Name: 호스트 세포 RNA의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 클릭 화학을 이용해 Rift Valley fever virus 감염 후 호스트 세포의 전사 활성 변화를 분석하는 방법을. 형광 현미경 또는 유세포 분석으로 신규 합성 RNA를 정성·정량 평가할 수 있습니다.

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우리는 마우스 클론 항 RVFV 항혈청 및 유동 세포 계측법에 대한 도움말 UTMB 유동 세포 계측법 핵심 시설의 M. 그리핀을 제공하는 RB Tesh 감사합니다. 이 작품은 UTMB.OL에서 제임스 W. McLaughlin이 원정대 기금 지원에 의해 지원되었다 UTMB.BK에서 백신 개발을위한 실리 센터에서 서부 지역 우수 센터, NIH 보조금 R01 AI08764301 및 자금 5 ~ U54 AI057156에 의해 지원되었다 모리스 R. Hilleman 초기 경력 조사자 포상 있습니다.

형광 현미경에 의한 전사 분석 1. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염 <ol><li> 12 잘 조직 배양 플레이트에 장소는 12 mm 둥근 coverslips를 잘 당 하나의 coverslip을. </li></ol> 참고 : 세포가 우물에 배치하기 전에 문제의 coverslips을 준수, 폴리-L-라이신 (MW ≥ 70,000)와 코트가있는 경우. 이 목표로, 5 분 폴리-L-라이신의 H 2 O의 멸균 0.1 밀리그램 / ML 솔루션 잠수함의 coverslips. 최소한 2 시간 동안 멸균 H 2 O와 공기 건조에 coverslips를 씻어 내시오. <ol start="2"><li> coverslips는 위에 씨앗 293 세포에 잘 당 1 ML 성장 매체 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린 및 100 밀리그램 / ML 스트렙토 마이신을 포함)에 5 × 10 4 세포를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 품어 ° C와 5 % CO 2 O / N. </li><li> 3의 감염의 다중성 (모이)에서 MP-12와 세포를 감염. 포함 적어도 두<html> 감염 우물 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤과 같은 역할을하고, 다른 하나는 전사 억제를위한 제어와 같은 단계 1.5에서 actinomycin D ​​(ACTD)로 처리됩니다. 성장 매체를 제거하고 바이러스 주식을 희석 그래서 전체 볼륨이 각각의 well에 추가 200 ML입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2. </li></ol> 주 : 대신에 세포를 감염 세포도 플라스미드 DNA로 형질 전환 또는 체외에서 특정 바이러스 성 단백질을 코딩 RNA를 합성 할 수있다. 이 목표로, 제조업체의 지침에 따라 해당 화학 물질의 transfection 시약으로 세포를 형질 16 시간 포스트 transfection을 1.5 단계로 진행합니다. 그것은 RNA 라벨 및 고정하기 전에 형질 전환 조건 및 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. <ol start="4"><li> 접종을 제거하고 잘 당 1 ML 신선한 성장 매체를 추가합니다. 15 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol>ove_content는 &quot;&gt; 참고 :. 다른 바이러스와 함께 사용하기위한이 프로토콜을 채택하는 경우, 그것은 RNA 라벨 및 고정을위한 최적의 시점을 결정하는 시간 코스 실험을 수행하는 것이 바람직합니다이 시간 감염 시간이 엇갈리게 될 수 있도록 코스를 모두 설정 샘플 레이블이 해결과 동시에 염색 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 15 시간 게시물 감염 (HPI)에서 1 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 16 HPI에서 매체를 제거하고 1 ML PBS (KCl을 0.20 g / L, KH 2 PO 4 0.20 g / L, 염화나트륨 8.00 g / L, 나 2 HPO 4 1.15 g / L, 산도 7.4) 한 번 coverslips를 세척 잘 당. 물론 당 4 % 파라 포름 알데히드 1 ㎖ (PFA)를 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. </li></ol>참고 : 4 % PFA 고정 솔루션을 준비하려면, ° C 가열 자석 교반기에서 60로 가열 150 ML H 2 O에 10g 파라 포름 알데히드를 분해. 1M NaOH를 500 μl를 추가하고 솔루션 명확해질 때까지 저어 계속합니다. 미립자를 제거하고 62.5 ML 인산 버퍼를 추가하는 필터 종이를 필터링 PFA 용액 (77 mM의의 NaH 2 PO 4, 287 MM 2 나 HPO 4, 산도 7.4). 