Name: 막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 막 단백질의 생체 내 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 막 스파인 기술을 통해 생화학적 방법을 익히세요. 포름알데히드 가교결합, 친화성 정제 및 질량 분석을 활용하여 낮은 친화도나 일시적인 상호작용까지 검출할 수 있습니다.

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이 연구는 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 및 SFB940의 교부금에 의해 지원되었다

참고 : 프로토콜에 표시된 버퍼에 대한 자세한 정보는 표 1에서 사용할 수 있습니다. 1. 포름 알데히드는 살아있는 세포 간 연결하여 단백질 - 단백질 상호 작용의 고정 <ol><li> 성장 미디어, 주식 솔루션 및 버퍼 P1을 준비 시작하려면 <ol><li> 500 ㎖의 배지를 준비 매체 막 미끼 단백질과 먹이 단백질 간의 상호 작용을 지원하는 조건을 제공한다. 또, 하나의 실험에서는 어떠한 상호 작용 (가교없이 예) 예상되는 조건 하에서 수행되어야한다. 참고 : 우리는 스트레스가 아닌 스트레스를 박테리아의 단백질 - 단백질 상호 작용을 비교합니다. 따라서, 우리는 우리가 2 L 삼각 플라스크에 스트레스 유도제 (예를 들어, 0.5 M의 NaCl)으로 보완 500 ㎖의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (표 1)를 준비하고 있습니다. 제어를 위해, 우리는 0.17 M 염화나트륨 (산도 7.0)와 일반 LB 매체를 사용합니다. </li><li> 트리스 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스-HCL;의 pH 8.0) 및 0.1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH를 8.0 원액 (표 1). </li><li> 버퍼 P1을 준비합니다. 트리스 완충액에서 0.5 M의 최종 농도에 자당을 용해. 여과에 의해 버퍼 P1을 소독하고 4 ℃에서 저장 </li></ol></li><li> 벡터에서 C-말단 패 혈성 태그 융합으로 막 미끼 단백질을 발현하는 세포를 성장. 충분한 시간 동안 멤브레인 미끼 단백질의 발현을 유도한다. 참고 : 우리는 500 ml의 매체에 250 ㎕의 1 M 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 초기 로그 단계 (A 600 = 0.3)에서 (최종 농도 : 0.5 mm)를 세균의 막 미끼 단백질의 발현을 유도 . 충분히 식을 수 있도록하기 위해, 우리는 늦은 로그 단계 (A 600 = 1.2) 때까지 박테리아를 배양한다. </li><li> 300 ㎖의 각각의 최소 볼륨 각 문화 두 개의 원심 분리기 비커를 준비하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 포름 알데히드 가교를 수행합니다. CAUTION : 포름 알데히드는 독성이 강한 우리가 안전 흄 후드에서 작업하는 것이 좋습니다.. <ol><li> 안전 흄 후드에서 배양 용기를 전송합니다. (- X)와 가교 포름 알데히드 (+ X)를 포함하여 한 두 개의 샘플, 가교를 생략 하나에 각각의 샘플을 분할합니다. 0.6 %의 최종 농도에 도달하기 위해 250 ㎖의 배양을 4 ml의 37 % 포름 알데히드 용액을 추가. </li></ol></li><li> 다시 문화 혈관을 전송하고 이전과 추가 20 분 동안 세포를 성장. </li><li> 안전 흄 후드 아래에 원심 분리기 튜브로 문화를 기입하십시오. 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> 신중하게 안전 연기 후드 아래에 그것을 피펫으로 상층 액을 버린다. 