에 소량의 양압을 가하면 적색광 조명 아래에서 녹음 챔버로 안내되므로 비디오 모니터에서 볼 수 있습니다. </li>
	<li>저전력 대물렌즈(4X)를 사용하여 SCN 위에 미세 전극을 놓습니다. SCN은 제3심실의 양쪽에 있는 두 개의 반투명 영역과 시신경 카이즘의 등쪽으로 식별됩니다(그림 1A).</li>
	<li>현미경을 고배율 배율(40X 또는 63X)로 전환합니다. SCN의 하위 영역과 개별 SCN 뉴런은 더 높은 배율로 기록하기 위해 표적이 될 수 있습니다.</li>
	<li>미세 전극이 뉴런 표면으로 전진할 때 부드러운 양압을 가합니다.</li>
	<li>미세 전극에 부드러운 음압을 가하여 3-10GΩ의 저항을 가진 밀봉을 형성합니다.</li>
	<li>수집 소프트웨어로 제어되는 증폭기를 사용하여 멤브레인 전압을 -60mV로 조정합니다.</li>
	<li>전극에 추가 음압을 가하여 세포막을 전체 세포 모드로 파열합니다.</li>
	<li>전체 세포 모드에 들어가면 SCN 뉴런, 소마 및 수상돌기가 형광 프로브로 채워집니다.</li>
	<li>멤브레인 전압은 칼슘 프로브 이미지 데이터가 모니터링 및 저장되는 동안 전류 클램프 모드에서 측정되거나 전압 클램프 모드에서 전류가 측정됩니다(아래 설명 참조). 실험 중 340nm/380nm 비율의 형광 데이터 그래프와 함께 획득한 이미지를 볼 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 세포 내 Ca2+ 측정
<ol>
	<li>정량적 Ca2+ 측정은 10nm 대역폭의 모노크로노미터를 통해 340nm 및 380nm에서 자외선으로 조직을 빠르게 여기하고 UG11 광학 필터를 통과하여 400nm 이상의 고조파 파장, 400nm DCLP 이색성 및 510±40nm 방출 필터를 통해 방출된 빛을 제한하여 한 쌍의 이미지를 기록하여 얻습니다.</li>
	<li>이미지는 광표백을 최소화하고 레코딩 속도를 최대화하도록 획득 시간과 비닝을 조정한 냉각식 CCD 카메라를 사용하여 획득됩니다.</li>
	<li>정량적 이미징 소프트웨어는 이미지를 획득하고 표시하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>초기 이미지에서 상대 형광 강도 단위 데이터(예: soma, dendrite 등)로 변환할 관심 영역을 선택합니다. 또한 배경 형광을 측정할 영역을 선택합니다(그림 1B).</li>
	<li>원시 이미지와 정량화된 광학 데이터는 실험 중에 지속적으로 저장됩니다. 실험 후, 저장된 이미지는 일반적으로 정량화할 관심 영역을 보다 정확하게 선택하는 데 더 많은 시간이 소요될 수 있을 때 다시 분석됩니다.</li>
	<li>데이터는 추정된 세포 내 칼슘 농도(Est[Ca2+]i)로 제시될 수 있습니다. 칼슘 농도를 계산하기 위해 340 nm에서 여기(excitation)와 배경 빼기(background subtraction)를 380 nm로 나눈 값(R)을 340 nm 및 380 nm로 나눈 값이 칼슘 농도4를 계산하는 데 사용된다. 배경 빼기 및 기타 계산은 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.</li>
	<li>최대 및 최소 bis-fura-2 형광의 체외 측정은 Ca2+ 결합의 경우 10mM CaCl2, Ca2+ 자유 조건의 경우 10mM EGTA를 사용하여 수행할 수 있습니다. 프로브의 Ca2+ 분리 상수, Kd는 bis-fura-2(Invitrogen)에 대해 370nM으로 간주됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