250 ML의 총 볼륨에 H 2 O를 추가 할 수 있습니다. 단일 사용 분주에서 -20 ° C에서 동결. <ol start="7"><li> 물론 당 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오. 더 배양 시간이 이후의 모든 세척 단계는 필요하지 않습니다. 2 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다, 세포가 4시에 1 시간 동안 유지되는 경우 RNA 형광 신호의 손실은 이미 관찰 할 수 있습니다 ° C . 마찬가지로, 당 경우시간 경과 실험을 형성하면, 라벨 반드시 해결과 동시에 모든 샘플을 얼룩. 2. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다 <ol><li> 1 ML PBS 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어. </li></ol> 참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 2.1-2.3는 핵산 무료로해야합니다. <ol start="2"><li> 물론 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 습기 챔버로 12 - 웰 플레이트 및 전송에서의 coverslips를 제거합니다. 각 : 100 μL를 클릭 염색 용액 (100 mM의 아스 코르 빈산 100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 20 μM 형광 지드 [617분의 590 nm의 여기 / 방출 최대]) - 50 각 coverslip을 커버. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 플라스틱 파라핀 필름 10 cm 직경과 습기 챔버, 선에게 세포 배양 또는 페트리 접시의 바닥을 조립. 디 에지의 내부를 줄젖은 종이 타월로 쉬. 플라스틱 파라핀 필름에 coverslips를 놓습니다. 참고 : coverslips를이 또는 프로토콜의 다른 단계에서 건조 않도록주의하십시오. 그것은이 습기 챔버에 배치 된 후에 바로 각 coverslip에에 얼룩 솔루션을 추가하는 것이 좋습니다. 참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다. 참고 : 형광 현미경 필터와 일치하는 형광을 선택해야합니다. <ol start="4"><li> 신선한 12 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li></ol> 참고 : 아무 드하는 경우바이러스 성 단백질의 방호가 필요한 coverslips를 마운트 될 수 있으며,이 단계 (3.3 단계로 진행) 후 군데. 3. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역 <ol><li> 각각의 well에 차단 버퍼 1 ML (3 % (w / v)의 소에서 (BSA) 알부민 혈청 PBS)를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분간 배양한다. </li><li> 습기 챔버에 12 - 웰 플레이트에서 전송 coverslips를 제거하고 50로 커버 - 버퍼 (1:500) 차단에 희석 일차 항체 100 μL (안티 RVFV 박사 RB Tesh에서 친절한 선물, UTMB). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다. 참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다. <ol start="3"><li> 12 - 웰 플레이트에 다시 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 세척세 1 ML PBS와 시간을 잘 당. </li><li> 50와 습기 챔버 커버에 12 잘 곳 곳에서 coverslips를 제거 - 이차 항체 100 μL (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]을 결합) (1 버퍼를 차단에 희석 : 500). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 기본 항체를 인식하고 형광 현미경 필터와 일치 할 수있는 이차 항체를 선택해야합니다. 참고 : 원하는 경우, 200 NG / ML DAPI는 핵을 시각화하기 위해 차 항체 희석에 추가 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 다시 12 - 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 현미경 슬라이드에 Fluoromount-G 한 방울 (CA. 15 μL) 배치하여 coverslips를 장착합니다. H 2 O로 coverslip을 찍어, 일을 만져 초과 H 2 O를 제거Fluoromount-G의 드롭에 아래로 종이 타월, 장소 세포 측에 전자 쪽. 5 분 공기 건조. </li></ol> 참고 : 거꾸로 현미경 이미징 경우, Fluoromount-G 4에서 고화 할 수 있도록 ° 현미경 슬라이드 CO / N 또는 부착 coverslips를을 투명 매니큐어로 가장자리를 밀봉 있습니다. 