Name: 단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 학습하세요 생체 내 단일 미토콘드리아 과산화물 점멸 및 막전위 변화를 공촛점 현미경으로 실시간 이미징하는 방법을. 마우스 후지 근육과 관류 심장에서 생리학적 및 병리학적 조건에서 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있습니다.

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저자는 박사 부부에게 감사의 말씀을 전합니다. 화평 쳉, 그들의 도움의 의견과이 방법을 개발하는 기술 지원 Huiliang 장과 스티븐 Kolwicz. 이 연구는 NIH 보조금 및 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서 WW의 과학자 개발 그랜트에 의해 지원되었다.

1. 실험 준비 <ol><li> 140 밀리미터의 NaCl, 5 밀리미터의 KCl, 2.5 mM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를 10 mM의 HEPES 생체 골격 근육 이미징 (산도 7.2)이 포함 된 등장 균형 염 용액 (50 ㎖)을 준비합니다. </li><li> 118 밀리미터의 NaCl, 5.3 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 망초, 0.5 mM의 EDTA, 25 mM의 탄산 수소 나트륨을 : 포함 크렙스 - Henseleit 버퍼 (KHB)의 1 L를 준비합니다. </li><li> 버블 함유 가스 95 % O 2 / 5 더 이전에 2 ㎜ 염화칼슘을 추가로 10 ~ 15 분 %의 CO 2 KHB. 신진 대사 기판 (예를 들어, 10 mM의 포도당과 0.5 mM의 피루 베이트)를 추가합니다. </li><li> 70 % 에탄올에 클램프, 가위 및 집게를 살균하고 소독 DDH 2 O.에서 세척하여 수술 도구를 준비합니다 </li><li> 심장 관류 시스템을 켜고 물을 욕조 및 순환 장치의 온도를 조정, 6 ㎖ / 분으로 연동 펌프의 속도를 설정합니다. </li><li> 95 % O 2와 버블 KHB/ 5 % CO 2 가스, 폐수의 유량 (광섬유 온도 프로브에 의하여 37 ° C)의 온도를 모니터링한다. 이 시스템은 가스 온도 평형에 대해 20 분을 필요로한다. </li></ol> 2. 생체 내에서 골격 근육의 공 촛점 이미징 <ol><li> 펜토 바르 비탈 (80​​ ㎎ / kg, IP)으로 마우스를 마취. 동물은 10 ~ 15 분 이내에 수술 마취 (발가락 핀치에 대한 응답)에 도달과 골격 근육의 생체 내 이미징을위한 충분한 ~ 1.5 시간,이 상태로 유지됩니다. </li><li> 뒷다리 중 하나에 머리카락을 제거하고 70 % 에탄올로 피부를 소독. </li><li> 비복근 근육을 노출 사지의 외측을 따라 피부에 절개를합니다. </li><li> 날카로운 집게로 조심스럽게 epimysium를 들고 가위로를 통해 절개를합니다. 또한 epimysium를 제거하고 그 아래에 근육 섬유를 노출 해부. </li><li> 골격에 TMRM의 생체 로딩근육은 30 분 동안 근육을​​ 몰두하고 표시가없는 솔루션에 의해 세척 등장 균형 염 용액에 TMRM (500 nm의) 등이 있습니다. </li><li> 공 초점 현미경 (자이스 혈구 LSM 510) 무대에서 옆에 마우스를두고 노출 된 골격 근육은 챔버의 바닥을 형성하는 커버 슬립에 직면 위치에 뒤쪽 다리를 억제합니다. 커버 슬립은 근육 조직과 반전 목적 (40X 오일) 사이에있다. </li><li> 조직과 커버 슬립 간의 긴밀한 접촉을 부드럽게 아래로 다리를 누릅니다. 등장 균형 염 용액에 노출 된 근육을 담근다. </li><li> 프레임 당 1 초의 샘플링 속도에서 기록이 차원 (2D, XY) 공 촛점 이미지. 각 픽셀의 강도는 8 비트 깊이로 디지털화된다. 일반적으로, 연속 검사는 100 프레임이 포함되어 있습니다. </li><li> &gt; 505 nm에서 처음으로 405 nm에서 흥분과 수집하여 순차 이미지를 수집 한 후 488 nm에서 이중 파장 excitatio에&gt; 505 nm에서 수집하는 동안MT-cpYFP의 N 영상. MT-cpYFP과 TMRM의 트리플 파장 여기 영상에 대해 각각 405, 488 및 543 nm에서 순차적 여기를 사용하여, 505-545에서 505-545을 배출를 수집하고,&gt; 560 nm의. </li></ol> 3. 관류 마우스 심장의 공 촛점 이미징 <ol><li> 즉시 골격근의 생체 촬상 후에, 헤파린 (IP)의 200 단위로 마우스를 주입. 