Name: 전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 냉동전자현미경을 이용해 신경세포의 미토콘드리아 내 칼슘 농도를 정량 측정하는 방법을. EPMA 기술로 세포소기관 수준의 해상도에서 칼슘 분포 변화를 분석하여 신경신호전달 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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우리는 우수한 기술 지원을 부인 크리스틴 A. 윈터스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램, NIH (Z01 NS002610)의 기본 신경 과학 프로그램에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 접근 방식은 특정 악기, 도구 및 소프트웨어를 사용하여 개발되었다. 실험실이 같은 실험 장치를 사용하지 않기 때문에 접근이 가능한 일반화되어있다. 1. 급속 냉동 그들이 동결 순간 생균에 있었던 것에 정량적 확산 조직 성분 및 화학 원소의 분포를 유지하는 방식으로 세포 또는 조직의 하나) &quot;cryofixation&quot;설명하는 분석 방법에 대한 극저온 접근법에 절대적으로 의존 그리고 2) 극박의 제조는 TEM 이미징 및 분석에 적절한 저온부. 이러한 기술은 간략히 설명하지만, 다른 실험실에서이 절차를 재현하는 데 필요한 세부 사항은이 기사의 범위를 벗어난다됩니다. 관심있는 독자는 우수한 최근 기사 8:9,14라고합니다. 주의 :이 섹션에서는 액체 비누의 사용을 설명합니다가연성 및 폭발 위험이 있습니다 efied 에탄,, 적절한 예방 조치가 취해 져야한다. 연산자는 액체 질소에 대해 잘 알고 있어야합니다 (LN 2) 보호 실험실 코트, 안경 및 장갑을 포함 cryoresistant 안전주의 사항. 참고 : 다음과 전반에 걸쳐, 모든 도구 (집게 등) 냉동 표본 실수로 해동을 피하기 위해 사용하기 전에 LN 2 예비 냉각해야합니다 처리하는 데 사용. 커버 슬립에 배양 된 세포 <ol><li> LN 2 냉각 중앙에 잘 -160 ° C에서 기체 에탄을 응축에 의해 급락 냉동 장치를 준비합니다. 마크에 입력하고 피벗 알루미늄 뚜껑을 사용하지 않을로 잘 커버. </li><li> 얇은 수성 필름 실험적으로 적절한 조건에서 배양 된 세포의 플라스틱 커버 슬립을 얼룩 여과지 웨지를 사용. 조직을 건드리지 않도록으로 에지로부터 가릴; 시행 착오에 의해 결정된 최적의 잔여 필름은, 가능한 한 얇은하지만 너무 번째 아니다조직 표면의 건조를 증발 할 수 있어야하기에. </li><li> 클램프 집게로 모서리를 커버 슬립을 들고, 신속하게 수동으로 또는 중력 구동 플런저를 사용하여, 액체 에탄에 몰두. </li><li> 장기 저장 용기에 커버 슬립의 원하는 번호를 조작하기에 충분히 큰 LN 2의 인근 스티로폼 그릇에 고정 된 커버 슬립을 놓습니다. LN 2에서 포착하지 않는 알루미늄 스크류 캡 캔 권장합니다. </li></ol> 배양 된 뇌 조각의 급속 냉동 <ol start="5"><li> 해부 현미경,보기 및 방향 그대로 여전히 문화 막 삽입에 첨부 된의 Organotypic 해마 슬라이스를 아래에서. 검은 빈틈 형 펜 및 사진과 조각의 가장자리 부근에있는 막에 기준 마크를 배치합니다. </li><li> 아직도 현미경, 약 잘라. 사각형을 중심으로 각각의 조각 5 × 5 ㎜의 막 사각형입니다. 조각을 만지거나 membran이 구부러지지 않도록전자. </li><li> (아래에 설명) cryoultramicrotome에 맞게 사용자 정의 만든 디자인 된 알루미늄 디스크의 직경 한천 패드의 ¼에 의해 쿠션 막 지원 조각, 설치합니다. 신속 공압 정의 &quot;슬램 동결&quot;장치에 의해 LN 2 냉각 사파이어 블록에 대해 그것을 추진하여 슬라이스를 동결. </li><li> 배양 된 세포에 설명 된대로 스토리지로 이동합니다. </li></ol> 2. 저온 절편 제작 주의 : 간단하고 논리적, 교육, 인내와 많은 연습을 필요로하는 동안 성공적으로, 얇은 부분의 건조 컷 리본을 생산. <ol><li> -135 ° C.