위에서 설명한 방법은 뉴런 막 전기적 활동과 세포내 칼슘 농도 사이의 연관성을 동시에 기록하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법은 형광 염료를 사용한 세포내 칼슘 측정이라는 두 가지 매우 잘 특성화된 방법, 즉 전체 세포 패치 클램프 기록과 세포내 칼슘 측정을 결합한다는 점에서 여러 가지 강점을 가지고 있습니다. 우리의 접근 방식은 다른 연구자가 설명한 것과 유사합니다6,23.
이 방법을 사용할 때 여러 항목을 고려해야 합니다. 첫 번째는 세포 내 미세전극 용액으로 세포 내용물을 투석하는 전체 세포 패치 구성의 사용입니다. 투석은 전압 개폐 이온 채널의 런다운과 두 번째 메신저 매개 신호의 손실로 이어질 수 있습니다24-26. 둘째, 세포 손상 또는 기가옴 밀봉의 손상은 세포 입력 저항 감소와 관련될 수 있는 칼슘 수치 증가를 초래할 수 있습니다24. 셋째, 프로브가 포함된 세포간 용액은 미세전극 팁...

유전자 발현의 변화는 시냅스 신호전달의 결과로 뉴런에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트에 의한 신호전달은 신경세포막의 전위를 탈분극시켜 결국 유전자 전사 및 번역을 유도할 수 있습니다1,2. 글루타메이트에 의한 이온성 수용체의 활성화는 세포 외 칼슘 이온이 세포로 들어갈 수 있도록 하며, 이는 유전자 전사를 활성화하는 데 있어 두 번째 전달자로서 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 활동전위 발화 빈도와 같은 막의 전기적 활동과 세포 내 칼슘 농도의 변화 사이의 관계를 평가하려면 전체 세포 패치 클램핑과 형광 칼슘 프로브3-5의 정량적 이미징의 두 가지 방법을 조합하여 개별 뉴런에서 관계를 연구할 수 있어야 합니다. 단일 세포 기록 기술을 사용하면 뇌의 식별 가능한 부분에서 개별 뉴런의 활동을 기록할 수 있습니다. 전체 세포 기록 기술을 사용하면 멤브레인 전압 또는 전류를 제어할 수 있으므로 특정 이온 채널 전류를 실험적으로 조작할 수 있습니다. 형광 칼슘 프로브로 채워진 마이크로피펫을 사용하면 뉴런이 칼슘 프로브로 잘 채워지도록 할 수 있습니다. 이 기술은 성체 절편 제제에서 뇌 절편 제제로 작업할 때 분명한 이점이 있는데, 이러한 뉴런은 더 일반적인 세포 투과 프로브를 사용하여 로드하기가 특히 어렵고 잠재적인 배경 형광 문제를 줄이기 때문입니다6-8.
빛은 포유류가 시상하부상핵(SCN)에 위치한 생체 시계를 조정하는 주요 방법입니다. 망막에서 전달되는 빛 정보는 SCN12,13에서 글루타메이트가 분비되는 망막시상하부관(RHT)을 통해 9-11로 전달됩니다. 글루타메이트는 SCN 뉴런에 위치한 NMDA 및 AMPA 이온성 수용체를 열어 칼슘과 나트륨의 유입을 생성하고, 궁극적으로 시계 유전자14-17 계열의 발현을 변경하고 생체 시계18-20의 위상을 변화시키는 세포 내 신호 전달 폭포를 시작합니다. 그러나 칼슘은 이온성 글루타메이트 수용체를 통해 직접 또는 막 탈분극 및 전압 의존성 칼슘 채널(VDCC)의 활성화를 통해 뉴런에 들어갈 수 있습니다21. 따라서 우리는 활동 전위 발화 및 시냅스 입력22에서 발생하는 것과 같은 SCN 뉴런에서 세포 내 칼슘 농도와 막 전기 활동 사이의 관계를 조사하기 위한 실험 프로토콜을 개발했습니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>피셔 사이언티픽 (주)</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; H2O</td><td>시그마 케미컬</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>피셔 사이언티픽 Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>피셔 사이언티픽 (</td>주)<td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 D-글루코네이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디칼륨 염 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5&프라임;-트리포스페이트 트리스 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>아가로스(초순수)</td><td>생명 기술</td><td>15510-027</td><td>멸균 페트리 접시에 겔 구멍 6mm 두께 층</td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>비스 - 푸라 - 2, 헥사 칼륨 염</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>셀 불침투성</td></tr><tr><td>장비 이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>조직 슬라이싱</td></tr><tr><td>시아노아크릴 접착제(Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 풀러</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>4X, 40X UV 및 63X UV 대물렌즈 및 에피 형광</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 비트 CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 필터 큐브</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>UG11 필터</td></tr><tr><td>포함 세트 Polychrome IV</td><td>Till Photonics GmBH</td><td></td><td>모노크로노미터</td></tr><tr><td>자외선 차단 보안경</td><td>자외선 제품</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9 증폭기</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>분자 장치</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>패치 마스터</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>데이터 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>이고르 버전 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>전기 생리학 및 Ca2+ 데이터 분석</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>증기압 삼투압 온도계</td></tr></tbody></table>