십 분, 개흉술로 마우스를 안락사 빠르게에 연결된 폐, 흉선과 마음을 제거합니다. </li><li> 빨리 얼음처럼 차가운 버퍼에 폐를 제거합니다. 흉선의 엽 (叶)을 식별하고 부드럽게 상행 대동맥을 노출 다시 껍질. </li><li> 흉선을 제거하고주의 깊게 주변 조직을 제거하여 대동맥을 격리 할 것. </li><li> 대동맥의 첫 번째 분기 전에 상행 대동맥의 상단에 상처를 확인합니다. </li><li> 루멘을 노출하는 두 개의 마이크로 봉합 핀셋으로 조심스럽게 대동맥의 벽을 잡고 조심 캘리포니아에 대동맥을 배치nnula (PE50 튜브). 봉합이 빠르게 대동맥 주위에 연결되어있는 동안 대동맥은 마이크로 혈관 클램프와 장소에서 개최됩니다. </li><li> 정맥의 끝이 대동맥 루트를 확인하기 위해 집게와 캐 뉼러를주의 깊게 검사, 클램프를 제거합니다. 추가 관계는 장소에 마음을 잡고 필요에 따라 추가됩니다. </li><li> 연동 펌프의 전원을 켜고 / 분 1 ㎖에 마음을 perfuse. 심장 관류에 치고 다시 시작됩니다. </li><li> 관류 시스템의 위치를​​ 조정하고 현미경 무대에 마음을 넣어. 무대는 마음을 보유 챔버의 가열 수있는 어댑터가 있습니다. </li><li> 부분적으로 마음을 잠수함 챔버에 KHB 관류 용액 1 ㎖를 추가합니다. 37 ° C에서 챔버의 온도를 모니터링 연동 펌프를 사용하여 챔버로부터 유출 물을 제거한다. </li><li> 서서히 심장에 충분한 흐름을 (약 2 ml / 분)를 제공하는 연동 펌프의 속도를 높입니다. </li><li> 안정화의 10 분 후, 혜를 perfuse10 μM의 blebbistatin 및 100 ~ 500 nm의 TMRM과 RT. 심장 박동이 10 분 후에 속도가 느려집니다. </li><li> 챔버의 바닥에 커버 슬립과 마음의 밀착을 보장하기 위해 추가로 심장 박동을 억제하기 위해 심장에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 위의 단계 2.8에 설명 된대로 그대로 심근의 공 촛점 이미징에 대해 동일한 절차를 수행합니다. 가능한 한주의 깊게 깨끗한 이미지를 나타 내기 위해 초점 평면을 조정합니다. </li></ol> 4. 이미지 처리 및 데이터 분석 <ol><li> 하나의 미토콘드리아가 깜박이고 막 잠재적 인 변화를 분석 할 수있는 공 초점 소프트웨어의 &quot;생리 학적 분석&quot;모듈에서 제공하는 도구를 사용합니다. 이 모듈은 종종 공 초점 시스템의 화상 획득 소프트웨어에 포함 된 이미지의 특정 영역의 판정뿐만 아니라, 시간 라벨 형광 강도의 출력을 허용한다. </li><li> 데이터베이스 및 분석 할 후 시리얼 2D 이미지 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;지역을 클릭이자 (ROI)은 평균의 ROI &quot;로 전환&quot;을 의미의 의미의 ROI &quot;모드&quot;로 전환 &quot;관심 영역 (ROI) 의미&quot;모드.을 클릭합니다. &quot; </li><li> 깜박 선택 cpYFP 488 ㎚의 채널을 제외한 다른 채널의 표시를 해제합니다. </li><li> 이미지의 수동 줌 직렬 2D 이미지를 재생하는 슬라이드 막대를 이동합니다. </li><li> 여기서 형광 신호의 증가는 일시적으로 사이트를 찾아서 단일 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드가 점멸을 확인합니다. 섬광을 표시하기 위해 적절한 투자 수익 (ROI) 도구를 사용합니다. 각각의 투자 수익 (ROI)의 시간에 따른 형광 변화를 나타내는 곡선은 이미지 옆에 표시됩니다. </li><li> 모든 섬광을 선택한 후, 다른 채널의 디스플레이를 켭니다. 배경 신호 감산에 대한 세포의 외부 이미지에 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 함께 시간 라벨 출력 각 ROI의 평균 형광을. </li><li> 스캔 시간과 지역과 함께 직렬 스캔 이미지 파일의 각 깜박이는 횟수를 기록세포. Excel을 사용하여 100 초 / 1,000 μm의 2 셀 영역 당 섬광의 숫자로 플래시 주파수를 계산합니다. </li><li> 각 플래시 (진폭, 피크 시간과 소멸 시간)의 매개 변수를 계산하는 대화 형 데이터 언어 (IDL, ResearchSystems)로 작성된 사용자 정의 개발 한 프로그램을 사용하십시오. IDL 소프트웨어를 상업적으로 사용할 수 있으며 플래시 파라미터 분석을위한 사용자 개발 프로그램은 요청에 따라 저자에서 얻을 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