참고 : 주까지에 대한 슬라이드를 즉시 군데 나 어두운 곳에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 4. 데이터의 취득 <ol><li> 형광 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol> 참고 : 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 이미지를 얻기 위해 사용되는 형광체 및 필터 세트입니다. DAPI : 여기 필터 : BP 330-385 이색 거울 : DM 400 방출 필터 : LP 420 여기 필터 : BP 460-490 이색 거울 : DM 505 방출 필터 : LP 510 617분의 590의 여기 / 방출 최대 형광 : 여기 필터 : BP 545-580 이색 거울 : DM 600 방출 필터 : LP 610 유동 세포 계측법에 의해 전사 분석 5. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염 <ol><li> 성장 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함) 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 씨앗 293 세포를. 100 % confluency에 - 37 ° C와 5 % CO 2 세포가 80에 도달 할 때까지에 가습 배양기에서 배양한다. </li><li> 모이 3시 MP-12와 세포를 감염. 적어도 두 개의 감염 우물과 같습니다 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤로 제공됩니다, 다른 하나는 단계에서 ACTD으로 처리됩니다5.4. 성장 매체를 제거하고 전체 볼륨이 각각의 well에 첨가하도록 바이러스 주식을 희석하여 400 μL입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 접종을 제거하고 2 ㎖ 새로운 성장 매체를 잘 당 추가합니다. 12 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기위한이 프로토콜을 적응 경우, 라벨 및 수확에 대한 최적의 시점을 결정하는 시간 코스 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 감염 시간은 엇갈리게하고 모든 샘플 수확, 표시, 동시에 염색 할 수 있도록이 시간 코스를 설정합니다. <ol start="4"><li> 12 HPI에서 0.5 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 13 HPI에서 재치 번 세포를 씻으세포의 트립신에 의해 H PBS 및 수확. PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS-EDTA)을 함유 수확 세포를 세 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 이후의 단계에서, 500보다 빠르게 세포를 원심 분리하지 마십시오 - 1,000 XG에 세포의 파손을 방지 할 수 있습니다. 1 세포를 원심 분리 - 침전 ~ 2 분. 참고 : 표면 면역 염색 대신 고무 경찰관 또는 일회용 세포 스크레이퍼를 사용하여 클릭 반응, 수확 따라 계획됩니다. <ol start="6"><li> RT에서 30 분 동안 4 % PFA과 부화 1 ㎖에 그들을 현탁하여 세포를 고정합니다. 4 % PFA를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 1.6 단계를 참조하십시오. </li><li> 물론 당 1 ML PBS-EDTA 한 번 씻으십시오. 6 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 시간이 C를 수행하는 경우ourse를 실험은 동시에 모든 샘플에 레이블을 수정하고 얼룩해야합니다. 6. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다 <ol><li> PBS 0.2 % 트리톤 X-100 0.5 ㎖에 현탁하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어. </li></ol> 참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 6.1-6.3는 핵산 무료로해야합니다. 참고 : 세포가이 단계에서 침전 제대로하지 않으면 5 분에 원심 분리 시간을 증가시킨다. 침전 동작은 한 번 세포는 FACS 버퍼 (단계 6.4)에서 일시 중지됩니다 향상됩니다. <ol start="2"><li> 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 구리 2 + 이온을 클릭 반응에 필요한 킬레이트되므로이 단계에서 EDTA를 사용하지 마십시오. <ol start="3"><li> 200 μL를 클릭 염색 용액에 세포를 resuspend (100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 형광 염료 [당일로 표시된 200 ㎚ 지드itation / 방출 최대 : 665분의 650 NM], 100 mM의 아스 코르 빈산). