먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 성충 파리 Salala Melanogaster의 음식 부족으로 유발된 행동 변화를 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 18-24 시간 동안 굶주린 파리에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 개별 파리를 행동 챔버에 로드하는 것인데, 각 챔버에는 중앙에 매력적인 냄새 소스가 포함되어 있습니다.

다음으로, 디지털 카메라가 장착된 컴퓨터 시스템은 시간이 지남에 따라 각 파리의 위치를 추적하고 기록합니다. 나중에 데이터를 분석하기 위한 좌표입니다. 마지막 단계는 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 각 파리가 악취원에 도달하는 대기 시간을 결정하는 것입니다.

궁극적으로, 이 고처리량 음식 검색 행동 분석은 신경 회로 기능과 행동 반응 사이의 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 팀원과 같은 기존 방법에 비해 이 분석의 주요 장점은 단일 파리에서 화학주성 거동을 정량화한다는 것입니다. 이 방법은 어떤 신경 회로가 화학주성 행동에 중요한지, 이러한 신경 회로가 동물의 내부 생리학적 상태에 의해 어떻게 조절되는지와 같은 신경 생물학의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 목표는 짧은 시간에 큰 동작 데이터 세트를 얻는 것입니다. 이 방법을 통해 수렵 행동에 대한 통찰력을 얻을 수 있었지만 위치 파악과 같은 다른 행동을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.

플라이의 적절한 취급과 컴퓨터 소프트웨어의 실행은 이 실험의 성공에 필수적입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 파리를 부드럽게 다루는 방법을 배우는 데 약간의 시간과 인내가 필요하기 때문에 처음에는 약간 어려움을 겪을 수 있습니다. 내 실험실 Before fly 컬렉션의 기술자에게 연락하십시오.

실험용 비행을 12시간 밝고 어두운 주기로 제어된 온도 및 습도 조건에서 비행합니다. EEC 폭발 당일에는 현미경으로 성교시키기 전에 이산화탄소로 파리를 마취시킵니다. 남성과 여성을 구별하기 위해 몇 가지 기본 기준을 사용할 수 있습니다.

수컷은 암컷이 가지고 있지 않은 섹스 빗이라고 하는 네 다리에 검은색 강모 패치가 있습니다. 또한 수컷의 복부 끝은 어두운 표피와 암컷에서는 볼 수 없는 생식기를 드러내고, 암컷을 모아 4-5마리의 흰 눈을 가진 수컷과 함께 유리병 연령당 최대 30마리의 파리를 가진 새로운 먹이 줄에 넣습니다. 파리는 2일에서 5일 동안 먼저 하나의 조직을 빈 플라스틱 유리병의 바닥으로 밀어 넣고 조직을 증류수로 완전히 적셔 파리가 굶주릴

그런 다음 물체를 사용하여 조직을 누르고 여분의 물을 부드럽게 짜냅니다. 바이알을 뒤집어 여분의 물을 버립니다. 파리에게 수분을 공급할 수 있을 만큼 충분한 물이 있어야 하고 기아실은 촉촉해야 하지만 파리가 익사할 정도는 아니어야 합니다.

실험이 시작되기 약 18시간에서 24시간 전에 식량 바이알에서 파리를 기아 챔버로 옮기고 바이알을 막습니다. 실험이 시작될 때까지 바이알을 제어된 온도 및 습도 조건에서 밤새 보관하십시오. 증류수 100ml에 저용융 온도 aros 100mg을 첨가하여 1% 농업 용액을 준비합니다.

유리 플라스크에 담겨 있습니다. 농업 용액이 끓기 시작할 때까지 전자 레인지에서 가열하되 끓기 전에 전자 레인지를 멈추고 플라스크를 한 번 휘젓습니다. 아로스가 완전히 녹을 때까지 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

핫 플레이트에서 플라스크를 따뜻하게 유지하여 Aros 용액을 액체 상태로 유지하십시오. 섭씨 50도로 설정하고 990%aro 용액 10마이크로리터와 사과 사이다 식초 1.5마이크로리터를 1.5ml 업엔드 DF 튜브에 추가합니다. 1% 사과 사이다 식초 용액을 만들려면 섭씨 50도로 설정된 건식욕 인큐베이터에 넣기 전에 용액이 혼합될 때까지 소용돌이치고 시험장을 온도 및 습도와 같은 원하는 조건으로 설정하십시오.