독성 포름 알데히드 함유 상층 액을 수집하고 적절하게 처리하십시오. </li><li> 막 단백질의 준비 기간 동안 최적의 수율에 도달하기 위해 먼저 spheroplasts를 준비합니다. 여기, 우리는 그람 음성 박테리아의 스페 형성을위한 프로토콜을 제공 : <ol><li> Prepar전자 버퍼 P2 (표 1) 동결 건조 분말. 부드럽게 1.5 ML 튜브에, 0.1 M EDTA, pH가 8에서 2 밀리그램의 라이소자임을 녹입니다. 항상 실험의 하루 갓 버퍼 P2를 준비합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 억제제 (버퍼 P3)과 트리스 버퍼를 준비합니다. 트리스 완충액 10 ㎖로, 10 mM의 최종 농도로 0.1 ㎖의 1 M 페닐 메틸 (PMSF) (표 1)을 추가한다. 프로테아제 억제제 PMSF의 기능이 제대로 동작하는지 확인하기 위해 즉시 버퍼를 사용합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 억제제와 15 ML 원뿔 튜브로 전송 솔루션 10 ㎖ 트리스 버퍼를 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 1 ㎖ 버퍼 P2를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 spheroplasts를 수집하고 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li></ol></li><li> -20 ℃에서 하룻밤 스페 펠렛을 품어 </li></ol> 2. 패 혈성 태그의 막 단백질의 정제 (미끼) <ol><li> 얼음에 스페 펠렛을 놓습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 스페 펠렛은 얼음에 해동 시간 동안 각 스페 준비를 위해 10 ㎖ 버퍼 P3를 준비합니다. 조심스럽게 10 ML 트리스 버퍼에 1 mg의 DNaseI을 녹입니다. 사용 직전에 0.1 ㎖의 1 M의 PMSF를 추가합니다. </li><li> 6 ㎖를 새로 제조 P3에서 펠렛을 재현 탁. spheroplasts을 방해하기 위해, 각 버스트 사이에 1 분의 일시 정지와 얼음에 지속적으로 1 분 동안 샘플 네 번 초음파 처리. </li><li> 수확 된 세포 파편을 10 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초원 심 분리기 튜브에 피펫을 사용하여 상층 액을 전송합니다. </li><li> 30 분 동안 100,000 XG에서 막 분획을 펠렛. 를 용해하지 않고 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛을 씻으십시오. 종이 조직 (예를 들면 휴지)와 튜브를 건조. 언제든지 펠​​렛을 방해 피한다. </li><li> 1 ㎖ 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛 (= 세포막을)를 Resuspend. 예 BCA 분석하여 단백질 농도를 결정하기 위해 20 μL 나누어지는을 사용합니다. 이 단계에서, 멤브레인은 충격에 리 얼 수pond 지폐 질소 -80 ° C.에 저장 </li></ol> 3. 패 혈성 태그 막 미끼 단백질 및 SDS-PAGE의 정화 <ol><li> 트리스 완충액으로 5 ㎎ / ㎖로 막 분획의 단백질 농도를 정상화. 초 원심 분리기 튜브에 2.5 ml의 막 분획 (5 ㎎ / ㎖)를 취하여 막 단백질을 가용화하기 위해, 2 %의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤 X-100의 0.25 mL를 넣고. 마이크로 자석 막대를 추가하고 1 시간 동안 얼음에 저어. 참고 : 일반적으로 우리는 세제로 트리톤 X-100을 사용하여 좋은 결과를 가지고 있지만, 그것은 최적화를위한 세제를 변경하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이러한 관점에서, 우리는 각각의 멤브레인 미끼 단백질의 기능적 정제에 사용되는 세제 최상의 결과가있다. </li><li> 3.1 단계를 수행하는 동안, 50 ㎖는 (표 1)에서 W와 5 ㎖ 버퍼 E 버퍼 준비합니다. 