Name: 효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 배우세요 TRPV4 이온 채널의 기계감수성을 연구하는 두 가지 방법을 효모 발광 측정법과 Xenopus 난자 전기생리학 기법을 사용하여. 이 방법은 신경과학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 우수한 기술 지원을 안드레아 Kremsreiter에게 감사의 말씀을 전합니다. 매디슨 - 우리 실험실에서 작업 NIH GM096088와 위스콘신 대학의 빌라스들에게 지원됩니다.

1. 효모 Luminometry 방법 사카로 마이 세스 세레 비시 애의 변형 BYYT를 사용합니다. 그것은 BY4741 (마타, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4)의 yvc1-tok1 파생입니다. Batiza 등. 26 Loukin 등. (24)에 설명 된대로, 레 선택할 수 애큐 오린 발현하는 플라스미드 pEVP1/Aeq와 우라 선택 쥐 TRPV4 발현하는 플라스미드 p416GPDV4으로 세포를 변형 플라스미드 건설 및 변환 (27)의 사용 표준 방법 . 효모 균주와 플라스미드의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. <ol><li> 하룻밤 1M 소르비톨 보충 레 우라 - &quot;DCD&quot;드롭 아웃 매체 (28) (CMD-레 우라 매체 (29)의 황산 고갈 변형)에서 30 ° C의 셰이커 후 로그 상에 효모 세포의 배양 2 ㎖ . luciferi 2 μM 보충 새로운 배지 1.8 ㎖에 이러한 문화의 200 μl를 접종N의 엘렌 테라. 진탕해야만 실온에서 24 시간 동안 어두운 곳에서 재배한다. </li><li> 문화의 삼투압 (아래) (일반적으로 1,400 mOsM) 및 다른 솔루션 증기 압력 osmometer를 사용하여 측정한다. </li><li> 나누어지는 20 단 하나 관 루미의 12mm 루미 튜브에 신선한 문화의 μL. </li><li> 근력 저하 충격 원하는 충격의 정도에 따라 25 mM의 NaEGTA (산도 7.2) 또는 이름 (산도 7.2)과 500-100 밀리미터의 NaCl (1,200-400 mOsM 총 삼투압)를 포함, 용액 200 μl를 추가합니다. 연속적 전에 발광을 모니터하고, 적어도 120 초 삼투 downshock 후에 만​​ 간단한 희석 조작에 의해 중단. 상대 발광 장치 (RUL)와 같은 데스크톱 컴퓨터에 루미 출력을 등록합니다. </li></ol> 하지 형질 전환 TRPV4의 연구이지만, 우리는 효모 균주의 많은 수의 응답을 검사하는 자동화 된 시스템에서 위의 프로토콜의 변형을 사용했다. 연구 오F 저자 30 마이크로 루미를 사용하여 효모 deletome (4,906 효모 단일 유전자 deletants의 컬렉션)의 삼투압 31 자극과 해당 소프트웨어를 분석 반응은 성공적이었다. 2. 3. 난자 전기 생리학 방법 전기 생리학은 기본적인 방법 32을 사용합니다. PCR은 야생형 또는 돌연변이 TRPV4 하이파이 PfuUtra 중합 효소를 사용하여 pGH19 33에 통합의 오픈 리딩 프레임을 증폭. 이것은는 Xenopus β-글로빈 유전자와 T7 RNA 중합 효소 프로모터 하류의 5 &#39;및 3&#39;의 UTRs 간 ORF의 정확한 삽입을 수반한다. 3 &#39;UTR의 하류 및 체외 T7 RNA 중합 효소 반응에서 주형으로 사용되는 구조를 선형화. 