에 cryoattachment 멋진 장착 cryoultramicrotome를 구워 </li><li> 약에 냉동 커버 슬립을 잘라. 날카로운, 예비 냉각 메스를 사용하여 3 × 3mm 사각형. 문화가 표준 3, 점성 액체 &quot;cryoglue&quot;에 (에탄올 1시 6분 혼합물과 2 - 프로판올 11) 향 조각을 포함마이크로톰 시험편 척 맞게 설계된 mm 직경의 알루미늄 핀. 문화 표면에 cryoglue 유출하지 마십시오. -160 ° C를 ≤하는 cryobox 온도를 낮추는 방법으로 cryoglue 고형화 <ul class="lalpha"><li> 냉동 뇌 조각의 경우, 안전하게 나사 고리에 의해 맞춤 제작 표본 척에 직접 디스크를 연결합니다. </li></ul></li><li> 약에 - 조각의 커버 슬립의 조각 또는 확인 된 지역의 예를 들면 세포가 풍부한 지역 - 냉동 표본의 선택 영역을 낸다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 250 × 250 μm의 블록 얼​​굴 ~ 100 μm의 깊이. </li><li> 캘리포니아에서 얇은 부분의 드라이 컷 리본. 35 ° 다이아몬드 cryoknife를 사용하여 -160 ° C에서, referencs 4, 9에 설명 기본적으로. 절삭 속도와 나이프 여유 각은 경험적으로 결정되며 좋은 출발점이 9 ℃에서 0.4 ~ 0.6 mm / 초이다. 수화 부분의 공칭 두께, 즉 표본 사전, 난섹션은 주로 압축으로 인해, 실제로는 1.5-2.0 배 두꺼운 있지만, 일반적으로 80 나노 미터의. 만족 절편의 경우, 정전기 방지 장치가 필수적이다. 나이프 에지에서 장치 0.5 cm의 이온화 팁을 놓고 섹션의 만족스러운 리본이 될 때까지 출력을 조절합니다. </li><li> 나무 주걱 지팡이 (에폭시) 속눈썹을 접착하여 속눈썹 프로브를 준비합니다. 이러한 프로브를 사용하여, 픽업 칼의 뒷면에서 전송 섹션 100 메쉬 접는 구리 그리드에 캐스팅 글로우 방전, 탄소 코팅 pioloform 지원 필름 상에 뒤에 작업 선반에 반 접힌 인듐 호일 봉투에 휴식 칼. 감기 눌러 도구를 사용하여 그리드와 봉투의 위쪽 절반 눌러 접는다. </li><li> 알루미늄 편리한 그리드 상자와 상점에 전송 포장 그리드는 단계 1.4에서 설명 할 수있다. </li></ol> 3. 전자 현미경에 대한 표본의 Cryotransfer EPMA의 핵심 장비이 실험실에서 120 kV의에서 운영하고 cryomicroscopy에 장착, 즉, 깨끗한 진공, 표본 면적 anticontaminator, 2K X 2K 고감도 디지털 카메라와 cryotransfer 시편 홀더를 설계 분석 전자 현미경입니다. 모두 낮은과 높은 배율 모드에서 현미경을 정렬 및 작동 상태를 미리 확인하고 이상적 ≤ 10-7 Torr의 만족스러운 열 진공을 확인합니다. 필요에 따라 튜닝. <ol><li> cryoholder의 듀어 구성 요소의 진공 단열이 양호한 지 확인합니다. 필요에 따라 펌프. </li><li> 통제 상자 홀더를 연결하는 케이블을 분리, 현미경 단계 내에서 높은 진공 상태 동안의 최저 온도, 최소 -160 ° C로 cryoholder 쿨. 연산자와 현미경 표면에 흘리 LN 2를 최소화하기 위해 홀더를 제거하기 전에 고니 오 미터 45 ° 시계 방향으로 기울이십시오. </li><li> 적분 보온 냉각하여 벤치 탑 cryoworkstation 준비160 ° C.를 ≤하는 D 컵 </li><li> 전송 (quickly!) 현미경에서 냉각 cryoholder 워크 스테이션을내는합니다. 홀더의 서리 방패를 집어. </li><li> LN 2 cryoworkstation의 작업 테이블에 저장 및 장소에서 그리드 샌드위치에서 검색합니다. 홀더의 표본도에 대한 고정 링은 테이블에 배치됩니다. </li><li> 인듐 봉투를 열고 cryoholder의 표본도에 동봉 된 접이식 격자를 이동합니다. 