시교차상핵 뉴런(suprachiasmatic nucleus neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(simultaneous electrophysiological recording and calcium imaging of suprachiasmatic nucleus neurons)

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

동시 전기생리학 및 형광 이미징 기록 방법을 사용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 데 있어 막 전위 또는 전류의 변화의 역할을 연구했습니다. 명암 주기와 같은 환경 조건의 변화는 뉴런 및 신경망 활동과 포유류 뇌에서 마스터 일주기 시계의 위치인 시교차상핵(SCN) 내 일주기 시계 유전자 군의 발현을 수정할 수 있습니다. 흥분성 시냅스 전달은 시냅스후 Ca2+ 농도의 증가로 이어지며, 이는 일주기 시계 유전자의 리듬 발현을 변화시키는 신호 경로를 활성화하는 것으로 여겨집니다. SCN을 포함하는 시상하부 절편은 칼슘 지시약 bis-fura-2를 포함하는 내부 용액으로 채워진 미세 전극을 사용하여 패치 고정되었습니다. 미세전극과 SCN 뉴런 멤브레인 사이에 밀봉이 형성된 후, 부드러운 흡입을 사용하여 멤브레인을 파열하고 칼슘 프로브를 소마와 수상돌기를 모두 채우는 뉴런으로 확산시켰습니다. 세포 내 칼슘 농도의 정량적 비율계량 측정은 막 전위 또는 전류와 동시에 기록되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 개별 뉴런의 시냅스 활성 및 활동 전위 발화에 의해 생성되는 세포 내 칼슘 농도 변화의 역할을 연구할 수 있습니다. 이 프레젠테이션에서는 뇌 절편에 유지되는 개별 SCN 뉴런의 세포 내 칼슘과 함께 전기생리학적 활동을 동시에 기록하는 방법을 보여줍니다.

시상하부 뇌 절편을 사용하여, 전압 및 전류 클램프 조건 모두에서 whole cell 모드로 세포 내 칼슘 변화를 동시에 기록하였습니다. Figure 1A에 표시된 미세전극은 약간의 양압을 가한 상태에서 고배율(40X 또는 63X UV 대물렌즈)로 원하는 위치까지 내립니다. 뉴런에 접촉한 후, 가벼운 흡입을 통해 gigaohm seal을 형성합니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 전위를 -60 mV로 설정한 후, 추가적인 흡입으로 막을 파괴하여 whole cell 구성을 만듭니다. 모니터로 관찰하면 뉴런 내부에 프로브가 빠르게 채워지는 것을 볼 수 있습니다. 세포체와 유사한 초점 평면에 있는 수지상 돌기를 시각화할 수 있습니다(Figure 1A 삽입도). 또는 초점을 조정하여 원위 수지상 돌기의 칼슘 변화를 측정할 수 있습니다. -60 mV의 전압 클램프 모드에서 기록하며, 10 Hz로 +20 mV까지 짧은(2 msec) 스텝을 가하여 활동 전위 발화를 시뮬레이션하였는데...