표준 분자 생물학적 기법 (34)를 사용합니다. X.에서 스테이지 V-VI의 난자를 사용 laevis의. 축산 부분 ovariecto내, defolliculation 및 난황 봉투 제거는 표준 절차에게 32,33,35를 따릅니다. 드럼 몬드 Nanoinject II 자동 microinjector를 사용하여 난자 당 cRNA를 솔루션의 2-40 NG를 주입한다. ~ 각 실험 세트 (30) 난 모세포를 주입한다. TRPV4 - cRNA를 주입 한 후, 겐타 마이신 (100 ㎍ / ㎖)으로 ND96 매체에서 난 모세포를 배양하고 1 μM 루테늄 (14) 빨강. 2. 두 개의 전극 전압 클램프 <ol><li> 개별적으로 피펫 풀러 정밀 일회용 100 μL의 마이크로 피펫에서 붕규산 유리 기록 피펫을 잡아 당깁니다. </li><li> 전압 측정 및 전류 주입 피펫 전극을 모두 당기은 ~ 1 μm의 직경의 팁 구멍을 가지고 당겨진다. </li><li> 2 M KCl을 가진 백필 전극 0.1-0.2 밀리 옴 저항의 결과. 함께 VG-2Ax100 가상 접지 목욕 클램프, Digidata 1440 디지타이저를 통해 GeneClamp 500 앰프 인터페이스에 연결되어 HS2A의 headstages, 그들을 설치합니다. 획득<html> pClamp10 소프트웨어를 사용하여 데이터. </li><li> 20 배 배율의 해부 현미경의 무대에 장착 된 제작 된 플라스틱 실에서 1 ㎖ 화장실에서 테스트 할 수있는 난자를 놓습니다. 목욕 솔루션은 가상 접지 3 M의 KCl 한천 다리와 가까운 난자에 배치 VG-2A 가상 접지 단에 연결 염소화 실버 와이어입니다. </li><li> 솔루션의 입구와 출구로 플라스틱 호스 연속 관류 챔버를 구축합니다. 입구 튜브가 여섯 50 ㎖ 주사기 껍질 다른 용액으로 채워져 각각의 매니 폴드이다 제조 된 관류 시스템에 연결되어 연결한다. 특정 솔루션의 중력 공급 속도는 제어에 ~ ~ 3 호스의 &quot;켁&quot;램프 클램프를 사용 ㎖ / 분. </li><li> 미세 조작기에 자신의 headstages에 두 전극을 장착합니다. 미세 조작에 의해 난자의 전극 침투를 수행합니다. </li></ol> 3. 직접 Mechanosensitivity의 패치 클램프 검사 &quot;&gt; 피펫 준비, GΩ 인감 형성하고, 온 - 셀 또는 절제 모드의 형성 등의 패치 클램프의 기본 방법은 해밀의 그 외. (36)는 Conn 32입니다. <ol><li> 98 밀리미터의 KCl, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 K +-HEPES, pH를 7.2로 끝 ~ 1 μm의 직경의 구멍 (거품 번호 5-6)으로 붕규산 유리 피펫을 입력합니다. </li><li> 또한, 압력계, 5 ML의 주사기에 플라스틱 튜브를 통해 T-조인트를 통해 패치 클램프 피펫을 연결합니다. 전극과 압력계 출력 모두를 처리하기 위해 컴퓨터를 사용합니다. 10 kHz에서 데이터를 수집하고 분석을 위해 1 kHz에서 여덟 폴 베셀 필터를 통해 재생할 수 있습니다. </li><li> 다른 패치는 반복적으로 동일한 난자에서 절제 할 수 있습니다. 이 연습은 TRPV4의 분자 활동의 시험이 더 효율적이고 신뢰할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