10 ㎖ 5 배 버퍼 W 농축 ML 50을 입력하고 150 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다. <ol><li> 1 ㎖ 배 buffe를 기입R의 E의 10 ㎖로 농축하고 30 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다. 8 ㎖의 버퍼 W.와 1 ㎖ 패 혈성-Tactin superflow 중력 흐름 열 평형 주 : 정제 절차 중에 어떤 버퍼 내의 임계 미셀 농도 (CMC) 이상의 농도의 10 배에서의 가용화에 사용되는 세제를 추가하는 것이 필수적이다. </li></ol></li><li> 불용성 막 분획을 펠렛 30 분 동안 100,000 XG에서 가용화 샘플 및 초 원심 분리기에서 마이크로 자기 막대를 제거한다. 추가의 정제를위한 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 열을 뜨는을로드합니다. 중력의 흐름에 열을 실행합니다. 이 세척 단계 배를 반복하여 5 ㎖ 버퍼 W.에 열을 씻으십시오. </li><li> 이 용출 단계 반복 배속 1 ㎖ 버퍼 E.으로 막 미끼 단백질을 용출. </li><li> 원심 분리 필터 장치로 용출 분획 2, 3 및 4-300 μl를 집중한다. </li><li> 50 ㎕의 5 배 SDS-PAG 각 샘플의 200 μl를 혼합E 로딩 염료. 125 μL 씩 분주 각 준비를 분할합니다. 포름 알데히드 상호 링크를 반대하는, 95 ° C에서 20 분 동안 각각 준비 하나 나누어지는 끓인다. 샘플 벤치 위에 적어도 10 분 동안 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 면역 블롯에 적합한 폴리 아크릴 아마이드 겔의 하나의 레인에로드 각 시료 30 μl를. 가장 좋은 방향으로의 prestained 분자량 마커를 사용하여 SDS-PAGE (10)을 실행합니다. </li></ol> 4. 면역 블롯 분석 상호 작용 파트너를 확인하려면 <ol><li> 일단 7.6이 예 반 건조하여 니트로 셀룰로오스 막에 전사 단백질을 완료 단계. </li><li> 비특이적 라벨링을 방지하는 멤브레인을 차단. 0.05 % 트윈 -20 (TBS-T)의 최종 농도로 보충 트리스 - 완충 식염수 부피 당 3 중량 %를 달성하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA)을 계량하여 차단 완충액 준비한다. 멤브레인을 포함하는 버퍼를 차단하는 충분한 양을 사용합니다. 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다. </li><li> 희석ND 평소와 같이 먹이 단백질 특정 첫 번째 항체를 배양한다. 두 번째 항체로 HRP 결합 된 항체를 사용합니다. </li><li> 고감도 화학 발광 검출 키트를 사용하여 면역 블롯을 개발한다. 고전 막 처리 절차 또는 디지털 촬영 장비를 사용하여 신호를 모니터한다. </li></ol> 5. 상호 작용 파트너를 식별하는 NanoLC-ESI-MS/MS 높은 해상도 실험 <ol><li> 확인되어야한다 특정 항체가 먹이 단백질 또는 알 수없는 상호 작용 파트너를 사용할 수없는 경우, 식별을위한 질량 분석 (MS)를 사용합니다. 각질 오염을 방지하기 위해서, 단백질 분리를위한 precasted 겔을 사용한다. </li><li> 실버는 제조자의 프로토콜에 따라 MS 호환 염색 키트를 사용하여 SDS-PAGE 얼룩. 유리 탱크에있는 염색 및 세척 단계를 수행합니다. </li><li> 소비세 각 밴드와는 고해상도 LC / MS (9)에 의해 이들을 분석한다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