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다. 참고 :이 단계에서 함께 세포 덩어리하면, 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 resuspend을. 참고 : 흐름 cytometer에 의해 감지 할 수있는 형광을 선택해야합니다. 참고 : 또한 클릭 염색 절차에 노출되지 않습니다 감염된 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 감염된 세포의 절반을 사용하거나 단계 5.2에서 잘 감염 추가적인 있습니다. 이 콘트롤 세포 단계 7.1에서 면역 염색 될 것입니다. <ol start="4"><li> FACS 버퍼 (PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % (W / V) BSA를 포함)로 두 번 씻으십시오. </li></ol> 참고 : 바이러스 성 단백질에는 면역 염색이 요구하지 않으면, 세포를 분석 할 수있는 즉시 (8 단계로 진행). 7. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역 <ol><li> 일차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (안티 RVFV)는 FACS 버퍼 (1:10,000)에 희석과 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다. 참고 : 또한 클릭 염색 절차의 대상이되었지만 면역 염색되지 않습니다 감염되지 않은 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 모의 감염된 세포의 절반을 사용하거나 추가 감염도에 포함5.2 단계. 참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다. <ol start="2"><li> FACS 버퍼에 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 이차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]에 복합) FACS 버퍼 (1:1,000)로 희석하여 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> FACS 버퍼에 한 번 세포를 씻으십시오. </li></ol> 참고 :이 시점에서, 세포가 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 저장할 수 있습니다. 8. 데이터의 취득 <ol><li> 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 500 ㎕의 FACS 버퍼 전송에 세포를 resuspend을하고 흐름 cytometer에를 사용하여 분석합니다. 기기를 보정하는 MP-12에 감염된 세포 (단지 아니요를 클릭 반응, 안티 RVFV 염색) 및 모의 감염된 세포를 (단지 반응을 클릭)를 사용합니다. </li></ol> 아니E : 악기에 의해 감지 될 수있다 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 데이터를 수집하는 데 사용되는 레이저 라인과 필터 세트입니다. 519분의 495의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 : 레이저 : 488 nm의 필터 : 30분의 530 665분의 650의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 : 레이저 : 640 nm의 필터 : 20분의 670

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<li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제공되는 프로토콜은 초기 RNA에 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 방법을 설명합니다. 그것은 빠르고, 민감하고, 방사성 동위 원소의 사용에 의존하지 않는이 방법은 이전 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 또한,이 방법은 형광 현미경이나 본질적으로 같은 시약을 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 정량적 데이터를 질적 데이터를 산출하기 위해 적용 할 수 있습니다. 바이러스 성 항원에 대한 면역 형광 염색과 결합 될 때,이 방법은 연구자가 감염되지 않은 세포에서 감염 차별화 할 수 있습니다. 그것은 호스트 성적 증명서, 3 H-딘 또는 부순 법인에 의존하는 다른 방법으로 공유되는 단점을 레이블로이 방법은 또한 동일한 속도로 새롭게 합성 된 바이러스의 RNA 레이블을주의하는 것이 중요합니다. RVFV MP-12 감염의 경우 적어도 그러나, 우리는 발견 한 AMO지금까지 호스트 성적 UNT는 바이러스 사본의 양...