서론에서 언급 한 바와 같이, 일반적으로 TRPV4 기능을 연구하는 데 사용되는 방법은 때때로 모순과 논쟁의 결과. 여기에 설명 된 방법 중 두 세트의 몇 가지 장점을 제공하며, 기존의 방법을 보완 할 수있다. 우리가 TRPV4 만의 연구를 설명하는 동안, 방법은 다른 이온 채널을 연구하기 위해 확장 될 수있다. 1. 효모 Luminometry 방법 신진 효모 지질 조성물 (30)에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 증감되는 저자 삼투 충격에 네이티브 칼슘 2 + - 유입 응답이 있습니다. 이 신호는 외부 EGTA로 지울 수 있습니다. 이 킬레이트 제는, 그러나, 채널이 내부 막으로 표현되었는지를 나타내는, 발현 된 TRPV4 (24)로부터 신호를 소거하지 않고, 가장 가능성 CA가 2 +는 삼투압에 세포질로 방출되는 소포체의 그것 충격. 발현 된의 교통...

TRPS (일시적 수용체 전위) 감각 기능 1,2를 제공 양이온 채널의 일곱 아과을 포함한다. 포유 동물, TRPV에서 TRPS의 바닐 로이드 아과는 6 종류가 있습니다. TRPV4 (유형 4) 가열 3,4에 응답, 특정 화학 물질, 삼투압 부종, 또는 전단 응력. TRPV4 유전자 반복 후보 유전자 및 / 또는 5-8 클로닝 식에 의해 단리 하였다. 후자의 방법은 저자 삼투압에 유전자 산물의 응답을 하였다. TRPV4 많은 상이한 세포 유형 3,4의 개발, 생리학, 병리 또는 거의 모든 기관 및 함수로 표현된다. 눈에 띄는 말초 신경 병증 및 / 또는 골격 이형성증 (골격 발달에 이상) 9-11을 일으키는 원인이되는&gt; 50 인간의 염색체 우성 TRPV4 돌연변이입니다. 골격 이형성증의 범위는 가벼운 brachyomia 유형 3 (유형 3 왜소증), spondylometaphyseal 발육 코즐로 스키 형, 세 베리까지이형성증 다시, 일부는 신생아 또는 배아의 죽음을 초래. 메커니즘의 모든 방식이 가능한 것 같다 있지만, 아무도 다양성, 복잡성, 다양성, 이러한 질병 4 가끔 중복 설명하지 않습니다. 다른 TRP 채널 1과 마찬가지로, TRPV4는 사량입니다. 쥐 또는 인간의 TRPV4, 각각의 서브 유닛은 871 잔기로 구성되어있다. 그 중심 요소는 여섯 횡단 가능성 전압 문 K + 채널과 유사한 방식으로 배치되어 나선 (S1-S6)이다. 거기에, S4에 S1은 주변 영역을 형성하고, S5 및 S6은 투과 기공 도메인을 형성한다. S5와 S6 사이의 TRPV4 아마도 양이온 필터를 형성하도록 수렴 중 네 시퀀스 LDLFKLTIGMGDL,이어서 짧은 기공 나선이다. 470 - 잔류 N-말단 세포질 세그먼트는 단백질이나 작은 리간드를 결합하는 것으로 알려져 6 ankyrin 반복이 포함되어 있습니다. C-말단 152-잔류 세포질 부분은 구약 바인딩 가능한 다른 사이트들 사이에 칼 모듈 린 결합 순서를 포함그녀의 요소 3. TRPV4 본질적 음이온 일을 제외 양이온 채널이다. 생리 학적 기능은 칼슘 2 + 유입 자극을 형질 도입하는 것이지만, 그것은 P 캘리포니아에서 이가 호의를, 또한 아이젠만 IV 투과성 순서와 다른 양이온을 투과 : P 나 7 ~ 12. 단일 채널 컨덕턴스 ~ 90 피코 초 외부와 ~ 40 피코 초 안쪽 6,13,14에 정류한다. 발현 된 (아래) 현재는 저자 삼투 부종, 전단 응력, 또는 온기 (15)에 의해 활성화 될 수 있습니다. 또한 고도 불포화 지방산 (16, 17) 및 합성 phorbal 에스테르 18 4αPDD에 의해 활성화된다. 현재, 모두가 높은 처리량, 작은 분자 화면에 의해 발견, 10-9 10-8 M (20)의 효과가 가장 강력한 효능은 GSK1016790A 19과 길항제 GSK2193874입니다. TRPV4 연구의 두 가지 핵심 영역은 혼란 남아(1) TRPV4 크게는 mechanosensitivity 공부하더라도으로, 분자 기초는 논쟁의 여지가있다. 