막 척추 분석을 확인하고 막 단백질의이 시점 알 수없는 상호 작용 파트너 식별을 가능하게하는 생화학 적 방법입니다. 막 척추 연쇄상 구균 태그가 막 미끼 단백질의 정제와 포름 알데히드에 의해 생체 내 가교에 결합한다. 면역 블로와의 조합은 예상 상호 작용 파트너의 확인 (그림 2)을 용이하게한다. 또한, MS의 분석과 함께 알 수없는 상호 작용 파트너의 식별 (그림 3)을 허용합니다. 두 애플리케이션은 해당 단백질의 먹이를 수정하기위한 요구 사항이 없다. 또한, 막 척추 내생 먹이 단백질 (6)의 검출을 허용 할 수있을만큼 충분히 민감하다. 여기, 우리는 그람 음성 세균의 막 단백질에 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 그람 음성 박테리아의 봉투 외에도 환경이나 민병대으로부터 세포질을 분리세포질 막, 외막과 murein의 sacculus. 따라서, 우리의 프로토콜은 소위 spherop...

단백질의 기능을 이해하기 위해 그것의 파트너 상호 작용을 아​​는 것이 필수적이다. 여러 고전적인 기술은 수용성 단백질의 상호 작용 파트너의 ID를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 소수성 4에 의한 막 단백질을 쉽게 양도 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용 실험 (막 척추) 6을 개발했습니다. 그것은 수용성 단백질 7 만 적합한 척추 방법을 기반으로합니다. 가교제의 포름 알데히드의 두 가지 장점에서 막 척추의 장점은 첫째, 포름 알데히드는 쉽게 세포막을 통과하기 때문에 살아있는 세포 8 interactome의 정확한 스냅 샷을 생성 할 수 있습니다. 둘째, 포름 알데히드 상호 링크는 9 끓는으로 되돌릴 수 있습니다. 여기서, 이러한 두 가지 이점은 멤브레인 PROTE 영구 아니라 과도 프로톤 펌프 억제제뿐만를 식별하는 데 사용기능 6. 요컨데, 패 혈성-태그가 일체형 멤브레인 미끼 단백질의 C-말단에 융합된다. 막 미끼 단백질을 발현하는 세포는 간 링크가 막 미끼 단백질로 단백질을 먹이로 포름 알데히드 (그림 1)와 함께 배양된다. 먹이 단백질의 수정은 필요하지 않습니다. 다음에, 막 분획을 제조하다. 따라서, 막 단백질은 단백질이 친화력 정화를 먹이 단백질과 공동으로 정제되어 세제 처리 및 미끼에 의해 용해된다. 이어서, 가교가 비등하여 반전되고, 미끼 및 그 공동 용출 먹이 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 마지막으로, 먹이 단백질은 면역 블롯 분석 또는 질량 분석법에 의해 확인 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>1년 이상 오래되어서는 안 됨</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Micromagnetic rod</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>길이 5mm, 직경 2mm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>가용화를</td></tr> <tr><td>위한 표준 세제n-Dodecyl-&beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>, CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag 단백질 정제 버퍼 세트</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>버퍼 W와 버퍼 E</td></tr><tr><td>포함 Amicon Ultra-4 원심 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 화학발광 기판</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Staining Kit</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

막 단백질은 세포 생존에 필수적이며, 따라서 중요한 치료 표적 1-3이다. 그들은 단지 4에서 작동하기 때문에, 상호 작용을 파악하고 특징 짓는 방법은 5 필요합니다. 이를 위해, 우리는 막 척추 6라고 불리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용의 실험을 개발했다. 이 기술은 연쇄상 태깅 막 미끼 단백질의 친화도 정제하여 리버시블 가교제 포름 알데히드를 사용하여 가교 생체 내에서 결합한다. 절차 중에 가교 먹이 단백질은 막 단백질을 미끼로 공동 정제이어서 비등에 의해 분리된다. 막 등뼈를 사용하여 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)를 분석 할 때 따라서, 두 가지 주요 작업을 실행할 수 있습니다 : 첫 번째, 면역 블, 그리고에 의해 제안 된 상호 작용 파트너의 확인 번째, 질량 분석 분석에 의해 새로운 상호 작용 파트너의 식별 . 또한,도 L친화력 아야, 과도 프로톤 펌프 억제제는이 기술에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 막 척추는 막 단백질의 프로톤 펌프 억제제를 식별 할 수있는 강력한 검사 도구로 적용하고, 거의 모든 세포 유형에 적응할 수있다.

멤브레인 척추 분석은 막 단백질의 공동 정화 및 일시적으로 상호 작용 단백질 파트너를 허용한다. 공동 정제는 가교제 포름 알데히드를 사용함으로써 달성된다. 포름 알데히드 농도 및 가교 시간 : 두 매개 변수는 비특이적 교차 결합을 방지하기 위해 중요하다. 포름 알데히드의 과도한 충분하지만, 사용하지 않는 간단 면역 블 롯팅에 의해 제어 될 수있다. 포름 알데히드 가교 결합 된 단백질 복합체는 SDS 처리에 의해 보일 수 있지만 의해 분리 될 수있다. 따라서, 그들은 unboiled 샘플의 면역 블롯의 상단에있는 얼룩과 패 혈성 - 태그 막 미끼 단백질의 블로 팅 후 시각화 할 수 있습니다. 필요한 모든 컨트롤을 포함 멤브레인 척추 분석의 대표적인 결과는 그림 2에 표시됩니다. 미끼 단백질로서 대장균의 적분 막 단백질 CpxA는 6,11를 사용 하였다. CpxA는 센서 키나아제이며 이루어져큰 extracytopl...