660나노미터 LED 패널을 켭니다. 체와 테스트 플레이트를 뜨거운 물로 헹구고 모든 수분이 증발할 때까지 건조 오븐에서 가열합니다. 시원하다. 체와 플레이트는 시험실 온도까지 내려갑니다.

실험을 시작하기 전에 디퓨저 플레이트 위에 얕은 접시를 놓고 물을 채워 국소 습도를 높이고 아로스 방울의 물을 가립니다. 마지막으로 물 접시 위에 체를 놓습니다. 테스트 플레이트는 투명 아크릴로 만들어졌으며 6개의 테스트 경기장으로 구성되어 있습니다.

슬라이더에는 플라이 적재, 임시 격리 및 6마리의 파리를 각각의 챔버로 동시에 방출할 수 있는 수용실이 포함되어 있습니다. 실험이 시작될 때 플레이트의 각 영역 중앙에 새겨진 십자선은 냄새 물질을 피펫으로 주입해야 함을 나타냅니다. 슬라이더를 아크릴 테스트 플레이트에 삽입합니다.

흡입기를 면 마개를 지나 바이알에 부드럽게 밀어 넣고 약 6마리의 파리가 흡입기 안으로 들어가도록 합니다. 가능한 한 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 사진 촬영 전술을 활용하고, 파리를 유인하기 위한 비행 행동, 유리병 입구를 희미한 광원 쪽으로 향하게 하여 흡인기 쪽으로 걸어갈 수 있습니다.

필요한 경우 약 6마리의 암컷 파리를 흡인하기 위해 부드러운 흡입을 가할 수 있습니다. 흰 눈 수컷 파리를 선택하지 마십시오. 흡인기의 끝을 테스트 플레이트의 첫 번째 구멍에 삽입합니다.

단일 플라이가 홀딩 셀로 통과하도록 하고 슬라이더를 부드럽게 앞으로 앞으로 밀어 다음 구멍에 다른 플라이를 로드합니다. 파리가 날아갈 때까지 계속하십시오. 플레이트의 6개 홀딩 셀을 모두 차지합니다.

그런 다음 1% 사과 사이다 식초 수액 5마이크로리터를 테스트 플레이트 안쪽의 십자선 중앙에 직접 피펫으로 넣습니다. 테스트 플레이트를 중앙에 배치하려면 포지셔닝 툴 vi라는 파일을 엽니다. 화면 왼쪽 상단 모서리에 있는 흰색 화살표를 클릭하여 파일을 실행합니다.

경기장 개구부가 SIV 바닥을 향하고 냄새 대상이 플레이트의 천장에 있도록 테스트 플레이트를 sib 위에 놓습니다. 정렬이 완료되면 테스트 플레이트의 십자선을 모니터 화면의 십자 공기에 맞춥니다. 모니터의 왼쪽 상단 모서리 근처에 있는 빨간색 점을 클릭하여 실행을 중단하여 파리의 좌표를 추적하고 기록합니다.

각 식품 검색 시도 중에 수집 소프트웨어 파일을 엽니다. 비행 추적 6 vi. 모니터의 왼쪽 상단 모서리에 있는 흰색 화살표를 클릭하여 파일을 실행합니다.

파일에 이름을 할당하고 확인을 클릭합니다. 실험실에서 슬라이더를 전진시켜 파리를 테스트 경기장으로 풀어줍니다. 테스트 챔버를 움직이면 좌표가 잘못 기록될 수 있으므로 주의해야 합니다.

시작을 클릭하고 테스트 챔버의 유일한 광원이 LED 패널인지 확인합니다. 시험이 끝나면 체와 거동 챔버를 제거합니다. 체에서 시험판을 들어 올리고 판을 얼음에 담가 파리를 제거합니다.