한 모델은, 저자 삼투압 어떻게 든 epoxygenase에 의해 산 (EET)를 epoxyeicosatrienoic로 변환되는 고도 불포화 지방산 (PUFA) 아라키돈 산 (AA)을 생산하는 포스 포 리파아제 A2 (PLA2)를 활성화하고 EET의 결합이 TRPV4 16를 활성화 설명 17. 그러나, TRPV4 자체가 직접 간단한 설명을 제공하는 멤브레인 스트레칭 14 (아래)에 대응하기 위해 표시되었습니다. (2) TRPV4 돌연변이 병리 어지러 울 수 있습니다. 기초에, 하나는 질병 손실, 감소 또는 채널 활동의 증가에 기인하는지 여부를 알 필요가있다. 여기에서도, 문학은 명확하지입니다. 여러 골격-이형성증의 대립 유전자는 높은 활성을 가지고보고있는 동안, (이득의 기능, GOF) 4,21은 여러 가지가 활동 (기능 상실, LOF) 10,22을 감소하는 것으로보고되었다. 14 대립 유전자의 체계적인 연구에 발견모든 GOF 수 변이 (아래) 23. TRPV4 기능의 전체 손실에도 불구하고 사소한 결함이 가능한 또는 비옥 녹아웃 마우스,,, - 일부는 LOI들입니다 주장은 trpV4 - /의 표현형을 부정하는 것 같습니다. 이러한 논쟁의 일부는 방법 론적 기원을 가지고 있습니다. 연구소는 다른 방법, 또는 방법의 변형을 사용하고, 다른 심사 기준을 사용한다. 가장 일반적으로, TRPV4는 일시적으로 (HEK, CHO, 헬라) 및 작용제 또는 저장성 자극에 따라 내부 [칼슘 2 +]의 증가는 칼슘 2 +에 민감한 형광 염료의 Fura-2에 등록되어 배양 된 포유 동물 세포에서 발현된다. 이 형광 분석에 과다 의존은 1 비판을 받아왔다. 다른 집단에서 발현 수준은 그 내부에 분포뿐만 아니라 효과적인 염료 농도가 제어되고 기록되어야 할 필요가있다. 보다 안정적인는 직접 전기 생리학 검사입니다. 심지어이 같은 commonly는 연습, 문제없이도 없습니다. 개별 배양 세포에서 발현 수준은 제어가 곤란하기 때문에, 전체 - 셀 전류가 큰 변동이있다. 전류가 작기 때문에 또한, 신뢰할 수있는 통계는 종종 실용적이지 큰 샘플 크기에 의존해야합니다. 패치 클램프 검사는 거의 수행되지 않았습니다. 일부 이러한 기록은 16, 17 통계적 평가는 도전하게 활동 버스트의 클러스터를 보여줍니다. 더 나은 분자 mechanosensitivity을 이해하기 위해, 우리는 TRPV4을 검사하는 두 개의 추가 시스템을 개발했습니다. (1) 거리의 보통 포유류의 파트너 TRPV4를 분리하기 위해, 우리는 효모 (24) 신진에 쥐 TRPV4을 표명했다. 이 진화 적으로 먼 상황에서 TRPV4의 기능적 발현은 여전히 평소 파트너없이 침투 힘에 응답 할 수 있음을 보여 주었다. 효모는 AA 또는 EET으로 더 된 PUFA를하지 않으며, 게놈이 간편 체크인을 더 PLA2 또는 epoxygenase 유전자가 없기 때문에(투약) 소지도 TRPV4는 힘을 감지하기 위해 그들이 필요하지 않습니다 것을 보여줍니다. 분자 생물학적으로 가장 의무가 진핵 생물에서 TRPV4를 갖는 것은 또한 효율적인 앞으로 또는 역방향 유전자 조작 25 수 있습니다. (2) TRPV4의 깊이있는 생물 물리학 적 분석을 위해, 우리는 Xenopus의 난자에 TRPV4을 표명했다. nA의 (10 -10 10 -9 A)의 전류로 서브 - 나를 얻을 배양 된 세포와 달리 난자 μA의 (10-6 10-4)의 전류를 표현한다. 소음에 훨씬 더 큰 신호가 더 나은 정량화하고 자신감 비교를 할 수 있습니다. TRPV4, 그래서 표현도 패치 클램프를 사용하여 개별 분자로 검사 할 수 있습니다. 하나의 난자가 다시 정량보다 안정적 만들기, 반복 패치 샘플링을 할 수 있습니다. 이러한 연구는 TRPV4 채널 자체가 직접 막 스트레치 힘 (14)에 의해 활성화 될 수있는 것으로 나타났다. 분석은 14 대표 골격-발육 대립 유전자는 모든 기능 획득 돌연변이 있다는 것을 보여 주었다. 또한, degr이 제정 칼슘 2 + 누설의 EE는 골격 질환 (23)의 심각도를 평행. 때문에 그들의 참신 및 유용성,이 두 가지 방법의 상세한 절차는 TRPV4 또는 유사한 채널에서 미래의 연구에 복제 할 수 있도록 여기에 조립된다.