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

다음 실험의 전반적인 목표는 작용의 변화, 잠재적 발화 빈도 및 상부 핵 뉴런의 세포 내 칼슘 농도와 같은 전압 또는 전류의 변화 간의 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이는 칼슘에 민감한 프로브로 채워진 미세 전극을 사용하여 SMA 핵 뉴런을 기록하기 위해 뇌 절편을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 마이크로 전극은 신경 세포막으로 밀봉됩니다.다음으로, 마이크로 전극으로 밀봉된 신경세포막을 파열하여 칼슘 형광 프로브를 개별 뉴런에 도입하고 멤브레인과 함께 전기활성 결과를 기록하여 전압 또는 전류를 측정하고 두 파장에서 칼슘 프로브 형광의 이미지를 얻고 이러한 파장에서 형광 비율의 변화는 뉴런 내 세포 내 칼슘의 변화를 반영합니다. 세포의 칼슘 농도를 결정하기 위해 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시냅스 활성화에 의해 생성된 막 전기 활동과 세포 내 칼슘의 변화를 개별 미용 핵 뉴런에서 동시에 측정할 수 있다는 것입니다.이 기술을 시연하는 사람은 제 동료인 로버트 어윈 박사입니다. 유리 페트리 접시에 슬라이스 용액을 적신 원형 여과지에 쥐의 뇌를 놓고 얼음 위에 올려 놓고 소뇌와 뇌간을 제거하기 위해 뇌 코로나를 자르고 피질의 오른쪽과 왼쪽 부분을 잘라내어 시상 하부를 포함하는 뇌 블록을 남기고 SCN 시신경과 시신경을 포함하는 뇌의 복부 쪽을 조심스럽게 보존합니다. 그 후, 얼음처럼 차가운 마이크로톰 슬라이싱 챔버에 뇌와 아로스 블록을 부착할 수 있을 만큼 큰 사노 아크릴 접착제를 얇게 펴 바릅니다.얼음처럼 차가운 뇌 블록을 접착제 위에 아래로 향하게 하여 SCN이 포함된 면을 먼저 절단하고 시신경을 V자로 형성하여 다른 세 면에 aros 블록을 놓습니다. 그런 다음 챔버를 얼음 차가운 슬라이스 버퍼로 채우고 발탄원으로 지속적으로 거품을 일으킵니다. Sano 아크릴 접착제는 수분으로 응고되어 뇌와 aros 블록을 제자리에 고정합니다.그런 다음 SCN이 포함된 관상 시상하부 절편을 220-250미크론 두께로 자릅니다. 절단 중에 왼쪽 aros 블록이 분리되었습니다. 이것은 접착제가 충분하지 않은 경우 발생할 수 있습니다.그런 다음 SCN이 포함된 슬라이스를 식별합니다. 일반적으로 시신경이 약 2-4mm 너비로 흰색 띠처럼 보이는 슬라이스를 선택하고 SCN은 등쪽에 제3심실 양쪽의 시신경에 두 개의 작은 움푹 들어간 곳으로 나타납니다. 슬라이스를 현미경 스테이지에 장착된 섭씨 36도의 기록 챔버로 옮깁니다.챔버는 분당 2밀리리터의 속도로 연속적으로 흐르는 녹음 용액으로 채워져 있습니다. 95% 탄화로 폭기되고 인라인 히터로 예열되었습니다. 제3뇌실의 양쪽에 있는 두 개의 반투명 SCN 핵을 관찰하여 SCN을 식별하며, 투과광에 의해 조명될 때 검은색 띠처럼 보이는 시신경의 등쪽에 있습니다.기록을 위해 마이크로 전극을 준비하려면 마이크로필 튜브를 통해 4mm 주사기 필터로 여과된 칼슘 프로브가 포함된 내부 용액으로 다시 채웁니다. 그런 다음 마이크로 전극을 마이크로 전극 홀더에 놓습니다. 다음으로, 전극에 소량의 연속 양압을 가합니다.적색광 조명의 안내에 따라 마이크로 전극을 기록 챔버로 내립니다. 그런 다음 저전력 대물렌즈를 사용하여 SCN 위에 마이크로 전극을 놓습니다. 