살아있는 동물이나 관류 장기 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징은 미토콘드리아의 기능 평가 17,19,21,22,24,25에 대한 기존의 방법에 비해 상당한 장점이있다. 여기에 설명 된 기술은 세포 내 해상도에서 실제의 생리 학적 상태에서 미토콘드리아 기능의 동일계 판정 실시간을 달성 할 수있다. 전신 생체 내 특정 기관 또는 세포 유형의 정상적인 기능의 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위해, 다른 측정과 결합 할 때 특히 유용하다. 이것은 각종 파라미터의 제어에 공 초점 현미경과 정교한 관류 시스템을 결합한 복잡한 기술이다. 그럼에도 불구하고,이 기술은 근육의 미토콘드리아 기능 17,19,20과 몸 전체 포도당 신진 대사를 연결하는 데 사용 된 현재 심장 질환에서 미토콘드리아의 기능 장애를 연구하는 회사에 의해 사용된다. 랑겐 심장 perfusioN 시스템은 좌심실의 압력을 모니터링하고 각 비트 동안 내 Ca...

미토콘드리아는 세포의 생체 에너지의 중심 역할, 자유 라디칼 신호, 산화 환원 항상성, 이온 조절하고, 세포의 운명 결정 1,2을한다. 미토콘드리아의 기능 장애는 종종 함께 질병 3-6의 병인의 기초. 특히 심장과 골격 근육과 근육 시스템에서, 미토콘드리아의 호흡은 세포 내 칼슘과 강력한 힘 개발 7,8의 적절한 조절을 지원하는 ATP의 대부분을 제공합니다. 이 근육들은 전체 세포 부피 20-40 %를 차지하며, 근육 섬 2 사이에 &quot;고정&quot;하는 미토콘드리아의 큰 숫자를 가지고있다. 수많은 연구에도 불구하고, 특히 생체 내에서 생리 학적으로 관련된 조건에서 미토콘드리아 기능 조절, 우리의 이해는 제한되어 있습니다. 이유는 미토콘드리아의 기능을 평가하기 위해 개발 된 방법의 대부분 vitr에 의존하다O 또는 EX 인공 기질이 보충 된 절연 미토콘드리아의 산소 소비 및 형태학 통해서 미토콘드리아 기능의 간접 측정 (예를 들면 전자 현미경), 효소 활성 (예 aconitase 활성) 또는 세포 내 ATP 농도 9-11 모니터링과 같은 생체 내 접근법 . 최근 상대 미토콘드리아 농축 작은 분자 형광 표시는 그대로 세포의 막 전위, 칼슘과 반응 산소 종 (ROS), 11 ~ 13을 포함하여 미토콘드리아 신호를 엿볼 제공하기 위해 적용되었습니다. 또한, 여러 녹색 형광 단백질 (GFP)의 산화 환원을 기반으로 ROS 지표 구획화 된 세포 내 산화 환원 ROS 14-16 신호의보다 구체적인 평가를 달성하기 위해 개발되었다. 이 가운데, 우리는 유전자에 의해 코딩 슈퍼 옥사이드 표시, 원형 순열 노란색 형광 단백질 및 targete 개발미토콘드리아 (MT-cpYFP) 17에 D 그것. MT-cpYFP는 515 nm에서 모두 방출 피크와 405 또는 488 nm에서 흥분 할 수있다. 488 nm의 여기에서의 발광은 시험 관내 및 생체 내 보정 17,18에서 이전에 도시 된 바와 같이 수퍼 옥사이드에 구체적 응답한다. 405 nm의 여기에서의 방출은 (다양한 조건에서 MT-cpYFP의 방출 및 여기 스펙트럼에 대한 자세한 정보는 참조 (17)의 그림 1 참조) 내부 통제로 사용됩니다. 시간 경과 공 촛점 이미징,이 표시가 그대로 세포의 단일 미토콘드리아에서 초과 산화물 깜박라는 이름의 슈퍼 옥사이드 생산 이벤트를, 파열 감지합니다. 초과 산화물의 플래시는 미토콘드리아 호흡, 첨부 과도 미토콘드리아 막 탈분극과 ROS 생산 17 ~ 20의 복합 함수 역할을합니다. 최근에, 우리는 pUC 계 - CAGGS-MT-cpYFP 벡터 C57/BL6 배경에 (17, 19)를 사용하여 팬 조직 MT-cpYFP 형질 전환 마우스를 생성하고 강한 발현을 확인했습니다심장, 골격 근육과 다른 조직 (그림 2)에서이 지표의 시온. 