<table><tbody><tr><td>증기압 오즈모미터</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>Logan, UT, USA</td></tr><tr><td>Sirius 단일 튜브 발광계&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td>Sirius</td><td>헌츠빌, LA, 미국</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 광도계</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>헌츠빌, LA, 미국</td></tr> 발<tr><td>광계 소프트웨어</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>헌츠빌, LA, 미국</td></tr><tr><td>패치 클램프 및 소프트웨어</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A 헤드스테이지, VG-2Ax100 가상 접지 수조 클램프, GeneClamp 500 증폭기, digidata 1440 디지타이저, pClamp10 소프트웨어</td><td>미국 캘리포니아주 유니온 시티</td></tr> 압력<tr><td>계</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, 버몬트, 미국</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>모델 P-97</td><td>Novata, CA, USA</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>Luciferin coelenterazine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소 반응</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>미국 텍사스주 오스틴</td></tr> 겐<tr><td>타마이신</td><td>시그마</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>루테늄 레드&nbsp;</td><td>시그마</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로피펫&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>100 마이크로리터 마이크로피펫</td><td>Broomall, PA, USA</td></tr><tr><td>고화질 PfuUtra 중합효소&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, 캘리포니아, 미국</td></tr></tbody></table>

효모 luminometric 및 xenopus의 난자 전기 생리 시험

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (과도 수용체 잠재력, 바닐 로이드 가족, 유형 4) 널리 척추 동물의 조직에서 발현되고, 기계적인 힘에 의해 등 여러 가지 자극에 의​​해 활성화된다. 특정 TRPV4 돌연변이는 인간의 복잡한 유전 뼈 또는 신경 병리의 원인이됩니다. 야생 형 또는 돌연변이 TRPV4 도입 유전자는 일반적으로 배양 된 포유 동물 세포에서 발현과의 Fura-2 형광 측정에 의해 전극에 의해 검사된다. mechanosensitivity 및 질병의 분자 염기의 메커니즘의 측면에서, 현재 문헌들은 혼란과 논란이있다. 기존의 방법을 보완하기 위해, 우리는 TRPV4의 분자 특성을 검사하는 두 가지 추가 방법을 설명합니다. (1) 쥐 TRPV4 및 애큐 오린의 유전자는 신진 효모로 변환된다. 형질 전환 체 인구의 저자 osmtic 충격 TRPV4 채널을 통해 발표로 인해 칼슘 2 +와 애큐 오린의 조합에 luminometric 신호를 얻을 수 있습니다. 여기 TRPV4는 평소 포유류의 파트너 단백질로부터 분리자체 mechanosensitivity을 보여준다. (2) TRPV4의 된 cRNA는 Xenopus의 난자에 주입된다. 배양의 적당한 기간 후에 거시적 TRPV4 전류는 두 전극 전압 클램프로 검사된다. 난자 화장실에서 불활성 농도의 삼투압의 제거시 현재의 상승은 mechanosensitivity 나타낸다. 난자에서 마이크로 암페어 (10-6 10-4) 전류는 명확 quantifications과 자신감 평가를 항복, 배양 된 세포에서 nanoAmpere subnano 대 (10 -10 -9 10) 전류보다 훨씬 크다. 개별 채널 단백질의 활동을 반영 미세한 전류가 직접 온 셀 또는 절제 모드에서, 패치 클램프에 따라 등록 될 수있다. 같은 난자는 더 나은 데이터 복제를 허용, 여러 패치 샘플을 제공합니다. 패치에 적용 흡입구 직접 mechanosensitivity을 평가하기 위해 TRPV4을 활성화 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 TRP 채널의 다른 유형의 연구에 유용 할 것이다.