<html> 전통적으로 전사 활동은 방사성 (3 H-딘 1) 하나의 법인을 통해 측정 또는 초기 RNA로 (BRU) 2 클레오 할로겐되었습니다. 이 딘 유사체는 세포에 의해 촬영 클레오 회수 경로를 통해 딘 - 삼인산 (UTP)로 변환하고, 이후 새로 합성 된 RNA로 통합. 3 H-딘은 많은 시간이 소요될 수 있습니다 기록법, 또는 섬광에 의해 감지 될 수있다 전문 장비를 필요로하는 계산. 또한, 방사성 동위 원소의 사용은 높은 억제 생물 안전성 연구소 등의 실험실 설정의 숫자에 실용적이지 않을 수 있습니다. BRU는 RNA 이차 구조는 항체 바인딩에 대한 입체적 방해가 될 수도로 핵 또는 RNA의 부분적인 변성에 항체의 접근을 보장하기 위해 거친 permeabilization이 필요할 수 있습니다 안티 - BRU 항체로 면역 염색을 통해 감지 할 수 있습니다. _content &quot;&gt; 여기에서 설명하는 프로토콜은 최근 RVFV 변형 MP-12에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 화학 3을 누릅니다 개발했다. 클릭 화학은 매우 선택적이 고 효율적인 구리 (I) 촉매 알킨 사이 사이클로 반응에 의존 활용 4,5 지드 부분은.이 프로토콜에 감염된 세포의 초기 RNA가 먼저 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 표시되어 있습니다. 두 번째 단계에서는 통합 된 유럽 연합 (EU)이 형광 지드와 반응을 통해 검출된다.이 방법의 주요 장점은 있습니다 (1) 방사성 동위 원소의 사용을 필요로하지 않습니다 (2) 그 그것은 가혹한 permeabilization 또는 RNA의 변성을 필요로하지 않습니다. 부족에 의해 방해되지 않습니다 미만 50 다, 형광 지드의 액세스 분자량 클래스와 RNA의 검출을 결합 할 때 permeabilization 또는 RNA 이차 구조. 또한, 연구자들은 일차 항체의 자신의 선택에 국한되지 않습니다바이러스 성 단백질의 iCal 면역 염색. 두 가지 방법이 프로토콜에 설명되어 있습니다 : 형광 현미경 (1-4 단계) 및 유동 세포 계측법 (5-8 단계)를 통해 전사를 정량화 하나를 통해 전사를 시각화 한. 두 방법 모두 셀 단위 기준으로 전사 활성과 바이러스 감염 사이의 상관 관계를 허용 바이러스 단백질에 대한 세포 면역 염색으로 초기 RNA의 라벨을 결합한다. 저자는 성공적 프로토콜 RVFV 변형 MP-12 6 토스카나 바이러스 (TOSV) 10에 감염된 다른 MP-12 돌연변이 7,8, 9, 세포와 감염된 세포에 감염된 세포에서 전사 활동을 결정하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 쉽게 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 적응 특정 바이러스 또는 세포 단백질의 면역 형광 염색을 포함하도록 수정 될 가능성이있다 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5-에티닐-우리딘</td><td>베리 어소시에이츠</td><td>PY 7563</td><td>100 mM 스톡용 DMSO에 용해</td></tr><tr><td>12mm 원형 커버슬립</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 폴리스티렌 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>10 mM 스톡용 DMSO에 용해</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>100 mM 주식 용 H2O에 용해</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td> 5 mg/ml 주식 DMEM Invitrogen 11965092 <td>FBS에 H2O에 용해</td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>형광 아지드(Alexa Fluor 594-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>형광 아지드(Alexa Fluor 657-coupled)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td>은 <td>500mM 동안 H2O에 용해 </td></tr> 됩니다.