스패너 도구를 제공하고 서리 실드를 닫를 사용하여 고정 링을 사용하여 그리드를 고정합니다. </li><li> 빨리 cryoworkstation에서 cryoholder을 제거하고 현미경의 출입구에 삽입 가능한 한 빨리 펌핑 순서를 통해 이동합니다. 삽입에서 열 진공 최소한의 중단이 있어야합니다. </li><li> 0 ° 경사에 고니 오 미터를 반환합니다. 다시 연결하고 제어 상자를 재 활성화하고, 시편의 온도가 150 ℃에게 ≤되어 있는지 확인 </li><li> 의 듀어 리필홀더를 표본 진공 및 온도가 완전히 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 섹션의 시각적 조사 <ol><li> 표본을 노출하고 전자 빔을 켜 홀더의 서리 방패를 집어. </li><li> 시각적으로 낮은 배율, 일반적으로 250X, 낮은 조명에서 표본을 평가합니다. 그림 1에 나타낸 바와 같이, 섹션은 얇고 부드러운, 접힌하지 않거나 중복, 평평하고 잘지지 필름에 부착, 일반적으로 그리드 막대로 가려지지한다. </li><li> 선택적으로 선택한 부분을 촬영하고 있습니다. (참고 : 냉동 수화 섹션 빔에 의한 손상에 매우 취약하기 때문에, 빔의 노출을 최소화합니다.) 선택된 부분의 좌표를 저장하는 자동화 된 디지털 고니 오 미터의 단계를 사용합니다. </li></ol> 5. 섹션의 동결 건조 <ol><li> 동결 건조 섹션을 CA에 홀더의 온도를 증가시켜. ~ 30 분 -100 °의 C를. </li><li> 아래 -160 ° C에서 나에 홀더를 Recool. </li><lI&gt; 이미징 전에 의한 열 순환 및 / 또는 진동 픽업에 이미지 드리프트를 방지하기 위해 cryoholder 제어 장치와 물리적으로 분리 컨트롤러 케이블을 해제합니다. </li></ol> 6. 세포와 세포 기관의 영상 동결 건조 부분의 구조 이미지는 캘리포니아에서 얻을 수있다. -160 ° C의 낮은 복용량, 적절한 소프트웨어에 의해 제어되는 2K X 2K 느린 스캔 CCD 카메라를 사용하여 디지털로 기록 된 제로 손실 이미지. <ol><li> 하이 잡지 모드에서 EM을 활성화합니다. </li><li> 선택 및 이미지 ~ 2,000 X에서 (TIFFs을 같은 그림 2 참조) 선택된 셀 및 위치 이전에 기록 저장되어 고품질의 섹션에 대한 관심의 세포 내 영역을. (참고 : 건조 섹션은 이제 실질적으로 더 적은 연약하고 전자빔 손상에 덜 민감하다. </li><li> X-선 분석을위한 관심 영역 (ROI에)을 선택하기 위해 이미지를 평가합니다. 이 단계는 선택적으로 오프라인으로 수행, EM이 설정 될 수있는 경우에 할 수있다끄고 실온으로 가온 시험편. </li></ol> 7. X-선 스펙트럼의 취득 X-선 스펙트럼 중 하나를 사용하여 기록 할 수있는 몇 가지 상용 또는 사용자 정의 설계된 X-선 최소한의 에너지 분산 X-선 (EDX) 검출기, 관련 펄스 프로세서의 전자 제품과 호환 수집 및 디스플레이 소프트웨어로 구성된 분석 시스템. (본 실험에 사용 된 시스템은 표 1에 기재되어있다.) <ol><li> 열 (필요한 경우)으로 EDX 검출기를 삽입 대물 조리개를 배출하고, 임의의 표유 방사선 개구 넣고 중심으로 X-선 취득 EM 구성. 시편의 서리 오염이 방지되는 가장 낮은 온도로 cryoholder을 조정하지만, 적어도 -100 ° C 이하 </li><li> 홀더에게 발견을 향해 20 °를 기울이십시오. </li><li> 광 시야 촬상 조건 하에서, 그리고 하나의 individua에 행렬을 분석하고자 가정L 미토콘드리아는 분석을위한 미토콘드리아를 선택 필드의 중심으로 이동하고 초점을 맞 춥니 다. </li><li> (일부 현미경에 단지 제 2 응축기 포커스를 사용하여 빔을 수렴) 스포트 모드로 이동하여 100 nm의 자리에 (패러데이 컵 또는 유사한로 측정). 3 nA의 CA에 빔 전류를 증가시킨다. </li><li> 스펙트럼 수집 소프트웨어를 시작하고 디스플레이 모니터에서 방송 시간을 볼 수있는 100 초 인수를 시작합니다. 기록 스펙트럼 (그림 2)을 저장합니다. 