일반적인 luminometry 실험에서, 400-1,200 mOsM 다운 저장성 충격의 범위는 1,400 mOsM의 문화를 20 ㎕로 다른 낮은 삼투압의 충격 솔루션 200 μl를 추가하여 달성된다. 효모 세포 비어 p416GPDV4 플라스미드 또는 이온 필터에서 돌연변이 (도 1) (24)와 TRPV4 유전자를 포함하는 하나의 형질 전환 : 실험의 RLU는이 음성 대조군에 비해 때 TRPV4 활성은 분명하다. 일반적인 2 전극 전압 클램프 실험에서 난자가 처음 (mm 단위)를 포함 흐르는 등장 목욕 솔루션에 목욕을 66 KMeSO 4, 1.8 바 (메조 4) 2, 5 K +-HEPES (pH를 7.2)와 100 소르비톨. 피크 전류는 -20 MV 매 10 초 보유 전위로부터 +20 MV 100 밀리 테스트 펄스의 끝에서 평가된다. 저장성 반응을 이끌어...

TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.

효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

다음 실험의 전반적인 목표는 트립 V 4 이온 채널의 메카노 감도를 검사하는 것입니다. 이는 트립 V 4 유전자로 효모 세포를 형질전환하고 광도계를 사용하여 이물질을 형질전환 통해 가설적으로 유도된 칼슘 유입을 검사함으로써 달성할 수 있습니다. 이것은 또한 전기 생리학적 접근 방식으로 검사할 수 있습니다.Trip V four CRNA가 먼저 생성되어 배양 후 xenopus cyte에 주입됩니다. Cytes는 hypotonic challenge에 대한 두 개의 전극 전압 클램프에 의해 검사됩니다. 단일 채널 수준에서 메카노 민감도를 검사하기 위해 세포에서 절제된 멤브레인 패치에 흡입을 적용합니다.저는 진공 교수입니다. 이전에는 TRIP B 4 이온 채널의 활동이 여기에서 개발 된 형광 신화에 의해 URA에 의해 크게 보여졌으며 trip B 4 개의 기계적 감도를 조사하기위한 강력하고 정량적 인 대안을 제공했습니다. 우리가 lum lum을 사용한 첫 번째 방법은 형질전환 아쿠아를 통해 발아 효모에서 Trip V four의 기계적 민감도를 조사하는 것입니다.전기생리학적 접근을 통한 두 번째 방법에서는 Trip V four의 특성을 XUS Cytes에서 tribute V four CRNA의 적절한 발현을 조사합니다. vilin 막의 제거 및 gig 자체 밀봉 형성과 같은 cyte 전기 생리학의 기본 방법은 이미 2008 년 바로 이 저널에 Brown과 동료의 연구에서 입증되었습니다. 제 동료인 Jin Fcon 박사입니다.그녀는 T lum 형상의 사용과 주입 피펫 제작, 피펫에 CRNA 용액을 채우고 솔루션을 이전 현장에 주입하는 방법을 시연할 것입니다. 또한, 그녀는 세포와 절제 인사이드 아웃 모드에서 패치 조개 녹음을 시연할 것입니다. 그녀는 또한 O 부위 막에 고유한 메카노 민감 채널의 활성화와 이종성의 활성화로 인한 결과를 보여줄 것입니다.Lay 표현 TV 4 하룻밤 사이에 2 밀리리터의 효모 세포를 배양하여 DCD Lu Yura 드롭 아웃 배지에서 로그 단계를 게시하고 섭씨 30 도의 셰이커에서 1 개의 어금니 소르비톨을 보충하여이 절차를 시작하십시오. 다음날 200 마이크로 리터의 배양액을 1, 800 마이크로 리터의 신선한 배지에 접종하고 2 마이크로 몰 루시퍼를 보충합니다. 그런 다음 리신은 희석 직전에 흔들리지 않고 실온에서 24시간 동안 어둠 속에서 자랍니다.증기압 OSM ter를 사용하여 1몰 소르비톨 농축 배양물과 염화나트륨의 삼투압을 측정합니다. 다음으로 20마이크로리터의 신선한 배양물을 12mm 광도계 튜브로 나누어 단일 튜브 광도계를 만듭니다. 저장성 충격의 경우, pH 7.2에서 25 밀리몰 나트륨 EGTA 또는 pH 7.2에서 나트륨 MES 및 500에서 100 밀리몰 염화나트륨을 포함하는 용액 200 마이크로 리터를 1, 400 밀리 오즈모에서 배양 20 마이크로 리터에 지속적으로 모니터링 삼투압 다운 쇼크 전에 발광을 모니터링하고, 짧은 희석 작업에 의해서만 중단 된 삼투 다운 쇼크 후 최소 120 초 후에 상대 발광 단위로 컴퓨터의 광도계 출력을 등록합니다.이 절차에서는 피펫 풀러로 마이크로 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫은 해부 현미경 아래에 긴 생크가 있어야 합니다. 당겨진 마이크로 피펫의 생크를 적절한 지점에서 조심스럽게 꼬집어 구멍을 만듭니다.마이크로 피펫 입구는 CRNA 용액의 주입 및 배출을 용이하게 하기 위해 직경이 약 30마이크로미터여야 합니다. 다음은 마이크로 인젝터와 피펫 홀더입니다. 이것은 흡수 및 배출 기능이 명확하게 표시된 제어 장치입니다.