Name: 차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 칼슘 인산염 침전법을 이용한 해마 신경 세포 형질 전환 방법을. 신생아 쥐 성상교세포 공배양 시스템에서 유전자 도입 효율이 최대 50%에 달하는 경제적이고 효율적인 신경생물학 연구 기법입니다.

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이 작품은 NIH 그랜트 NS065183 및 러트 거스 로버트 우드 존슨 의과 대학에서 창업 자금을 지원합니다.

1. 에어컨 미디어 및 성상 세포 신경 세포 공 배양에 쥐 성상 세포 문화를 준비합니다. <ol><li> (BSS 레시피 표 1 참조) 해부 버퍼를 준비하고 4 ° C에서 보관 사용 준비가 될 때까지. </li><li> 500 ㎖ 비이커에 이소 플루 란과 신생아 쥐 새끼 (P0-P2)를 마취. </li><li> 강아지가 움직 인 경우, 70 % 에탄올로 스프레이 목을 베다. </li><li> 뇌를 제거합니다. <ol><li> 뒤몽 # 5 포셉 한 쌍의 단단히 머리를 잡아, 피부와 두개골을 통해 중간 선 절개를 만들기 위해 미세 가위를 사용합니다. </li><li> 측면에 두개골을 반영하여 뇌를 노출, 차가운 BSS를 포함하는 접시에 두뇌를 제거합니다. </li></ol></li><li> 해부 범위에서 간뇌와 뇌간에서 대뇌 반구를 분리합니다. 조심스럽게 집게 일쌍과 조직을 안정화하고 부드럽게 포셉의 다른 쌍의 수막을 떼어 모든 수막을 제거합니다. </li><li> 모든 반구를 수집 IN 개의 60mm 접시. 작은 가위, 다진 조직과 같은 미세 가능한 한 사용. 그런 다음 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다. </li><li> 1.5 1 % DNA 분해 효소 I ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신과 두뇌에 BSS (15ML의 총 부피)의 12 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 진탕 수조에서 부화 좋은 혼합을 보장하기 위해, 튜브는 손으로 5 분마다 소용돌이된다. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전송합니다. 이 상층에 3 ㎖의 FBS를 추가합니다. </li><li> 나머지 조각, 13.5 BSS ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신을 추가하고 또 다른 15 분 동안 진탕 수조에서 배양한다. </li><li> 셀 스트레이너를 통해 나머지 뜨는을 전송하고 단계 1.8에서 뜨는 결합. </li><li> 펠릿 세포 5 분 1,000 RPM에서 원심 분리기. </li><li> 아교 미디어 5 ㎖에 재현 탁 펠렛. 상청액 나머지 세포 펠렛을 다시 원심 분리 할 수​​있다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 플레이트 CEL1 × 10 7 150cm 당 2 플라스크의 밀도로 LS. </li><li> 하루 도금 후 신선한 아교 미디어에 미디어를 변경합니다. 그 후, 아교 미디어 일주일에 두 번 세포를 공급. </li><li> 세포가&gt; 80 % 컨 플루 (약 십일 도금 후)에 도달했을 때, 90 % 말 혈청과 10 % DMSO에서 세포를 동결 액체 질소에 주식을 계속. 세포는 2 바이알 당 X 10 6 동결됩니다. 약 5 병 각 플라스크에서 고정 할 수 있습니다. </li><li> 대략 10-14 일 해마 문화를 설정하기 전에, glial 세포는 냉동 주식에서 도금된다. 우리는 일반적으로 해마 신경 세포의 90 커버 슬립 (물론 당 세 개의 15mm 라운드 커버 슬립)의 성장을 지원하기에 충분하다 다섯 6 - 웰 플레이트를, 접시. 우리는 또한 형질에 대한 조절 N2.1 매체에 사용되는 glial 세포의 추가 8 ~ 10 60mm의 요리를 접시. 하루는 신경 세포의 배양하기 전에, 세포 NB27 미디어가 공급되어야한다. 성상 세포는 이상적 일에서&gt; 90 % 합류해야한다지점입니다. 우리는 크게 동결하면 astroglial 문화에서 미세 아교 세포의 수를 줄일 것을 찾을 수 있습니다. 미세 아교 세포가 astroglial 문화에 존재하는 경우 증가 된 신경 독성이 관찰되기 때문에, 우리는 항상 신경 세포와 공 배양 냉동 주식에서 준비 astroglial 문화를 사용합니다. </li></ol> 2. 신경 세포 문화 <ol><li> 를 MilliQ 물 2 배 첫 번째 린스로 청소 유리 커버 슬립. 그 후, 2 시간의 전체에 걸쳐 적어도 5 회 24 시간 동안 진한 질산에 침지하고을 MilliQ 물 세정된다. coverslips는 6 시간 동안 225 ° C의 오븐에 굽고 건조 및 살균된다. </li><li> 전송 멸균 60mm 요리에 커버 슬립. 