표준형 EMSA 형식이 바람직하다. </li><li> EM을 종료하고 (오프라인) 분석 워크 스테이션에 여러 스펙트럼의 파일을 전송할 수 있습니다. </li></ol> 8. X-선 스펙트럼 분석 정성 분석 EDX 스펙트럼 (그림 2, 삽입)는 본질적으로 에너지 대 X-선 강도의 XY 플롯이다. 스펙트럼은 T의 원소 조성에 대한 정성 및 정량 정보를 포함피크의 &quot;특성&quot;에너지 강도가 그 요소의 양을 반사하면서 그 절정에 이르게 요소를 식별한다는 점에서 그 부피를 분석했다. 특징적인 피크는 서서히 변화 배경, &quot;연속체&quot;의 상단에 타고. (그림 2 전설 더 EDX 스펙트럼의 현저한 세부 사항에 대해 설명합니다.) 전체 주기율표의 피크 매니 폴드의 에너지 요소의 잘 알려진 전자 구조, 자동의 구성 요소를 식별하는 데이터베이스에 따라서 모든 EDX 소프트웨어 링크에 의해 정의된다 분석. 생리 학적 맥락에서, EDX 분석에 적합하다 일반적으로 흥미 요소 나 (1.04 케빈에서 K (α)), P (2.01 케빈), K (3.31 케빈) 및 CA (3.69 케빈) 등이 있습니다. <ol><li> 스펙트럼의 주요 요소를 식별하는 데 사용할 수있는 소프트웨어 데이터베이스 및 피크 일치하는 루틴을 활용할 수 있습니다. 생물학적 시료에서 나, 마그네슘, P, S, 망할 CIA, K, 및 CA에 대한 피크를 찾을 것으로 기대합니다. (주의 :마지막 두 요소는 중첩!) </li></ol> 정량 분석 EDX 스펙트럼의 정량 분석​​은 식별 된 피크의 통합 영역을 추출하고 농도로이 값을 변환 이루어져있다. 생물학적 분석을 위해 확립 된 방법은 (상기도 2에서 정의) 연속체의 강도는 분석 된 부피의 건조 질량에 비례한다는 사실을 이용한다 홀 피크 / 연속체 방법 4,7,10이며 . 공지 된 조성물의 표준 스펙트럼의 동일한 비율과 비교할 때 따라서, 피크 면적 / 연속체 영역의 비는 표적 세포 구획에서 농도를 지정한다. 이 방법은 일반적으로 밀리몰 / kg 건조 중량으로 표현 중량 당 몰 단위로 농도를 제공합니다. 이 기기는 특이하고 해석 엘에게 설명한 바와 같이, 예를 들어, 밀리몰 / L 젖은 중량 밀리몰 / mg의 단백질을 추가로 변환 할 필요가있다4,10를 sewhere. <ol start="2"><li> Z = 10 ~ 20 사이의 생물학적 요소 (0.5-4.0 케빈)의 피크 면적 (오류 추정)를 추출, 즉 나, 마그네슘, P, S, 망할 CIA, K, 및 칼슘, 분석에 내장 된 피팅 루틴 중 하나를 사용하여 소프트웨어 (특히 4 각주, 표 1 참조). 이 연구소는 단면 또는 여러 최소 제곱 피트를 사용합니다. 이 피팅은 K와 CA 피크 사이의 중첩을 (그림 2 참조) 해결에 세심한주의가 필요합니다. </li><li> 1.45-1.61 케빈 사이의 연속성을 통합 할 수 있습니다. 대체 무 간섭 영역이 사용될 수있다. </li><li> 기준과 비교하여 다음 피크 / 연속체의 비율과 농도를 계산한다. 분석을 통해 오류를 전파. </li><li> 생물 다양성을 반영 평균을 추정하기 위해 표준 통계 소프트웨어와 수식을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익의 충돌을보고하지 않습니다.

전자 현미경 기반의 분석 방법 여기에 제시된는 탐지, 식별, 그리고 나, K, P, 특히 칼슘 등의 생물학적 그 몇 가지 요소, 정량 할 수 있습니다. 이러한 분석은, 세포 내에서 수행 될 수있다, 즉, 인트라 소기관, 급속 냉동 검체로부터 제조 저온부의 고품질 이미지에 대한 관심의 구조를 찾아 식별하는 능력 때문에 해상도. 전혀 오염이 조직 요소의 위치를​​ 정량적으로 보존 상태에서도, 종래 고정, 플라스틱 내장 준비 구조적 품질 비교 전자 이미지를 기록하는 데 필요하지 않습니다. 구조 조사 이미지가 낮은 응용 전자 복용량에 기록되어 있지만, 더 높은 복용량은 좋은 통계를 얻기에 충분한 수의 비율로 X-선 방출을 유도해야합니다. 따라서, EMPA 유용 현미경은 높은 전류 집중 프로브를 형성 할 수 있어야한다; nA의 2-525 ~ 50 나노 미터로, ER의 cisternae 또는 시냅스 소포와 같은 세포 기관을 포괄하기에 적합한이 허용됩니다. 이 법은 고휘도...