홀더에 장착된 미네랄 오일을 피펫에 다시 채운 후 CRNA 용액 한 방울로 내립니다. 그 후 마이크로 인젝터로 피펫을 자동으로 채우고 해부 현미경 아래에서 난모세포를 선택합니다. 그런 다음 채워진 마이크로 피펫을 내려 난모세포를 관통합니다.마이크로 피펫을 삽입한 후 CRNA 주입을 시작합니다. 약 30개의 cyte를 주입한 후 루테늄 레드와 겐타마이신을 함유한 ND 96 배지로 옮깁니다. 다음으로, 끝에 ND 96 매체가 들어 있는 96 웰 플레이트로 개별적으로 옮깁니다.며칠 동안 인큐베이터에 넣어 트립 V 4개 채널이 발현될 수 있도록 합니다. 트립 V 4의 메커니즘 민감도를 조사하기 위해 두 가지 전기 생리학적 방법이 사용됩니다. 첫 번째 방법은 두 개의 전극 전압 클램프이며 이것이 이 단계의 설정입니다.피펫을 당겨 100마이크로리터 볼릭 유리잔에서 전압 측정 및 전류 주입을 위한 기록 피펫을 당깁니다. 피펫 전극은 직경이 약 1미크론인 팁 조리개를 가져야 합니다. 다음으로, 전극을 두 개의 염화몰 칼륨으로 다시 채우면 0.1에서 0.2 메가 저항이 발생합니다.HS 2 헤드 스테이지에 장착하십시오. 이 두 가지는 전압 제어 전극과 전류 주입 전극을 고정하는 마이크로 매니퓰레이터로, VG 2 x 100 가상 접지 배스 클램프와 함께 숫자 1440 디지타이저를 통해 유전자 클램프 500 증폭기 인터페이스에 연결됩니다. 그리고 데이터는 P 클램프 10 소프트웨어를 사용하여 획득됩니다.도립 현미경의 무대에는 기록을 수행하는 기록 챔버가 있으며, 챔버에 xenopus cyte를 배치하고 마이크로 조작을 통해 두 개의 전극을 삽입합니다. 기록실에서 cyte를 목욕시키는 용액은 중력을 통해 연속적으로 흐릅니다. 챔버로의 주입구는 주사기 쉘 뱅크로 제작 된 매니 폴드로 튜브를 통해 연결됩니다.각 쉘은 다른 솔루션으로 채워져 있습니다. 수조의 내용은 튜브의 다른 클램프를 닫거나 열어 변경됩니다. 높은 삼투압에서 낮은 삼투압으로 수조를 변경하면 한 가지 형태의 기계적 자극이 전달됩니다.이제 뽑은 유리 피펫에 내부 용액을 채웁니다. 패치 클램프의 설정은 vol의 설정과 유사합니다.tage 클램프는 전극이 헤드 스테이지에 장착된 다음 마이크로 매니퓰레이터에 고정됩니다. 패치 클램프 피펫을 5ml 주사기와 압력계에 부착합니다.패치 클램프 전극은 난모세포 표면에 조작됩니다. Vitale 멤브레인을 제거한 후 지속적인 흡입을 가하여 패치를 피펫 팁에 부착하면 테스트 전류 펄스에 대한 전기 저항이 증가합니다. 저항이 giga seal의 성공적인 형성을 나타낼 만큼 충분히 크면 패치가 있는 전극을 난모세포에서 빼내어 절제된 인사이드 아웃 기록 모드를 설정합니다.그런 다음 절제된 패치에 흡입 펄스를 적용합니다. 이종난모세포에 고유한 40피코 지멘스 메카노 민감 채널이 있습니다. 이 그림은 흡입 펄스가 막에 가해질 때 이러한 채널의 활성화를 보여주며, 난모세포에서 절제된 패치가 트립 V 4를 성공적으로 발현합니다.트립 V 4의 90 피코 지멘스 유니터리 컨덕턴스의 활성화도 비슷한 방식으로 관찰 할 수 있습니다. 여기에 보이는 것은 효모에서 발현되는 쥐 여행 V 4 호근성 쇼크에 반응하는 것입니다. 750 밀리오스몰 저장성 충격은 트립 V 4 T 성능에서 큰 발광 증가를 유발하지만, 이온 필터에 돌연변이가 있는 트립 V 4를 함유한 빈 플라스미드 또는 플라스미드의 T 성능에서는 발광 증가를 유발하지 않습니다.다음은 저장성 쇼크와 최대 반응 사이의 용량 반응 관계입니다. 저장성 자극에 대한 전체 난모세포 거시적 전류 반응을 2전극 전압 클램프로 검사했습니다. 매우 높은 수준의 야생형 트립 V를 발현하는 난모세포의 피크 전류는 250 밀리 오스모 수용액에서 100 밀리몰 소르비톨을 제거하고 3 마이크로 몰 루테늄 레드를 첨가하는 것에 대한 응답으로 100 밀리 초 전압 단계로 4 번 증가합니다.반복되는 피크 전류는 저장성 자극에 따라 증가하고 등장성 용액으로 돌아가거나 채널 차단제가 추가되면 감소합니다. 이 그림은 패치 클램프 아래에서 볼 수 있는 멤브레인 스트레치에 의한 야생형 트립 V 4의 직접적인 활성화를 보여주며, 트립 V 4에서 절제된 패치에서 절제된 난모세포를 발현하는 난모세포에서 평균 품질의 미량 샘플은 양의 50볼트에서 유지되는 절제된 내부 패치에 60mm의 수은 흡입에 의해 활성화됨을 보여줍니다. 맨 위 추적은 닫힌 수준과 열린 수준 사이의 유니터리 전류 전환을 표시하기 위해 더 빠른 시간 기반으로 표시됩니다.이 비디오 테이프는 효모 발광, 기하학 및 O 부위 전기 생리학적 방법을 triv 4 채널의 기계적 감도 연구에 적용할 수 있는 방법에 대한 보다 구체적인 이해를 제공할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