<tr><td>종이 필터</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 </td><td>시그마</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 (MW &#8805; 70000)</td><td>시그마</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>시그마</td><td>T-1503</td><td>1.5 M 스톡의 경우 H2O에 용해, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td></td><td></td><td>e.e. Olympus IX71</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td></td><td></td><td>e.e. BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

호스트 세포 rn​​a의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

많은 RNA 바이러스는 세포의 방어를 회피하는 수단으로 숙주 세포의 전사를 억제하는 능력을 진화했다. 이러한 바이러스의 연구에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 전통적으로, 전사는 H-딘 같은 면역 염색을 통해 감지 한 다음 5 bromouridine (BRU) 등 할로겐 딘 유사체의 autoradiography를 또는 섬광 계수 또는 법인을 통해 탐지 다음과 같은 3 등 방사성 클레오의 내장으로도 측정되었습니다. BRU의 검출이 번거로울 수 있습니다 낮은 감도에서 고통 수도 있지만 방사성 동위 원소의 사용은, 그러나, 특수 장비가 필요하며 실험실 설정의 숫자에 적합하지 않습니다. 아 지드와 알킨에서 구리 촉매 트리아 졸의 형성을 포함 최근에 개발 클릭 화학은 이제 신속하고 highl를 제공합니다이 두 가지 방법에 대한 예 민감 대안입니다. 클릭 화학은 초기 RNA가 먼저 형광 지드와 라벨의 검출에 이어 딘 아날로그 5 ethynyluridine (EU)의 결합에 의해 표시되는 두 단계 프로세스입니다. 이러한 지드 시각화 옵션의 넓은 범위를 허용, 여러 가지 형광체로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 긴장 MP-12 클릭 화학을 사용하여 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 방법을 설명합니다. 동시에,이 세포에 바이러스 성 단백질의 발현은 고전적인 세포 면역 염색에 의해 결정됩니다. 8 세부 유동 세포 계측법을 통해 전사 억제를 정량화하는 방법을 5 단계 동안, 4 세부 형광 현미경을 통해 전사 억제를 시각화하는 방법을 통해 1 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수있다.

RVFV의 NSS 단백질 (가족 Bunyaviridae, 속 Phlebovirus)는 11 두 가지 메커니즘을 통해 숙주 세포의 일반적인 전사를 억제 (I) 봉쇄에 의한 P62의 프로 테오 분해를 촉진하여 기저 전사 인자 TFIIH 11 (II)의 P44 소단위 TFIIH 6 소단위. MP-12 균주는 바이오 안전성 수준이 실험실에서 처리 될 수 있으며에 다른 야생 적용되는 미국의 선택 에이전트 규칙에서 제외되기 때문에 RVFV MP-12 백신 균주 13이 프로토콜에 설명 된 실험에 사용 된 RVFV 균주를 입력합니다. MP-12 균주의 NSS 단백질은 완전한 기능 및 호스트 전사 6를 억제 할 수있는 능력을 유지합니다. NSS 유전자 14의 69 %를 포괄 삭제를 운반하는 바이러스 rMP12 - C13type는, 숙주 세포의 전사를 억제하는 기능을 포함하여 모든 NSS 기능을 ...

이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

본 실험의 전반적인 목적은 바이러스에 감염된 세포의 전사 활성을 분석하는 것입니다. 먼저 293 세포를 리프트 밸리열 바이러스(rift valley fever virus) MP-12로 감염시킵니다. 그 다음, 신생 RNA에 통합되는 uridine 유사체인 5-ethynyl-uridine으로 세포를 표지합니다. 이어서, 새로 합성된 RNA를 시각화하기 위해 통합된 5-ethynyl-uridine을 형광 아지드(fluorescent azide)와 결합시킵니다. 얻어진 결과를 바탕으로 형광 현미경 또는 유세포 분석법을 이용하여 감염된 세포와 감염되지 않은 세포 간의 신생 RNA 양의 차이를 평가합니다.트리튬화 우리딘(tritiated-uridine)이나 5-브로모 우리딘(5-bromo uridine)을 이용한 표지와 달리, 이 클릭 화학 방식은 방사성 동위원소를 사용할 필요가 없습니다. 