칼슘 이온은 시냅스 전달 및 유전자 발현 등 다양한 통상의 공정에서 필수적인 역할을 논증 생물학에서 가장 중요하고 다양한 세포 신호 전달 실체이다. 한편, 칼슘은 세포 죽음에서 동등하게 중요하다. 특히, 칼슘 규제 완화 뇌졸중의 신경 세포의 손상에 중요한 요소이다, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 등 신경 퇴행성 질환 3,5. 따라서, 칼슘이 세포 내에서 어떻게 분포되는지를 정량적으로 이해하는 것이 매우 중요하고, 어떻게 이런 일이 생리적 또는 병태 생리 학적 자극을 다음과 같이 변경합니다. 용액에 무료 또는 기판에 결합 - - 셀룰러 칼슘 농도는 자극의 결과로서 수십배 이상 변경이 그 목표는 칼슘 동적 개의 물리적 상태 사이에서 분포되어 있다는 사실에 의해 복잡하게된다. FR의 분석에 사용할 수있는 여러 가지 고급 방법론이 있지만세포 내 칼슘을 전자, 정의 세포 내 구획에서 총 칼슘 농도의 결정은 현실적으로 한 가지 방법, 즉, 전자 탐침 미세 분석 (EPMA)로 제한됩니다. EPMA 그 커플 투과형 전자 현미경 (TEM)에 대한 X-선 분광계 기술이다. TEM 전자총 관심 및 전자 충격의 결과로서 발광 소자 고유의 X-레이의 세포 내 영역에 고정, 서브 마이크론 전자 탐침을 포커스는 (상세한 기술 리뷰를 참고 7, 4 참조)를 수집 및 분석된다. EPMA의 장점은 하나의 세포 기관 수준의 해상도와 submillimolar 감도 있습니다. 그러나 실제로, EPMA 시편 준비 및 분석을위한 전문 cryotechniques 및 계측을 필요로한다. 여기에, 도구, 기술 및 EPMA를 사용하여 세포 내 칼슘의 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘은 특별 난입니다중요한 역할의 계정에 nterest하는 신경 퇴행성 질환에서 미토콘드리아 칼슘 과부하 재생됩니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS/MATERIALS</td></tr><tr><td>Thermanox 플라스틱 커버슬립</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>배양 인서트</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>6웰 플레이트용</td></tr><tr><td>Cryopins</td><td>Leica Microsystems</td><td>16701952</td><td>Grooved</td></tr><tr><td>Wood 애플리케이터</td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>접는 EM 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100 메쉬</td></tr><tr><td>인듐 호일</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0.25 mm 두께</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>플런지 동결 장치</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>슬램 동결 장치</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>초박 절개</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰용 크라이오어태치먼트</td><td>Leica Microsystems</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 크라이오트리밍 도구</td><td>Diatome</td><td>Cryotrim 45</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 크라</td>이오나이프 <td>Diatome</td><td>Cryo 35</td><td></td></tr><tr><td>정전기 방지 장치</td><td>Diatome</td><td>Hauf Static Line</td><td></td></tr><tr><td>Cryo 전자 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>EM912 Omega</td><td></td></tr><tr><td>EM 극저온 검체 홀더</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>슬로우 스캔 CCD 카메라, 2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM 제품군</td><td></td></tr><tr><td>ED X선 검출기</td><td>Oxford Instruments</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>펄스 프로세서</td><td>Oxford