절개 바셀린 갭 접근 방식은 빠른 채널 반응 속도의 높은 해상도와 Xenopus의 난자에서 발현 전압 - 의존성 이온 채널에서 이온 및 게이팅 전류의 낮은 잡음 녹음을 얻는 데 사용됩니다. 사소한 변형에, 전압 클램프 형광 측정은 절개 난자 프로토콜에 연결될 수있다.

<em&gt; Xenopus의</em형광 측정으로&gt; 난자 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술

유전적으로 암호화된 전압 지표를 사용하여 막 전위의 변화를 이미징하는 방법에 대해 설명합니다.

유전자 인코딩 된 형광 전압 센서의 두 가지 유형의 잠재적 이미징 막

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

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여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

전기생리학은 이온 채널 활성을 조사하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 광학적 방법을 포함하여 많은 대체 접근 방식이 있습니다. 여기에서는 FRET(inter-subunit Förster 공명 에너지 전달) 기반 방법을 사용하여 8채널(LRRC8) 형성된 음이온 채널을 포함하는 류신이 풍부한 반복의 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

체외에서 흥분성 세포의 반응을 연구하기 위해 이 프로토콜은 유전적으로 조작된 tet-on 스파이킹 HEK 세포의 간단한 흥분성 세포 모델에 대한 전기천공으로 인한 활동 전위 생성의 변화와 관련 매개변수의 자동 추출을 통한 막관통 전압의 변화에 대한 광학 모니터링을 설명합니다.

유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

배우세요 TRPV4 이온 채널의 기계감수성을 연구하는 두 가지 방법을 효모 발광 측정법과 Xenopus 난자 전기생리학 기법을 사용하여. 이 방법은 신경과학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험

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