형질 전환 마우스는 요청 및 워싱턴 대학의 MTA 승인에 관심이 학술 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 연구에서, 우리는 현장 랑겐 관류 마음에 슈퍼 옥사이드 깜박 영상뿐만 아니라 마취 MT-cpYFP 형질 전환 마우스 (17, 19)의 골격 근육에있는 플래시 이벤트의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다. 이 기술은 생리학 관련 조건이나 생체 (21, 22)의 단일 미토콘드리아 ROS 생산 이벤트의 실시간 모니터링을 할 수 있습니다. 그런 적절한 형광 표시기 막전위 및 칼슘 등의 기타 단일 미토콘드리아 매개 변수를 모니터링하는 시스템을 사용하는 것도 가능하다. 세포 내 이벤트 (예를 들면 칼슘 과도) 또는 심장 기능 (와 미토콘드리아 기능의 추가, 동시 또는 병렬 평가 예. 박출계수)이 달성 될 수있다. 이러한 허혈 및 재관류와 같은 병리학적인 섭동은 그대로 심근 단일 미토콘드리아 기능에 대한 응력의 영향을 평가하기 위해 관류 심장에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">< 강한> 시약< / 강></td></tr> <tr><td>Blebbistatin</td><td>토론토 연구 화학 물질</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros 유기물</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D- 포도당</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>피루베이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), "Physiological Analysis" 모듈을 포함한 소프트웨어 버전 4.2 SP1.</td></tr></tbody></table>

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

미토콘드리아는 진핵 세포 시스템의 에너지 생산과 세포 내 신호 전달을 담당하는 중요한 세포 내 소기관이다. 미토콘드리아 기능 장애는 종종 함께 인간의 질병에 기여한다. 미토콘드리아의 기능 장애를 평가하기 위해 개발 된 방법의 대부분은 시험 관내 또는 생체 측정에 기반하고 있습니다. 이 실험의 결과는 생체 내에서 미토콘드리아의 기능을 결정하는 능력을 제한했다. 여기서, 우리는 생체 내에서 실시간 방식으로 단일 미토콘드리아 기능의 평가를 허용 라이브 aminals있는 그대로 조직 이미징을 위해 공 초점 주사 현미경을 이용하는 신규 한 방식을 기술한다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 슈퍼 옥사이드 표시, 원 순열 노란색 형광 단백질 (MT-cpYFP)를 발현하는 형질 전환 생쥐를 생성합니다. 마취 MT-cpYFP 마우스를 맞춤 제작 단계 어댑터와 시간 경과 이미지가 F를 촬영에 고정되어뒷다리의 노출 된 골격 근육을 롬. 마우스는 이후에 희생되고, 마음은 37 ℃에서 생리적 솔루션 랑겐 관류 설정 관류 마음은 공 초점 현미경의 무대에서 특별한 챔버에 위치하고 부드러운 압력은 마음을 고정화하고 심장 박동에 의한 동 잡음을 억제하기 위해 적용된다. 과산화물이 점멸 초당 프레임의 주파수에서 실시간 2D 공 촛점 이미징에 의해 감지됩니다. 관류 액은 다른 호흡 기질 또는 다른 형광 표시기를 포함하도록 수정 될 수있다. 관류 또한 허혈 및 재관류와 같은 질병 모델을 생성하기 위해 조정될 수있다. 이 기술은 본래 조직 및 생체 내 싱글 미토콘드리아의 기능을 결정하기위한 유일한 방법이다.

