단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

이 절차의 전반적인 목표는 과산화물 섬광 및 멤브레인 전위 변동과 같은 단일 미토콘드리아 이벤트를 현장 또는 생체 내에서 모니터링하여 생리학적으로 관련된 맥락에서 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뒷다리에 있는 골격근을 노출시킴으로써 이루어집니다. 다음으로 골격근의 타임랩스 컨포칼 이미지를 in vivo에서 획득합니다.

그런 다음 마우스 심장을 관류하고 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지화합니다. 마지막으로 이미지를 처리하고 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 타임 랩스 및 2차원 컨포칼 이미지를 통해 골격근, 생체 내 또는 관류된 심장에서 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광과 막 전위 변동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

미토콘드리아를 분리할 때 미토콘드리아 기능을 평가하는 것과 같은 기존 근육에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 생리학적으로 관련된 조건에서 단일 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시연은 칼, 동물 또는 칼 조직 컨포칼 이미징이 더 가파르고 복잡한 절차이기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 등장성 균형 염 용액(IBSS), Krebs HENSEL Light Buffer(KHB) 및 수술 기구를 준비한 후 펜토바르비탈의 복강내 주사로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기를 수행하여 동물이 진정되었는지 확인합니다.

면도기를 사용하여 뒷다리 중 하나의 털을 제거한 후 70% 에탄올로 해당 부위를 소독합니다. 다음으로 팔다리 바깥쪽을 따라 피부를 절개하여 위빈혈 근육을 드러냅니다. 그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 에피미슘을 부드럽게 집어 들고 가위를 사용하여 절개합니다.

더 절개하여 epimysium을 제거하고 그 아래의 근육 섬유를 노출시킵니다. IBSS에 500나노몰 테트라에틸, 막대 도민 메틸 에스테르 또는 TMRM을 첨가하고 근육을 용액에 30분 동안 담그십시오. TMRM을 근육에 로드한 후 40 x 오일 대물렌즈를 사용하여 TMRM이 없는 IBSS로 근육을 세척합니다.

컨포칼 현미경 스테이지에서 마우스를 옆으로 눕히고 뒷다리를 구속하여 노출된 골격근이 커버 슬립에 대해 맞춤 제작된 챔버에 있도록 합니다. 그런 다음 다리를 부드럽게 눌러 조직과 커버 슬립을 단단히 접촉시키고 8비트 픽셀 깊이와 프레임당 1초의 샘플링 속도를 사용하여 노출된 근육을 IBSS에 담그고 근육의 2차원 직렬 스캔을 기록합니다. 405나노미터에서 먼저 여기하여 505나노미터 이상에서 수집하여 순차적 이미지를 수집합니다.

그런 다음 488나노미터에서 흥분하고 505나노미터 이상에서 수집합니다. MT의 이중 파장 여기용. CCP YFP, 405, 488 및 543 나노미터에서 순차 여기를 사용하고 각각 505-5, 45.505-5, 45 및 560나노미터 이상에서 방출을 수집합니다. 마우스 심장을 이미지화하기 위해 M-T-C-P-Y-F-P 및 TMRM의 삼중 파장 여기 이미징을 위해 동물에 200단위의 헤파린을 주입합니다.

10분을 기다렸다가 개흉술로 쥐를 안락사시킨 후 심장과 폐, 흉선을 빠르게 제거합니다. 이식된 조직을 얼음처럼 차가운 IBSS로 빠르게 옮깁니다. 그런 다음 흉선의 엽을 확인하고 부드럽게 껍질을 벗깁니다.

상행 대동맥을 노출시키려면 폐와 흉선을 제거하고 주변 조직을 조심스럽게 제거하여 대동맥을 분리합니다. 다음으로, 대동맥궁의 첫 번째 분기 앞의 상행 대동맥의 위쪽 끝을 절단합니다. 그런 다음 두 개의 마이크로 봉합 집게로 대동맥 벽을 부드럽게 잡고 내강을 노출시키고 조심스럽게 캐뉼라에 놓습니다.

마이크로 혈관 클램프를 사용하여 대동맥을 제자리에 고정하고 그 주위에 봉합사를 빠르게 묶습니다. 클램프를 제거하고 집게를 사용하여 캐뉼라의 끝이 대동맥근 위에 있는지 주의 깊게 확인합니다. 심장을 제자리에 고정하기 위해 필요한 경우 추가 넥타이를 확보하십시오.

연동 펌프를 켜고 심장을 관류합니다. 분당 1밀리리터의 속도로 심장은 관류 시 박동을 재개합니다. 10분간 안정화한 후 10마이크로몰 BLE 스타틴과 100-500나노몰 TMRM을 심장에 관류합니다.