신경 세포 공 배양시 glial 세포에서 분리 유지하기 위해 각 coverslip에의 외부 가장자리 근처에 멸균 파라핀의 네 점을 놓습니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 하룻밤 0.1 M 붕산 버퍼 / ㎖ 폴리-L-라이신 1 MG와 코트 커버 슬립. </li><li> 다음 날, 멸균 m에 두 번 coverslips를 씻어적어도 15 분마다 illiQ 물. 그들은 다음 37 ° C 배양기에서 도금 미디어에서 하룻밤 배양된다. </li><li> 기흉 다음에 이소 플루 란 마취에 의해 임신 한 쥐 (E18)를 안락사, 그리고 잘린 배아 쥐를 안락사. 머리를 제거하고 상기 한 바와 같이 대뇌 반구를 해부하다. </li><li> 대뇌 반구에서 해마를 해부하다. 15 ML 원뿔 튜브에 모든 해마를 놓고 15 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 (0.5 ml의 2.5 % 트립신, 4.5 ml의 BSS)과 소화. </li><li> 소화 해마는 5 분마다 BSS 배에 씻어서. 이들은이어서 유리 파스퇴르 피펫으로 분쇄하고, 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 결정된다. 뉴런이어서 60mm 디쉬 당 2 × 105 세포의 밀도로 시딩 하였다. </li><li> 대략 2-4 시간 도금 후, 전송이 신경 교세포으로 아래를 향하도록, astroglial 세포를 포함하는 요리에 연결된 뉴런의 coverslips. DIV3에서에 시토신 아라 비노 시드를 추가5 μM의 최종 농도에서 세포 glia의 증식을 정지합니다. </li></ol> 3. 칼슘 형질 <ol><li> glia의 형질 전날의 조건 N2.1 미디어. </li><li> 형질의 날, 아교 오프 에어컨 N2.1 미디어를 가지고 새로운 요리로 전송할 수 있습니다. 전송 에어컨 N2.1 미디어에 뉴런의 coverslips. 10 ~ 30 분 동안 인큐베이터에서 평형을 보자. </li><li> 멸균 튜브의 한 세트로, DNA의 1-4 μg, 100 μL의 총 볼륨에 대한 2 M 염화칼슘 12.5 μL, 멸균 H 2 O를 결합. 튜브의 두 번째 세트에 2 배 HBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 몇 초마다 볼 텍싱, 염화칼슘 / DNA 혼합물을 포함하는 튜브에 한번에 2X HBS의 ⅛ 체적 (12.5 μL)을 추가한다. 튜브가 15 분 동안 앉아 수 있습니다. </li><li> 15 분 배양 후, 세포에 형질 감염 혼합물 적가. 1.5 시간 동안 배양한다. 모래 같은 침전물 층이 볼 수 있어야합니다10X 목표를 사용하여 현미경. </li><li> 배양 후, 따뜻한 HBS 세척 버퍼로 두 번 커버 슬립을 씻어. </li><li> , 아교와 창작 요리로 커버 슬립을 반환 0.5 mm의 최종 농도 kynurenic 산을 추가합니다. </li><li> 형질 전환 된 뉴런의 이미지를 생성하거나 이미 다음 날 같은 면역 세포에 처리 할 수​​ 있습니다. 신경 세포는 형질 전환 후 3 주까지 살아남을 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Zeitelhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
<li>Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons.</a> Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCraig%2C+AM+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+function+by+VAC14%2C+a+protein+that+regulates+the+phosphoinositides+PI%283%2C5%29P%282%29+and+PI%285%29P%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P.</a> EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).</li>
<li>Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+KAH+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).</li>
<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+formation+of+a+DNA%2Fcalcium+phosphate+coprecipitate%3A+application+for+transfection+of+mature+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons.</a> J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