이 프로토콜에 따라, 하나의 미토콘드리아 이벤트의 생체 내 이미징 마취 된 쥐의 골격근에서 수행 할 수있는 관류 마음에 현장 영상 (그림 1)으로 하였다. 이미징 조건의 최적의 설정은 그대로 근육 조직의 선명한 이미지를 보장하고 단일 미토콘드리아 해상도 (그림 2)와 함께합니다. TMRM은 종종 MT-cpYFP의 위치를 확인하는 데 사용됩니다 및 MT-cpYFP 신호 완전한 중복 패턴 (그림 2)를 표시해야합니다. TMRM 그대로 세포 23 미토콘드리아 막 전위 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 지표입니다. 그 스펙트럼은 cpYFP의 구별이다. 또한, 순차 여진 방법을 사용하여, TMRM 및 MT-cpYFP의 발광 신호 (17)는 서로를 방해하지 않을 것이다. 그림 3의 대표 이미지를 표시하는 하나의 미토콘드리아 슈퍼 옥...

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

이 절차의 전반적인 목표는 과산화물 섬광 및 멤브레인 전위 변동과 같은 단일 미토콘드리아 이벤트를 현장 또는 생체 내에서 모니터링하여 생리학적으로 관련된 맥락에서 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뒷다리에 있는 골격근을 노출시킴으로써 이루어집니다. 다음으로 골격근의 타임랩스 컨포칼 이미지를 in vivo에서 획득합니다.그런 다음 마우스 심장을 관류하고 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화합니다. 마지막으로 이미지를 처리하고 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 타임 랩스 및 2차원 컨포칼 이미지를 통해 골격근, 생체 내 또는 관류된 심장에서 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광과 막 전위 변동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.미토콘드리아를 분리할 때 미토콘드리아 기능을 평가하는 것과 같은 기존 근육에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 생리학적으로 관련된 조건에서 단일 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시연은 칼, 동물 또는 칼 조직 컨포칼 이미징이 더 가파르고 복잡한 절차이기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 등장성 균형 염 용액(IBSS), Krebs HENSEL Light Buffer(KHB) 및 수술 기구를 준비한 후 펜토바르비탈의 복강내 주사로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기를 수행하여 동물이 진정되었는지 확인합니다.면도기를 사용하여 뒷다리 중 하나의 털을 제거한 후 70% 에탄올로 해당 부위를 소독합니다. 다음으로 팔다리 바깥쪽을 따라 피부를 절개하여 위빈혈 근육을 드러냅니다. 그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 에피미슘을 부드럽게 집어 들고 가위를 사용하여 절개합니다.더 절개하여 epimysium을 제거하고 그 아래의 근육 섬유를 노출시킵니다. IBSS에 500나노몰 테트라에틸, 막대 도민 메틸 에스테르 또는 TMRM을 첨가하고 근육을 용액에 30분 동안 담그십시오. TMRM을 근육에 로드한 후 40 x 오일 대물렌즈를 사용하여 TMRM이 없는 IBSS로 근육을 세척합니다.컨포칼 현미경 스테이지에서 마우스를 옆으로 눕히고 뒷다리를 구속하여 노출된 골격근이 커버 슬립에 대해 맞춤 제작된 챔버에 있도록 합니다. 그런 다음 다리를 부드럽게 눌러 조직과 커버 슬립을 단단히 접촉시키고 8비트 픽셀 깊이와 프레임당 1초의 샘플링 속도를 사용하여 노출된 근육을 IBSS에 담그고 근육의 2차원 직렬 스캔을 기록합니다. 405나노미터에서 먼저 여기하여 505나노미터 이상에서 수집하여 순차적 이미지를 수집합니다.그런 다음 488나노미터에서 흥분하고 505나노미터 이상에서 수집합니다. MT의 이중 파장 여기용. CCP YFP, 405, 488 및 543 나노미터에서 순차 여기를 사용하고 각각 505-5, 45.505-5, 45 및 560나노미터 이상에서 방출을 수집합니다. 마우스 심장을 이미지화하기 위해 M-T-C-P-Y-F-P 및 TMRM의 삼중 파장 여기 이미징을 위해 동물에 200단위의 헤파린을 주입합니다.10분을 기다렸다가 개흉술로 쥐를 안락사시킨 후 심장과 폐, 흉선을 빠르게 제거합니다. 이식된 조직을 얼음처럼 차가운 IBSS로 빠르게 옮깁니다. 그런 다음 흉선의 엽을 확인하고 부드럽게 껍질을 벗깁니다.상행 대동맥을 노출시키려면 폐와 흉선을 제거하고 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 대동맥을 분리합니다. 