그런 다음 현미경을 고배율 배율로 전환하여 SCN의 하위 영역과 개별 SCN 뉴런을 선택합니다.마이크로 전극이 세포 표면으로 전진할 때 마이크로 전극에 부드러운 양압을 계속 가합니다. 일단 표면에 놓이면 부드러운 음압을 가하여 3-10기가 옴의 저항으로 밀봉을 형성합니다. 그런 다음 멤브레인 전압을 마이너스 60밀리볼트로 조정하십시오.그런 다음 전극에 추가 음압을 가하여 세포막을 파열시켜 전체 세포 패치 클램핑을 형성합니다. 전체 세포 모드에 들어가면 SCN 뉴런 소마와 수상돌기가 형광 프로브로 채워집니다. 전류 클램프 모드에서 멤브레인 전압을 측정하거나 전압 클램프 모드에서 전류를 측정합니다.칼슘 프로브 이미지 데이터가 모니터링 및 저장되는 동안 획득된 이미지를 340나노미터 및 380나노미터 비율의 형광 데이터 그래프와 함께 볼 수 있습니다. 실험 중에는 모노 크로노미터를 사용하여 SCN을 자외선에 빠르게 노출시켜 칼슘 측정값을 정량적으로 얻습니다. 340나노미터 및 380나노미터에서 여기광은 UG 11 광학 필터를 통과하여 400나노미터 이상의 고조파 파장을 제한하고 400나노미터 DCLP 이색성 거울은 빛을 조직에 반사합니다.방출된 빛은 510나노미터 방출 필터를 통과하여 카메라에 포착됩니다. 결과를 분석하려면 초기 이미지에서 관심 영역을 선택하고 상대 형광 강도 단위로 변환할 배경 영역을 선택합니다. 관심 영역 데이터는 실험 중에 실시간으로 표시됩니다.배경은 나중에 후속 데이터 분석에서 사용됩니다. 다음은 SCN과 시신경을 포함하는 시상하부의 관상 절편의 명시야 이미지입니다. BISRA 2를 포함하는 내부 용액으로 채워진 유리 마이크로 전극이 단일 뉴런에 밀봉되어 있습니다.다음은 전압 클램핑 SCN 뉴런에서 기록된 일련의 50가지 전압 단계에 대한 칼슘 반응입니다. 전압 개폐 나트륨 전류는 0.5 마이크로몰 TTX로 억제되었으며, 이는 칼슘 반응에 해당하는 체세포 및 수지상 관심 영역의 화면 캡처 이미지입니다. 다음은 다양한 수의 전압 단계에 대한 칼슘 반응의 예입니다.이 그림은 막 전압과 세포 내 칼슘의 동시 기록을 보여줍니다. SCN 뉴런에서 전류 클램프 실험은 50 마이크로몰 리톡신이 있는 상태에서 수행되었습니다. 막 전위의 작은 탈분극은 여러 차례의 작용을 촉발했으며, 이에 따라 세포 내 칼슘의 상승과 그에 따른 하락으로 잠재력이 발화되었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 건강한 미용 상부 핵 뇌 절편을 준비하고 전기 생리학 및 이미징 실험을 동시에 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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연구

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Neuroscience

신경과학

시상하부 신경 세포의 동시 전기생리학적 기록 및 칼슘 이미지 촬영

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시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons) (동영상) | JoVE Journal

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

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