또한, 항-브로모 우리딘 면역염색보다 더 빠르고 민감합니다. 이 방법은 서로 다른 리프트 밸리열 virus, MP-12에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법이 필요하다는 점에서 고안되었습니다.12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 12mm 원형 커버슬립을 넣습니다. 그다음, 1mm의 완전 DMEM 배지에 293 세포를 파종합니다. 습윤 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2 조건으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 실험 설계에 따라 바이러스 스톡을 희석하여, 웰당 총 부피 200µL 내에서 MP-12에 의한 세포 감염 다중도(MOI)가 3이 되도록 합니다. 한 웰은 비감염 대조군으로, 다른 한 웰은 전사 억제 대조군으로 지정합니다. 이제 성장 배지를 제거합니다. 바이러스 접종액을 첨가하고 습윤 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 접종액을 흡입하여 제거합니다. 웰당 1mL의 신선한 성장 배지를 추가하고 37°C에서 배양합니다. 감염 후 15시간에, 성장 배지를 1mM의 유리딘 유사체인 5-ethynyl-uridine이 포함된 배지로 교체합니다. 모의 감염된 웰 중 하나에는 DNA 의존성 RNA 합성 억제제인 actinomycin-D를 5µg/mL 농도로 추가로 첨가합니다. 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 감염 후 16시간에, 배지를 제거하고 웰당 1mL의 PBS로 커버슬립을 한 번 세척합니다. 웰당 1mL의 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 웰당 1mL의 PBS로 한 번 헹굽니다.가습 챔버를 구성하려면 직경 10cm의 세포 배양 접시 또는 페트리 접시 바닥에 플라스틱 파라핀 필름을 깝니다. 접시 가장자리 안쪽에 젖은 종이 타월을 두릅니다. 이제 세포를 투과성 있게 만들기 위해 0.2% Triton X-100/PBS 용액 1mL를 첨가합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후, 커버슬립을 가습 챔버로 옮깁니다. 표지된 RNA를 검출하기 위한 클릭 반응을 위해, 각 커버슬립에 갓 제조한 클릭 염색 용액 50~100µL를 덮어줍니다. 암소 상태의 상온에서 1시간 동안 배양합니다.새 12-웰 플레이트의 각 웰에 PBS 1 mL를 넣고 커버슬립을 웰로 옮깁니다. 웰당 1 mL의 PBS로 두 번 더 세척합니다. 형광 현미경 관찰을 위해 세포를 마운팅하려면, 현미경 슬라이드 위에 Fluoromount-G 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버슬립을 물에 담근 후 여분의 물기를 제거합니다. 세포가 있는 면이 아래로 향하게 하여 커버슬립을 Fluoromount-G 방울 위에 올리고 5분 동안 자연 건조합니다.실험 설계에 따라, 293 세포에 MOI 3으로 MP 12를 감염시킵니다. 성장 배지를 제거하고 희석된 바이러스 스톡을 추가한 후, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 습윤 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 접종물을 웰당 2 mL의 신선한 성장 배지로 교체하고, 바이러스 표지 및 수확을 위한 최적의 시간 동안 37 °C에서 배양합니다. 그 후, 모의 감염된 웰 중 하나에 성장 배지를 0.5 mM 5-ethynyl-uridine이 포함된 배지로 교체합니다. 또한 5 µg/mL actinomycin-D를 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 배양합니다. PBS로 1회 세척한 후, 트립신화를 통해 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 1 mM EDTA가 포함된 PBS로 3회 세척합니다. 세포를 고정하기 위해 펠릿을 1 mL의 4% PFA에 재현탁하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 튜브당 1 mL의 PBS-EDTA로 1회 세척합니다. 이어서 PBS 내 0.2% Triton X-100 0.5 mL에서 실온으로 10분 동안 세포를 투과화합니다. nuclease free PBS 1 mL로 1회 세척합니다. 