다음으로, 대동맥궁의 첫 번째 분기 앞의 상행 대동맥의 위쪽 끝을 절단합니다. 그런 다음 두 개의 마이크로 봉합 집게로 대동맥 벽을 부드럽게 잡고 내강을 노출시키고 조심스럽게 캐뉼라에 놓습니다.마이크로 혈관 클램프를 사용하여 대동맥을 제자리에 고정하고 그 주위에 봉합사를 빠르게 묶습니다. 클램프를 제거하고 집게를 사용하여 캐뉼라의 끝이 대동맥근 위에 있는지 주의 깊게 확인합니다. 심장을 제자리에 고정하기 위해 필요한 경우 추가 넥타이를 확보하십시오.연동 펌프를 켜고 심장을 관류합니다. 분당 1밀리리터의 속도로 심장은 관류 시 박동을 재개합니다. 10분간 안정화한 후 10마이크로몰 BLE 스타틴과 100-500나노몰 TMRM을 심장에 관류합니다.심장 박동은 10분 후에 느려집니다. 다음으로, 관류 시스템의 위치를 조정하고 어댑터가 장착된 현미경 스테이지에 심장을 올려 챔버를 섭씨 37도까지 가열합니다. 챔버에 1ml의 KHB 관류 용액을 첨가하여 심장을 부분적으로 잠기게 합니다.연동 펌프를 사용하여 챔버에서 폐수를 제거합니다. 심장에 충분한 흐름을 제공하기 위해 펌프의 속도를 점차적으로 증가시켜 심장이 커버 슬립과 단단히 접촉하도록 하고 심장 박동을 더 억제하려면 심장에 부드러운 압력을 가합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 근육에 대해 설명한 대로 장기를 이미지화하고 초점면을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 표시합니다.컨포칼 현미경 소프트웨어의 생리학적 분석 모듈을 사용합니다. 먼저 자동으로 생성된 데이터베이스를 연 다음 분석할 2D 이미지 파일을 엽니다. 클릭 관심 영역 또는 ROI 의미.ROI의 평균으로 전환합니다 모드. 플래시를 선택하기 위해 488나노미터에서 CP YFP를 제외한 채널 표시를 끕니다. 이미지를 확대하고 슬라이드 막대를 수동으로 움직여 직렬 2D 이미지를 재생합니다.다음으로, 형광 신호가 일시적으로 증가하는 부위를 찾아 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광을 식별합니다. 적절한 ROI 도구를 사용하여 플래시를 표시하면 각 ROI의 시간에 따른 형광 변화를 보여주는 트레이스가 이미지 옆에 표시됩니다. 모든 플래시를 선택한 후 다른 채널의 디스플레이를 켭니다.배경 신호 빼기를 위해 셀 외부의 이미지에서 ROI를 선택합니다. 그런 다음 각 ROI의 평균 형광을 시간 레이블과 함께 출력합니다. 각 직렬 스캐닝 이미지 파일의 플래시 횟수를 셀의 스캔 시간 및 영역과 함께 기록합니다.Excel을 사용하여 플래시 빈도를 100초당 플래시 횟수 및 1000제곱 미크론 셀 면적당 계산합니다. 각 플래시에 대한 피크까지의 진폭 시간 및 감쇠 시간을 계산합니다. 대화형 데이터 언어로 작성된 맞춤형 개발 프로그램의 일부인 플래시 매개변수 분석을 위해 사용자 정의 개발 프로그램을 사용합니다.이 프로토콜을 사용하여 단일 미토콘드리아 이벤트의 생체 내 이미징을 마취된 마우스의 골격근에서 수행한 다음 관류된 심장에서 인시 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기에 표시된 바와 같이. 미토콘드리아 막 전위 지표인 TMRM은 M-T-C-P-Y-F-P의 위치를 확인하는 데 자주 사용되며 M-T-C-P-Y-F-P 신호와 완전히 겹치는 패턴을 보여야 합니다.스펙트럼은 CP YFP와 구별되며, 순차 여기 방식을 사용하면 TMRM과 M-T-C-P-Y-F-P의 방출 신호가 서로 간섭하지 않습니다. 이러한 이미지는 연속 2D 스캐닝 이미지에서 멤브레인 탈분극을 동반한 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광을 식별할 수 있음을 보여주며, 이는 골격근 조직과 심근 모두의 배경 신호에 대해 일시적인 형광 증가를 보여주었습니다. 높은 해상도 외에도 적절한 형광 강도도 필요합니다.이는 수집 채널의 레이저 강도와 이득을 조절하여 달성할 수 있습니다. 일반적으로, 세포로부터의 기저 형광 신호는 채널의 최대 강도의 1/3 내지 1/4로 설정된다. M-T-C-P-Y-F-P의 발현 수준과 TMRM의 로딩은 동물마다 다를 수 있기 때문에 대사 기질과 같은 생리학적 및 병리학적 섭동 모두에 대해 각 실험에 대해 이미징 조건의 미세 조정을 수행해야 합니다.여기에 표시된 전기 자극 및 허혈성 재관류는 과산화물 플래시 활성이 세포 대사 상태의 변화에 반응한다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 입안의 적절한 마취와 관류된 심장의 올바른 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 심근 백혈병 및 재관류 손상 중 미토콘드리아 기능 장애와 같은 추가 질문에 답하기 위해 허혈 및 융합과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