Instruments</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCI 백플레인 카드</td><td>4pi 시스템</td><td>스펙트럼 엔진 II</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 컴퓨터</td><td>Apple</td><td>Any OS9 호환 모델</td><td></td></tr><tr><td>X선 분석 소프트웨어</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>스프레드시트 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li>CF100은 더 이상 상업적으로 판매되지 않지만 많은 학술 시설에서 기계를 사용할 수 있습니다. 전체 기계 또는 부품은 온라인에서 찾을 수 있습니다.</li> <li>CT3500 극저온 이송 홀더에 대한 비디오 자습서는 <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li에서 확인할 수 있습니다>SEII는 더 이상 사용되지 않습니다. Universal Spectral Engine은 비슷한 기능을 가진 최신 PC 호환 제품입니다. 4PI는 제조 및 판매를 중단했지만 여전히 기술 고객 지원을 제공합니다. 중고 시스템은 온라인에서 찾을 수 있는 경우가 많습니다.</li> <li>원래 DTSA는 이제 더 이상 사용되지 않습니다. NIST는 공개 도메인에서 업데이트된 후속 제품인 DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol> </td></tr></tbody></table>

전자관 x-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

이 문서에서는 전자 프로브 미량 분석 (EPMA)로 알려진 기술을 사용하여 도구, 기술 및 세포 내 원소 함량의 정량적 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘 때문에 미토콘드리아 칼슘 과부하가 신경 퇴행성 질환에서 활약하는 중요한 역할의 특정 초점이다. 방법은 X-선 분석 시료와 전자빔의 상호 작용에 의해 전자 현미경 (EM)에서 생성에 기초한다. 전자 현미경 표본의 확산 요소의 기본 분포를 유지하기 위해서, EPMA는 극박 저온부의 제조이어서 조직 &quot;c​​ryofixation&quot;를 필요로한다. 배양 된 세포 또는 Organotypic 슬라이스 문화의 급속 냉동은 각각 차가운 금속 블록에 액체 에탄 또는 슬램 냉동 동결 급락에 의해 수행된다. 저온부는 공칭 두께의 80 나노는 캘리포니아에서 다이아몬드 나이프로 건조 절단됩니다. -16076, C는 탄소 / pioloform 코팅 된 구리 그리드 상에 장착하고, 전문 cryospecimen 홀더를 사용하여 극저온-EM에 cryotransferred. C 낮은 전자 선량 ° ≤ -160에서 시각적 조사 및 위치 매핑 한 후, 냉동 수화 저온부는 동결 건조 ~ 30 분 -100 ° C에있다. 건조 저온부의 세포 기관 수준의 이미지는 느린 스캔 CCD 카메라와 분석을 위해 선택한 그 세포 내 영역에 의해, 또한 낮은 복용량에 기록됩니다. 문구, 집중, 고강도 전자 프로브의 ROI에서 출사 X-선은 에너지 분산 X-선 (EDX)에 연결된 전자 장치에 의해 처리 분광계, 및 X-선 스펙트럼으로 제시에 의해 수집되는, 즉, 에너지 대 X-선 강도의 줄거리. 추가 소프트웨어를 용이하게 : 자신의 &quot;특징&quot;피크 에너지와 지문에 의한 원소 성분의 1) 식별하고, 피크 면적 / 배경의 추출 2) 정량 분석​​. 이 논문은 일반적인 설명 두 가지 예와 결론미토콘드리아 칼슘 분석 허혈 저항의 근거를 제시 흥분 독성 손상 및 다른 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하는 하나의 EPMA 응용 프로그램.

뇌 세포는 일반적으로 허혈성 조건에서 발생 병리 신경 전달 물질 방출의 결과로서 흥분 독성 손상 서스테인. EPMA 칼슘 막대한 양의를 격리 할 수​​있는 신경 세포의 미토콘드리아의 기능이 손상의 메커니즘을 이루는 방법을 발견에 매우 중요했다. 그림 3의 전자 현미경 사진은 빠르게 흥분 독성 자극 (100 μM NMDA)에 30 분 노출 후 냉동 배양 해마 신경 세포의 동결 건조 저온부에있는 미토콘드리아의 모양을 보여줍니다. 그들은 매우 부어 작은, 어두운 흠 (빨간색 화살표)를 포함 대부분의 미토콘드리아는 구조적 손상을 한 것으로 나타났습니다. 미토콘드리아이 포함됩니다 (그림 3, 빨간색과 파란색 스펙트럼, 각각) 범위 내에서 ( "매트릭스")의 독점적 인 원소 분석을 수행하기에 충분한 해상도를 가지고 EPMA는 흠이 주로 칼슘과 인으로 구성되는 것으로 나타났다. 매우 높은 칼슘 콘이러한 흠 십t - ~ 1,300 밀리몰 / kg 건조 중량, 반면 &lt;1 밀리몰...