클릭 반응을 위해, 세포 펠릿을 형광 염료가 포함된 200 µL의 클릭 염색 용액에 재현탁합니다. 세포가 뭉쳐 있는 경우, 피펫팅을 통해 재현탁합니다. 암소의 실온에서 1시간 동안 배양합니다. FACS 버퍼로 2회 세척합니다.본 실험에서는 293 세포를 MP-12 및 숙주 세포의 전사 억제 능력이 결여된 결실 돌연변이 바이러스로 감염시켰습니다. 모의 감염된 세포에서는 전사가 계속 진행되고 있기 때문에 핵이 밝은 빨간색으로 나타납니다. 세포를 1시간 동안만 EU로 표지한 후 즉시 고정했으므로, 대부분의 RNA는 핵에 남아 있습니다. 이와 대조적으로, Actinomycin-D를 처리하여 약리학적으로 전사를 억제한 경우 핵의 빨간색 형광이 현저히 감소합니다. 이러한 형광 감소는 세포가 MP-12에 감염되었을 때도 비슷하게 나타나지만, 숙주 전사를 억제하지 않는 결실 돌연변이에 감염되었을 때는 나타나지 않습니다. 여기서는 생바이러스 감염 대신 시험관 내에서 합성된 mRNA를 세포에 트랜스펙션했습니다. 핵의 빨간색 형광 신호는 GFP(green fluorescent protein)를 인코딩하는 mRNA가 트랜스펙션된 세포가 트랜스펙션되지 않은 세포와 비교하여 전사 활성에 변화가 없음을 나타냅니다. Rift Valley fever virus의 병원성 인자인 NSs를 인코딩하는 mRNA를 트랜스펙션했을 때만 빨간색 형광이 감소하는 결과가 나타납니다. 정량화 시, 획득한 유세포 분석 데이터는 Y축에 신생 RNA로의 EU 통합에 대한 형광 신호를, X축에 anti-rift Valley fever virus 염색에 대한 신호를 표시한 산점도로 나타낼 수 있습니다. 사분면 게이트는 모의 감염된 세포의 대부분이 왼쪽 상단 사분면에 위치하도록 설정되었습니다. Actinomycin-D 처리 세포의 대부분은 왼쪽 하단 사분면에 위치했으며, 감염된 세포의 대부분은 도표의 오른쪽 절반에 위치했습니다. 세포를 MP-12로 감염시켰을 때, 전체 세포의 81.5% 또는 anti-rift Valley fever virus 양성 세포의 93%가 감소된 전사 활성을 보였습니다. 반면, 세포를 MP-12 clone 13-type으로 감염시켰을 때, 전체 세포의 91.6% 또는 anti-rift Valley fever virus 양성 세포의 97%가 모의 감염 세포와 유사한 수준의 전사 활성을 보였습니다. 이 데이터는 EU 통합을 이용한 RNA 형광 표지의 히스토그램 형태로도 묘사될 수 있습니다.이후 이러한 세포 내에서 바이러스 단백질의 발현을 시각화하기 위해 세포 내 면역염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형광 현미경 또는 유세포 분석법을 통해 바이러스에 감염된 세포의 전사 활성을 시각화하기 위해 클릭 화학을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.감염성 바이러스를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 적절한 개인 보호 장구(PPE) 착용 및 에어로졸 흡입 방지와 같은 예방 조치를 반드시 준수하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

이 비디오는 바이러스가 숙주 세포로 진입하고 엔도솜과 융합하는 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 저온에서 배양된 다음 HCV에 감염됩니다. 낮은 온도는 숙주 세포에 대한 바이러스 결합을 허용하지만 내포작용(endocytosis)을 통한 내재화를 억제합니다. 테스트 항바이러스 화합물을 첨가하고 세포를 생리학적 온도에서 배양합니다. 이러한 더 높은 온도로의 이동은 바이러스 진입을 용이하게 하고 엔도솜과의 바이러스 외피 융합에 대한 테스트 화합물의 영향을 평가할 수 있습니다.

숙주 세포의 바이러스 진입 및 융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 평가하기 위한 분석

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

배우세요 클릭 화학을 이용해 Rift Valley fever virus 감염 후 호스트 세포의 전사 활성 변화를 분석하는 방법을. 형광 현미경 또는 유세포 분석으로 신규 합성 RNA를 정성·정량 평가할 수 있습니다.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

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