목표는 physiologic 미리와 afterload 압력의 컨텍스트 내에서 격리된 마음의 mitochondrial 산화 환원 상태를 모니터링하는 것입니다. biventricular 작업 토끼 심장 모델이 제공됩니다. NADH 높은 spatiotemporal 해상도 형광 이미지는 epicardial 조직의 mitochondrial 산화 환원 상태를 모니터링하는 데 사용됩니다.

절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

출처: Kennedy, L. H., et. al. 아데노 관련 바이러스 및 컨포칼 현미경을 사용한 유기형 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 소기관의 시각화 및 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 미토콘드리아의 이미징을 보여줍니다. 슬라이스는 지속적인 유체 순환과 온도 조절이 가능한 수조 챔버 내부에 배치됩니다. 컨포칼 현미경의 다양한 매개변수를 설정한 후 적색 형광을 가진 미토콘드리아의 타임 랩스 이미지를 캡처한 다음 녹색 형광을 가진 희소돌기아교세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures에서 희소돌기아교세포 내 미토콘드리아 운동의 공초점 이미징

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

과산화수소 (H 2 O2)는 산화 손상의 원인이자 신호 분자입니다. 이 프로토콜은 살아있는 효모에서 유전적으로 인코딩된 비율계량 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 측정하는 방법을 설명합니다. 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 정량적 세포 및 세포 내 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

이 기사에서는 Dendra2 광전환 형광을 통해 미토콘드리아 핵분열/융합 역학을 평가하기 위해 공초점 현미경 및 ImageJ를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

신장 근위 세뇨관 세포에서 미토콘드리아 분열/융합 역학 평가

학습하세요 생체 내 단일 미토콘드리아 과산화물 점멸 및 막전위 변화를 공촛점 현미경으로 실시간 이미징하는 방법을. 마우스 후지 근육과 관류 심장에서 생리학적 및 병리학적 조건에서 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있습니다.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

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