이 논문은 생리 학적으로 정의 된 생물 표본의 세포 이하의 해상도에서 총 칼슘 함량과 분포의 정량적 측정에 cryoanalytical 전자 현미경의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

이 절차의 전반적인 목표는 분석 전자 현미경을 사용하여 배양된 뉴런에서 세포 내 해상도에서 칼슘과 같은 생물학적으로 중요한 원소의 농도를 정량적으로 측정하는 것입니다. 이는 먼저 살아있는 세포 배양을 빠르게 동결하고 초박형 극저온 절편을 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 극저온 절편을 분석 전자 현미경으로 옮기고 동결 건조하는 것입니다.다음 이미지와 X선 스펙트럼은 신경 세포 미토콘드리아를 포함한 선택된 세포 내 영역에서 필요합니다. 마지막 단계는 국부적인 원소 농도를 결정하기 위해 X선 스펙트럼을 정량적으로 분석하는 것입니다. 궁극적으로, EPMA로 알려진 이 접근법은 세포 내 칼슘 신호전달의 기초가 되는 칼슘 농도 및 분포의 변화를 밝히는 데 사용됩니다.형광, 현미경 검사, 방사성 동위원소 흡수 또는 화염 광도 측정과 같은 관련 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 소기관 수준의 해상도와 서브 밀리몰 감도입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 선임 과학자인 Dr.Natalia pva가 맡을 것입니다. 시작하려면 액체 질소 냉각 시스템의 중앙 우물에서 섭씨 영하 160도의 기체 에탄을 응축하여 동결 수조를 준비합니다.그런 다음 부착된 세포가 포함된 커버 슬립의 가장자리를 닦아서 액체의 얇은 필름을 제외한 모든 것을 제거합니다. 샘플이 건조되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 가장자리를 잡고 덮개를 미끄러지게 하고 샘플을 액체 에탄에 빠르게 담그십시오.2-3초 후 에탄에서 커버 슬립을 제거하고 액체 질소 전달이 담긴 스티로폼 그릇에 넣습니다. 얼어붙은 덮개는 섭씨 영하 135도까지 예냉각된 극저온 마이크로톰에 들어갑니다. 날카로운 사전 냉각 메스를 사용하여 얼어붙은 덮개 슬립을 3mm x 3mm 정사각형으로 자릅니다.그런 다음 에탄올 1부와 6부로 구성된 극저온 접착제 혼합물에 3mm 직경의 알루미늄 핀을 위로 향하게 하여 삽입합니다. 이소프로파놀. 극저온 상자의 온도를 섭씨 영하 160도로 낮추어 극저온 접착제를 응고시킵니다. 다음으로, 커버 슬립 조각의 셀이 풍부한 영역을 약 250 x 250 미크론 블록 면과 100 미크론 깊이로 자릅니다.다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 35도 다이아몬드 크라이오 나이프를 사용하여 섭씨 영하 160도에서 얇은 부분의 얇은 절단 리본을 건조합니다. 그런 다음 섹션을 글로우 방전 탄소 코팅 peola 형태로 옮깁니다. 개방형 인듐 외피에 있는 100개 이상의 메쉬 접이식 구리 그리드를 주조하는 지지 필름.그리드가 닫혀 있습니다. 그런 다음 시료를 전자 현미경으로 극저온 이동하기 전에 냉각된 압축 도구로 봉투와 샌드위치를 압착했습니다. 현미경 스테이지 내에서 고진공 상태에서 극저온 홀더를 최소 섭씨 영하 160도의 최소 온도로 냉각합니다.그런 다음 측각계를 시계 방향으로 45도 기울이고 홀더를 제거합니다. 냉각된 극저온 홀더를 현미경에서 냉각된 극저온 워크스테이션으로 빠르게 옮기고 홀더의 서리 차폐를 집어넣습니다. 그런 다음 검체를 극저온 홀더로 옮깁니다.제공된 스패너 도구를 사용하여 고정 링으로 그리드를 고정하고 서리 보호막을 닫습니다. 그런 다음 극저온 워크스테이션에서 극저온 홀더를 빠르게 제거하고 현미경의 에어록에 삽입합니다. 시료 극저온 홀더를 제자리에 놓고 가능한 한 빨리 펌핑 시퀀스를 진행하십시오.측각계를 0도 기울기로 되돌립니다. 컨트롤 박스를 다시 연결하고 전원을 공급하고 시편 온도가 섭씨 영하 150도 이하인지 확인합니다. 마지막으로 시편 홀더의 작업자를 다시 채우고 진공과 온도가 완전히 회복되도록 합니다.먼저 250배 배율과 낮은 조도에서 표본을 육안으로 평가합니다. 선택한 섹션은 얇고 매끄러워야 하며 접히거나 겹치지 않아야 합니다. 또한 평평해야 하고, 지지 필름에 잘 부착되어야 하며, 일반적으로 그리드 막대에 의해 가려지지 않아야 합니다.디지털 각도계 스테이지를 사용하여 선택한 섹션의 좌표를 저장합니다. 다음으로, 홀더 온도를 섭씨 영하 100도까지 30분 동안 높여 섹션을 동결 건조하여 안정화하고 대비를 개선합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 영하 160도 이하로 다시 감습니다.고해상도 이미징 전. 극저온 홀더 제어 장치를 끄고 컨트롤러 케이블을 물리적으로 분리하여 열 순환 및/또는 진동 픽업으로 인한 이미지 드리프트를 방지합니다. 