심장 박동은 10분 후에 느려집니다. 다음으로, 관류 시스템의 위치를 조정하고 어댑터가 장착된 현미경 스테이지에 심장을 올려 챔버를 섭씨 37도까지 가열합니다. 챔버에 1ml의 KHB 관류 용액을 첨가하여 심장을 부분적으로 잠기게 합니다.

연동 펌프를 사용하여 챔버에서 폐수를 제거합니다. 심장에 충분한 흐름을 제공하기 위해 펌프의 속도를 점차적으로 증가시켜 심장이 커버 슬립과 단단히 접촉하도록 하고 심장 박동을 더 억제하려면 심장에 부드러운 압력을 가합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 근육에 대해 설명한 대로 장기를 이미지화하고 초점면을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 표시합니다.

컨포칼 현미경 소프트웨어의 생리학적 분석 모듈을 사용합니다. 먼저 자동으로 생성된 데이터베이스를 연 다음 분석할 2D 이미지 파일을 엽니다. 클릭 관심 영역 또는 ROI 의미.

ROI의 평균으로 전환합니다 모드. 플래시를 선택하기 위해 488나노미터에서 CP YFP를 제외한 채널 표시를 끕니다. 이미지를 확대하고 슬라이드 막대를 수동으로 움직여 직렬 2D 이미지를 재생합니다.

다음으로, 형광 신호가 일시적으로 증가하는 부위를 찾아 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광을 식별합니다. 적절한 ROI 도구를 사용하여 플래시를 표시하면 각 ROI의 시간에 따른 형광 변화를 보여주는 트레이스가 이미지 옆에 표시됩니다. 모든 플래시를 선택한 후 다른 채널의 디스플레이를 켭니다.

배경 신호 빼기를 위해 셀 외부의 이미지에서 ROI를 선택합니다. 그런 다음 각 ROI의 평균 형광을 시간 레이블과 함께 출력합니다. 각 직렬 스캐닝 이미지 파일의 플래시 횟수를 셀의 스캔 시간 및 영역과 함께 기록합니다.

Excel을 사용하여 플래시 빈도를 100초당 플래시 횟수 및 1000제곱 미크론 셀 면적당 계산합니다. 각 플래시에 대한 피크까지의 진폭 시간 및 감쇠 시간을 계산합니다. 대화형 데이터 언어로 작성된 맞춤형 개발 프로그램의 일부인 플래시 매개변수 분석을 위해 사용자 정의 개발 프로그램을 사용합니다.

이 프로토콜을 사용하여 단일 미토콘드리아 이벤트의 생체 내 이미징을 마취된 마우스의 골격근에서 수행한 다음 관류된 심장에서 인시 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기에 표시된 바와 같이. 미토콘드리아 막 전위 지표인 TMRM은 M-T-C-P-Y-F-P의 위치를 확인하는 데 자주 사용되며 M-T-C-P-Y-F-P 신호와 완전히 겹치는 패턴을 보여야 합니다.

스펙트럼은 CP YFP와 구별되며, 순차 여기 방식을 사용하면 TMRM과 M-T-C-P-Y-F-P의 방출 신호가 서로 간섭하지 않습니다. 이러한 이미지는 연속 2D 스캐닝 이미지에서 멤브레인 탈분극을 동반한 단일 미토콘드리아 과산화물 섬광을 식별할 수 있음을 보여주며, 이는 골격근 조직과 심근 모두의 배경 신호에 대해 일시적인 형광 증가를 보여주었습니다. 높은 해상도 외에도 적절한 형광 강도도 필요합니다.

이는 수집 채널의 레이저 강도와 이득을 조절하여 달성할 수 있습니다. 일반적으로, 세포로부터의 기저 형광 신호는 채널의 최대 강도의 1/3 내지 1/4로 설정된다. M-T-C-P-Y-F-P의 발현 수준과 TMRM의 로딩은 동물마다 다를 수 있기 때문에 대사 기질과 같은 생리학적 및 병리학적 섭동 모두에 대해 각 실험에 대해 이미징 조건의 미세 조정을 수행해야 합니다.

여기에 표시된 전기 자극 및 허혈성 재관류는 과산화물 플래시 활성이 세포 대사 상태의 변화에 반응한다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 입안의 적절한 마취와 관류된 심장의 올바른 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 심근 백혈병 및 재관류 손상 중 미토콘드리아 기능 장애와 같은 추가 질문에 답하기 위해 허혈 및 융합과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.