주의 깊게 지속적으로 성공적인 형질 (10, 11)에 대해 제어 할 필요가 몇 가지 주요 매개 변수가 있습니다. 칼슘 포스페이트 형질 감염에 대한 가장 중요한 매개 변수는 우리 손에 보통 7.10-7.15 사이에서 변화 2X HBS의 pH 값이다. 우리는 산도 미터 사이의 차이를 설명 할 수는 0.05 단위로 pH 값과 주식의 세 가지 배치를하는 것이 좋습니다. 또한, 클론 테크 포유류의 형질 전환 키트는 지속적으로 좋은 효율을 얻을 수 2X HBS를 제공합니다. 냉장고에 저장하는 경우에도 용액의 pH가 시간이 지남에 따라 변경됩니다 것을 염두에 두십시오. 우리는 일반적으로 최대 한 달 동안 4 ° C에서 2 배 HBS의 분취 량을 유지하고, 최대 1 년 -20 ° C에서. 두 번째 매개 변수는 배양액의 pH이다. 이 일관성, N2.1 매체를 유지하기 위해 정기적으로 하룻밤 만 이하 24 시간 astroglial 문화에 가동된다. 또한, 우리는 astrog...

차 뉴런들이 postmitotic이며 마이크로 환경 변화에 매우 민감하다 같이 트랜 어려운 세포 유형의 하나이다. 이러한 세포 1 외인성 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 (shRNAs)의 표현 방법의 네 가지 일반적으로 사용되는 유형이있다. 각각은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 세포 형질 감염을위한 큐벳에 전송해야 예를 들어, 전기 천공은 일반적 갓 절연 뉴런이 수행된다. 바이러스 감염은 일반적으로 매우 높은 효율 3를 달성하지만, 더 노동 집약적 인 운영과 위험하다 할 수 있습니다. 많은 지질 매개 형질 전환 시약은 신경 세포와 세포 독성의 다른 수준에있는 성공의 학위를 변화와 함께, 상업적으로 이용 가능하다. 인산 칼슘 형질 감염은 뉴런에 외래 유전자를 도입하기위한 편리하고 경제적 인 방법을 나타낸다. 첫번째 방법은 포유 동물 CEL에 아데노 바이러스 DNA를 도입하기 위해 사용 하였다그레이엄과 반 데르 EB를 (1973)에 의해 LS 4. 형질 포스페이트 완충액에서의 재조합 DNA와 염화 칼슘을 혼합함으로써 수행되었다. 이것은 서서히 세포 단층 상에 떨어질 때 DNA / 칼슘 포스페이트의 형성은 세포 표면에 부착, 엔도 사이토 시스에 의해 다루어 최종적 핵 5를 입력되며, 이는 석출물 허용한다. 이 과정은 표적 세포에 도입 된 외래 유전자의 발현을 초래할 것이다. 0.5-5 % 6-8 사이 인산 칼슘 형질 범위의 전형적인 효율성. 그러나, 조심 최적화 실험 프로토콜의 일관된 실행을, 거의 50 %의 형질 감염 효율에 도달 할 수있다. 여기에서 우리는 샌드위치 형식 9 astroglial 세포와 공 배양하는 기본 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Dumont # 5 겸</td>자 <td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>스트레이트 / 샤 프 8.5 cm</td></tr><tr><td>Vannas-Tubinger 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>앵글/샤 프 / 8.5 cm/5mm 커팅 엣지</td></tr><tr><td>표준 패턴 집게</td> Fine <td>Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>학생 외과 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>무딘 / 14.5cm</td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>측면 각도 / 9cm / 10mm 절삭 날</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-225-06</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>100mM 피루브산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>시그마</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES, pH 7.3</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>신경기저 매체</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21130-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 (50x)</td><td>Gibco/ Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>오브알부민</td><td>시그마</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>사이토신 아라비노사이드</td><td>Calbiochem/EMD Millipore</td><td>251010</td><td></td></tr><tr><td>키누렌산</td><td>시그마</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

형질의 다른 매개 변수를 최적화하고 신중하게 실험 실험에서 제어하는 경우, 최대 50 %의 형질 전환 효율을 얻을 수있다. 1 DIV4에 GFP 형질 전환 된 뉴런의 필드를 보여줍니다. 필드 (16)가 형​​질 전환 된 가운데 28 뉴런의 전체를 포함한다. 이것은 50 %의 효율을 나타냅니다. 동일한 커버 슬립에 다른 필드의 샘플링은 전체적인 효율 (데이터 미도시) 주변의 50 %이다. astroglial 공 배양 시스템과, 신경은 건강을 유지하고 형질 전환 한 후 일반적으로 개발한다. 2 10 일 PSD-95-GFP 구조와 형질 전환 한 후, DIV15에서 해마의 신경 세포를 보여줍니다. 신경 세포는 신경 세포가 건강을 나타냅니다, 많은 성숙한 버섯 모양의 돌기 쪽을 개발했다. 높은 형질 전환 효율이 프로토콜의 최소한의 독성은 기본 하마에서 유전자 기능을 연구하기위한 유용한 도구가 있습니다campal 신경...