그런 다음 고배율 모드에서 전자 현미경을 활성화합니다.위치가 이전에 저장된 선택된 섹션 내에 있는 약 2000배 배율로 하위 세포 영역을 조사합니다. 유망 지역의 TIFF 이미지를 기록하고 저장합니다. 그런 다음 X-ray 분석을 위한 관심 영역을 선택하고 주석을 달기 위해 이미지를 평가합니다.관심 영역이 선택되면 EDX 검출기를 컬럼에 삽입하고 대물렌즈 조리개를 빼내고 표유 방사선 조리개를 삽입하고 중앙에 배치하여 X선 획득을 위한 전자 현미경을 구성합니다. 스폿 모드에서 홀더를 감지기 쪽으로 20도 기울입니다. 100나노미터 지점에서 측정한 대로 빔 전류를 약 3나노 암페어로 증가시킵니다.그런 다음 극저온 홀더 온도를 섭씨 음의 100도 이하로 올려 광시야 이미징 조건에서 서리 오염을 방지합니다. 분석을 위해 미토콘드리아를 선택합니다. 스폿 모드로 돌아갑니다.스펙트럼 수집 소프트웨어를 실행하고 102번째 수집을 시작하십시오. 기록된 스펙트럼을 표준 EMSA 파일 형식으로 저장합니다. 통계적으로 유의미한 데이터 세트를 보장하기 위해 서로 다른 세포에서 충분한 미토콘드리아를 샘플링합니다.EDX 스펙트럼을 정성적으로 분석하려면 사용 가능한 소프트웨어 데이터베이스와 DTSA와 같은 피크 매칭 루틴을 활용하여 스펙트럼의 주요 원소를 식별합니다. 원소를 피크의 특징적인 에너지 위치로 식별합니다. 생물학적 표본에는 일반적으로 나트륨, 카슘, 인, 황, 염소, 칼륨 및 칼슘이 포함되어 있습니다.칼슘 피크와 칼륨 피크는 정량 분석을 위해 겹치므로 각별히 주의하십시오. 먼저 DTSA에 내장된 심플렉스 방법과 같은 여러 표준 피팅 알고리즘 중 하나를 사용하여 식별된 피크의 적분 영역을 추출한 다음, 1.45에서 1.61킬로 전자 볼트 사이의 연속체를 적분하여 건조 질량을 추정합니다. 예를 들어, 4.0 - 5.0 킬로 전자 볼트와 같은 대체 간섭이 없는 영역을 사용하여 1차 연속체 영역에서 외부 비생물학적 신호를 피할 수 있습니다.마지막으로, peak over continuum ratio를 계산하고 표준물질과 비교하여 농도로 변환합니다. 이 접근 방식은 연속체에 대한 홀 피크 방법으로 알려져 있습니다. 여기에 표시된 것은 배양된 해마 뉴런의 현미경 사진으로, 세포 독성 자극에 노출된 후 급격히 얼어붙어 이온 채널이 열리고 칼슘이 유동적으로 발생합니다.여기에 표시된 대부분의 미토콘드리아는 심하게 부풀어 오르고 작고 어두운 내포물을 포함하고 있기 때문에 구조적으로 손상된 것으로 보입니다. 그런 다음 전자 프로브 미세 분석을 사용하여 미토콘드리아 내포물 내부 및 미토콘드리아 내포물을 제외한 원소 분석을 수행했습니다. 이 연구는 내포물이 주로 매우 많은 양의 칼슘과 인으로 구성되어 있음을 밝혔습니다.이것은 그들의 놀라운 칼슘 완충 능력과 이 완충 메커니즘을 압도하는 것이 칼슘 과부하로 인한 세포 사멸로 이어지는 이유를 설명합니다. 학습과 기억에 중요한 뇌 영역인 해마는 허혈 후 부상의 주요 부위입니다. CA 3이라고 명명 된 기능적으로 구별되는 영역은 인접한 synaptically connected ca one region electron probe microanalysis보다 허혈성 손상에 훨씬 덜 취약합니다.이 슬라이스의 독성 자극에 따른 미세 분석은 취약한 CA 1 뉴런에서 저항성 CA 3 뉴런보다 훨씬 더 큰 칼슘 상승을 보여주었습니다.결과적으로, CA one 미토콘드리아는 광범위한 손상과 기능 장애를 나타내며, 이는 칼슘 과부하로 인한 미토콘드리아 기능 장애가 CA one 뉴런의 선택적 취약성에 결정적인 요인임을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수집 프로브 미시분석을 사용하여 배양 뉴런의 단일 미토콘드리아에서 총 칼슘의 농도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을...

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.

Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

제안된 프로토콜은 다중 모드 분석을 사용하여 뼈 재생의 맥락에서 뼈 형성을 평가하기 위한 글로벌 접근 방식을 수반합니다. 새로운 뼈 형성에 대한 정성적 및 정량적 정보를 제공하여 기초 및 전임상 조사의 엄격성과 타당성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

Ex vivo 모델에서 조직 광물화의 포괄적인 특성 분석

배우세요 냉동전자현미경을 이용해 신경세포의 미토콘드리아 내 칼슘 농도를 정량 측정하는 방법을. EPMA 기술로 세포소기관 수준의 해상도에서 칼슘 분포 변화를 분석하여 신경신호전달 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

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