뜨거운 물로 플레이트를 부드럽게 청소하고 아그로스 찌꺼기를 제거합니다. 테스트 플레이트를 건조 오븐에 넣어 수분을 제거합니다. 약 2분 동안 작은 팬을 켜서 테스트 영역을 환기시킵니다.

팬을 끄고 다음 파리 그룹을 다음 테스트 플레이트에 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 데이터 분석 소프트웨어와 레이아웃은 일련의 분석 기준에 따라 10분 동안 각 플라이의 성능을 평가하는 데 사용됩니다.

이러한 기준은 각 파리의 데이터가 데이터 분석에 사용되는지 여부를 결정하는 데 사용되며 부상, 질병, 스트레스 또는 동기 부여 부족으로 인해 먹이 검색 작업을 수행할 수 없는 파리를 제거하도록 설계되었으며, 300초 이상 비활성 상태인 파리는 비활성 상태로 간주되며 이미 먹이 출처 또는 전시회를 찾는 데 성공하지 않은 한 데이터 세트에서 거부됩니다. 비활성 기간 이후 최소 100초 동안 초당 10mm 이상의 평균 속도가 있어야 활성 냄새의 초기 단계에서 건강한 속도를 보이는 파리만 선택합니다. 검색: 시험의 처음 50초 동안 특정 속도 범위 내에서 이동하는 파리만 데이터 분석에 허용되며, 시험이 시작된 후 경기장의 4개 사분면을 모두 통과하지 않고 먹이 공급원으로 직진하는 파리는 거부됩니다.

최소 50초 동안 반경 10mm 이내의 먹이 공급원을 향해 이동하거나 먹이 공급원에서 멀어지는 파리는 먹이 공급원을 성공적으로 찾은 것으로 간주됩니다. 시간 경과에 따른 냄새 발생원에서 파리까지의 거리를 나타내는 플롯은 파리 위치에 눈에 띄는 아티팩트가 있는 이 드문 경우 경기장을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 추적도 거부됩니다.

아티팩트는 데이터 수집 소프트웨어가 파리가 아닌 다른 물체를 감지하는 모든 이벤트에 의해 생성될 수 있습니다. 그들은 종종 경기장을 가로 질러 뻗어 있거나 중심에서 방사형으로 뻗어있는 긴 직선으로 나타납니다. 18시간에서 24시간 동안 굶주린 성충 파리는 먹이를 먹은 파리보다 음식 관련 냄새에 대한 후각 민감도가 더 높습니다.

음식 냄새 소스를 성공적으로 찾은 파리의 누적 비율에 대한 그래픽 플롯은 굶주린 파리의 30%가 10분 이내에 성공한다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, 모든 먹이를 먹은 파리의 7%만이 그렇게 합니다. 굶주린 파리는 어그로스 차량만 사용하는 것보다 식초에 훨씬 더 큰 매력을 보여야 하며, 이 관찰은 테스트 조건의 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 야생형 파리를 사용하여 섭씨 32도, 환경 습도 35%에서 수행된 이 음식 검색 실험에서 식초에 대한 파리의 유인과 아로스 대조군 사이에 큰 차이가 감지되지 않았는데, 이는 더 따뜻한 테스트 온도에서 아그로스 물방울에서 발견되는 물에 대한 인력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 테스트 습도를 50%에서 60% 사이로 증가시킴으로써 이러한 행동 변화가 수정되었고 식초와 아그로스 차량에 대한 매력 사이의 유의미한 차이가 복원되었습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 10분 실험 시험을 포함하여 12번에 걸쳐 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 파리를 다치게 하거나 방해하지 않도록 매우 부드럽게 다루어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 테스트 플레이트와 체는 건조 오븐에 있을 때 매우 뜨거울 수 있으므로 개발 후 오븐 장갑을 착용한 상태에서 제거해야 합니다. 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 화학주성 거동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 기술은 또한 다른 냄새 물체를 찾는 파리의 능력을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 수컷 파리의 짝 국소화 행동 연구에 적용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험을 준비하고, 실험 조건을 조정하고, 실험을 실행하고, 각 파리의 성능을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 궁극적으로 냄새 소스를 성공적으로 찾은 파리의 비율을 보여주는 누적 플롯을 제공할 것입니다.