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

이 절차의 전반적인 목표는 막 연쇄상구균 단백질 상호 작용 실험 또는 막 척추를 통해 생체 내 단백질, 막 단백질의 단백질 상호 작용을 확인하는 것입니다. 이는 포름알데히드에 대한 가역적 가교제를 사용하여 생체 내 가교에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 가교 결합된 먹이 단백질과 함께 스트렙트 태그가 지정된 막 미끼 단백질을 정제하는 것입니다.다음으로, 가교는 끓임에 의해 역전됩니다. 마지막 단계는 나트륨 do desal sulfate, poly acrylamide gel 전기 영동 또는 SDS 페이지에 의해 막 미끼 단백질과 co 정제 된 먹이 단백질을 분리하는 것입니다. 궁극적으로 면역 블로팅 및 질량 분석 분석을 사용하여 먹이 단백질을 식별하여 막 단백질 상호 작용을 분석할 수 있습니다.저는 Sabina Hunka이고 오늘 멤브레인 척추 기술을 보여드리겠습니다. co IP와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 친화도가 낮거나 일시적인 단백질 단백질 상호 작용도 검출할 수 있다는 것입니다. Kline Shaana가 절차를 시연합니다.그녀는 이 절차를 시작하기 위한 프로토콜을 개발한 박사 과정 학생 중 한 명으로, C 말단 연쇄상구균 태그 융합으로 멤브레인 미끼 단백질을 발현하는 박테리아 세포를 성장시키고 충분한 발현을 허용하기 위해 500밀리리터의 배지에 0.5밀리몰 IPTG를 첨가하여 초기 로그 단계에서 멤브레인 미끼 단백질의 발현을 유도합니다. 후기 로그 단계까지 박테리아를 배양합니다. 포름알데히드의 독성으로 인해 안전 흄 후드 아래에서 포름알데히드 가교를 수행할 준비를 합니다.배양 용기를 안전 흄 후드 아래로 옮깁니다. 각 샘플을 두 개의 샘플로 나누는데, 하나는 가교를 생략하고 다른 하나는 포름알데히드 가교를 포함합니다. 250 밀리리터 배양액에 37 % 포름 알데히드 용액 4 밀리리터를 첨가하여 0.6 %의 최종 농도에 도달합니다.배양 용기를 다시 옮기고 이전과 같이 20 분 더 세포를 성장시킵니다.그런 다음 안전 흄 후드 아래의 원심분리기 튜브에 배양물을 채웁니다. 30분 동안 3000회 G로 원심분리하여 세포를 수집합니다. 먼저 디캔팅으로 상층액을 제거하고 두 번째로 흡입으로 제거합니다.안전 흄 후드 아래의 피펫을 사용하여 상등액을 함유한 독성 포름알데히드를 처리하는 상등액을 적절하게 폐기합니다. 멤브레인 단백질 준비 중 최적의 수율에 도달하기 위해 먼저 Sphero plats를 준비하여 1.5ml 튜브에 0.1몰 E-D-T-A-P-H 8에 2mg의 라이소자임을 부드럽게 용해하기 시작합니다. 실험 당일에 새로 만들어야 하는 버퍼 P 2를 준비합니다.Resus는 프로테아제 억제제가 포함된 갓 준비된 트리스 수크로스 완충액 10ml에 세포 펠릿을 현탁시키고 용액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 1ml의 완충액 P 2를 넣고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 3000배 G에서 30분 동안 원심분리하여 Sphero plats를 수집하고 상층액을 버립니다.Sphero 플라스트 펠릿을 얼음 위에서 섭씨 영하 20도의 온도에서 밤새 조심스럽게 배양합니다. Resus는 Sphero Plast 입천장을 갓 준비한 완충액 6ml에 현탁시킵니다. P 3.얼음 위에서 1분 동안 연속으로 샘플을 4회 초음파 처리하고 각 버스트 사이에 1분 동안 일시 중지합니다. Sphero plast를 방해하기 위해 샘플을 10, 000회 G에서 10분 동안 원심분리하여 원심분리 후 세포 파편을 채취합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 초원심분리기 튜브로 옮깁니다.막 조각을 100, 000 시간 G 30 분 동안 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 녹이지 않고 20 밀리몰 트리스 완충액 pH 8로 조심스럽게 씻습니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않도록 종이 티슈로 튜브를 구동하십시오.멤브레인을 포함하는 펠릿을 재현탁시키려면 1ml의 트리스를 첨가하고 마이크로 마그네틱 로드를 완충하고 펠릿을 재현탁시키고, 부분적으로 얼음에서 1시간 동안 피펫으로 저어주고 20마이크로리터 분취액을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 멤브레인 분획 2.5 밀리리터를 트리스 버퍼 피펫으로 멤브레인 분획의 단백질 농도를 밀리리터당 5 밀리그램으로 정규화하고 멤브레인 단백질을 가용화하기 위해 20% Triton X 100 0.25 밀리리터를 첨가하여 최종 농도 2%에 도달합니다. 