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

이 절차의 전반적인 목표는 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 배양된 뉴런에 도입하는 것입니다. 이는 먼저 신생아 쥐의 성상아교세포(astroglia) 배양을 확립하여 뉴런 성장을 지원함으로써 달성됩니다. 그런 다음 E 18 쥐의 해마 뉴런을 신경교세포와 공동 배양합니다.다음 단계는 인산칼슘 침전법을 사용하여 해마 뉴런을 형질주입하는 것이며, 형광투여된 뉴런을 형광 현미경으로 시각화합니다. 이러한 방법을 사용하면 transfection 효율이 최대 50%가 될 수 있습니다.기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 간단하고 경제적이며 매우 효율적이라는 것입니다. 당사의 프로토콜은 배양된 해마 뉴런의 transfection에 중점을 두고 있지만, transfection이 어려운 다른 세포주에도 적용할 수 있습니다.이 프로토콜의 경우 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 BSS 해부 버퍼를 준비해야 합니다. 새끼의 목을 베인 후 5번 집게로 머리를 단단히 잡고 가위를 사용하여 피부와 두개골을 정중선으로 절개합니다. 두개골을 옆으로 반사하여 뇌를 노출시킵니다.그런 다음 차가운 BSS가 담긴 접시에 뇌를 넣습니다. 해부 범위에서 대뇌 반구를 두판과 뇌간에서 분리합니다. 한 쌍의 집게로 조직을 안정화하고 다른 한 쌍의 집게로 수막을 부드럽게 당겨 모든 수막을 조심스럽게 제거합니다.작은 가위를 사용하여 조직을 가능한 한 잘게 다집니다. 그런 다음 다진 조직을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 남은 조직과 함께 접시에 BSS를 첨가한 다음 혼합물을 원뿔형 튜브로 옮깁니다.DNA 1개와 트립신을 총 15ml의 부피에 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 흔들리는 수조에서 조직을 배양합니다. 좋은 혼합을 위해 5분마다 튜브를 손으로 휘젓습니다.조직이 가라앉도록 합니다. 그런 다음 70미크론 세포 여과기를 통해 상등액을 3밀리리터의 FBS가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브에 나머지 조각에 통과시킵니다. B, s, s 및 트립신을 더 추가합니다.그런 다음 15분 더 배양합니다. 남은 상층액을 세포 여과기를 통해 옮기고 다른 상층액과 결합합니다. 이제 결합된 컬렉션을 1000RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.Reus, 세포 펠릿을 5 밀리리터의 신경교세포(glial media)에 현탁시킵니다. 세포를 계수한 후 각 150제곱센티미터 플라스크에 대해 1,000만 개의 세포를 플레이트하고 다음 날 배양을 시작합니다. 미디어를 새

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

해부 및 개별 뇌 영역에서 세포의 성장은 세포와 생리적 매개 변수의 조사를 용이하게합니다. 우리는 혈청이없는 환경에서 신경 세포 - 풍부한 문화를 생산하는 주요 세포 culturing에 대한 방법을 설명합니다.

P0 신생아 쥐에서 Hippocampal 신경의 주요 문화

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

출처: Calvo-Rodríguez, et al. 노화된 해마 뉴런에서 세포 내 Ca2+의 형광 및 생물 발광 이미징.J. Vis. Exp. (2015).  이 비디오는 단기 및 장기 쥐 해마 배양에서 세포질 칼슘 수치를 측정하기 위해 형광 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 젊은 뉴런과 노화된 뉴런을 비교함으로써, 노화된 뉴런의 증가된 L형 전위의존성 칼슘 채널 밀도와 장기간의 활성화가 어떻게 뉴런 노화의 특징인 칼슘 과부하를 초래하는지 강조합니다. 형광 칼슘 지표는 자극에 따른 형광 강도의 변화를 통해 이러한 차이를 나타냅니다.

In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

1차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 일반적으로 신경 영양 인자를 공급하고 수명을 유지하기 위해 신경교 공급층을 필요로 합니다. 여기에서는 고밀도 뉴런 공급층(neuronal feeder layer)이 있는 곳에서 유리 커버슬립에서 초저밀도 뉴런을 배양하는 단순화된 방법을 설명하며, 이는 특정 뉴런 자율 메커니즘의 연구를 용이하게 합니다.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.

낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

여기서, 우리는 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트(AIS)의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 프로토콜을 기술하였다.

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

학습하세요 칼슘 인산염 침전법을 이용한 해마 신경 세포 형질 전환 방법을. 신생아 쥐 성상교세포 공배양 시스템에서 유전자 도입 효율이 최대 50%에 달하는 경제적이고 효율적인 신경생물학 연구 기법입니다.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

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