그런 다음 마이크로 마그네틱 로드를 넣고 얼음에서 1시간 동안 저어줍니다.1ml 스트렙 actin super flow gravity flow column을 8ml의 버퍼와 평형을 이룹니다. W.Remove는 100, 뛰기가 완료된 후에 불용해성 막 조각을 펠릿으로 만들기 위하여 30 분 동안 000 시간 G에 solubilization 표본 그리고 ultracentrifuge에서 마이크로 자석 막대를, 피펫을 사용하여 sate를 제거한다. 추가 정제를 위해 중력 흐름을 사용하여 상등액을 컬럼에 도포합니다.4ml의 버퍼 W로 컬럼을 세척합니다.이 세척 단계를 5회 반복합니다. 멤브레인 미끼 단백질을 1ml의 완충액 E로 용리시킵니다.이 용출을 반복합니다. 네 번 단계ample, 암시된 분수를 집중시킨다.2개, 3개, 4개에서 300마이크로리터까지 원심 필터 장치가 있습니다. 각 시료 200마이크로리터를 DS 페이지 로딩 염료로 5배 50마이크로리터와 혼합합니다. 끓이기 전에 각 준비를 125마이크로리터 분취액으로 나눕니다.포름알데히드 가교를 역시키기 위해 섭씨 95도에서 20분 동안 각 제제의 한 부분 표본. 벤치에서 샘플을 최소 10분 동안 실온으로 식힙니다. 각 샘플에서 30마이크로리터를 면역 블로팅에 적합한 폴리 아크릴아미드 겔의 단일 레인으로 탑로드합니다.최상의 방향을 위해 미리 염색된 분자량 마커를 사용하고 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달한 후 DS 페이지로 수행합니다. 1시간 동안 비특이적 라벨링을 방지하기 위해 멤브레인을 차단합니다. 실온에서 먹이 단백질 특이적 1차 항체를 희석하고 배양합니다.HRP 결합 항체를 2차 항체로 사용하고 고감도의 화학발광 검출 키트를 사용하여 면역 블롯을 개발합니다. 고전적인 필름 처리 절차 또는 디지털 이미징 장비를 사용하여 신호를 모니터링합니다. 먹이, 단백질 또는 알 수 없는 상호 작용에 사용할 수 있는 특정 항체가 없는 경우 파트너를 식별해야 합니다.식별을 위해 질량 분석기 또는 MS를 사용하십시오. MS 호환 염색 키트를 사용하여 SDS 페이지를 은으로 염색합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 유리 탱크에서 모든 염색 및 세척 단계를 수행하십시오.고분해능 LCMS로 미끼 단백질로 분석하기 전에 각 밴드를 절제합니다. VISIA coli의 일체형 막 단백질 CPXA를 사용했습니다. CPXA는 센서 키나아제(sensor kinase)이며 큰 여분의 세포질 센서 도메인과 C 말단이 고도로 보존된 세포질 촉매 도메인을 통합하는 두 개의 막관통 도메인이 있는 N 말단 센서 도메인으로 구성됩니다.자극 후 CPXA는 동족 반응 조절자를 활성화하고, CPXR 활성화 CPXR은 막 척추에 대한 반응을 중재하기 위해 확산됩니다. 연쇄상구균 태그는 CPX의 C 말단에 융합되었습니다. 막 척추 분석은 CPXA 연쇄상구균이 다른 단백질 또는 단백질 복합체와 교차 결합되어 있음을 보여주며, 이는 공개된 포름알데히드 처리 샘플의 도말로 표시됩니다.포름알데히드를 처리하지 않으면 이러한 얼룩이 없습니다. 또한, CPXA 연쇄상구균과 동족 반응 조절 단백질인 CPXR의 직접적인 단백질 상호 작용은 포름알데히드가 있는 경우에만 검출할 수 있습니다. 은 염색과 가교하는 포름알데히드의 특이성을 뒷받침합니다.끓인 샘플에 특이적인 띠가 분명합니다. 화살표는 MS에서 분석한 밴드를 표시합니다. 분석 및 CPXR을 CPXA의 상호 작용 파트너로 확인했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 질량 분석법에서 친화성 정제와 가교 친화성 정제를 결합하여 막 단백질의 상호 작용 파트너를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

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연구

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생명공학

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.

나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

배우세요 막 단백질의 생체 내 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 막 스파인 기술을 통해 생화학적 방법을 익히세요. 포름알데히드 가교결합, 친화성 정제 및 질량 분석을 활용하여 낮은 친화도나 일시적인 상호작용까지 검출할 수 있습니다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구 생체

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