Name: 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 배우세요 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하는 슬라이드 준비 방법을. 면역형광 및 FISH 기술과 호환되어 핵 내 전사 활성 영역을 정밀하게 시각화할 수 있습니다.

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나는 리 연구소와 타일러 브루링에있을 때이 프로젝트의 감독 지니 T. 리 감사 원고를 편집. 이 작품은 Dimes 재단과 NIH 그랜트 GM098605의 3 월에서 바질 오코너 스타터 장학금 상에 의해 지원되었다.

1.3D 슬라이드 준비
<ol><li>다음 시약을 준비합니다.<ol>
<li>CSK 버퍼: 100 mM NaCl, 300 mM 자당, 10 mM 파이프, 3 mM MgCl2. pH를 1M NaOH로 6.8로 조정합니다. CSK 버퍼를 4°C에 저장합니다.</li>
		<li>0.5% 트리톤 X-100을 가진 CSK 버퍼: 트리톤 X-100 ~ 40ml의 200 μl을 CSK 버퍼를 추가합니다. 트리톤 X-100이 완전히 용해될 때까지 자기 교반기로 용액을 섞습니다. CSK 버퍼를 0.5% 트리톤 X-100을 4°C에 저장합니다.</li>
		<li>4% 파라포름알데히드(PFA)-PBS, pH 7.4: 약 70-80ml의 물에 PFA 4 g을 녹입니다. 용해 과정을 촉진하기 위해, 4 N NaOH의 약 20 μl을 추가하고 PFA가 완전히 용해되고 용액이 투명해질 때까지 60 °C에서 수조에 용액을 유지합니다. 이 프로세스는 약 1 시간이 걸립니다. PFA가 완전히 용해 된 후 10x PBS 10ml를 추가하십시오. 최종 부피를 물로 100ml로 조정하고 용액을 실온(25°C)으로 식힙니다. 새로 준비된 솔루션을 각 새로운 실험에 사용합니다. 참고: 모든 동물 작업에 대한 제도적 허가를 받고 관련 동물 관리 지침을 준수합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수컷 마우스를 안락사시합니다. 집게와 가위를 사용하여 마우스에서 고환을 소비합니다. PBS(또는 RPMI 1640)에 고환을 배치합니다. 고환제거 후 RNA의 분해를 방지하기 위해 다음 단계 1.3-1.4를 신속하게 수행한다.</li>
	<li>작은 페트리 접시에 고환을 파열하고 튜니카 알부진을제거합니다. 집게를 사용하여 얼음에 PBS에서 반열관을 해명.</li>
	<li>집게를 사용하여 여러 튜블러(길이 약 5-10mm)를 CSK 버퍼 500ml + 얼음 위에 0.5% 트리톤 X-100이 들어 있는 4웰 접시 한 웰로 옮기고 6분 동안 배양합니다. CSK 버퍼에 과도하게 노출되면 셀이 중단될 수 있습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 모든 튜블을 4% PFA-PBS 용액이 들어 있는 4웰 접시한 웰로 옮직합니다. 이 단계는 스테레오 현미경없이 미리 형성 될 수 있지만, 선택적으로 사용할 수 있습니다. 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 동시에 잠복 기간 동안 12 개의 사이토 스핀 챔버를 준비하기 시작합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 모든 튜블을 PBS가 함유된 4웰 요리의 우물로 옮기습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>유리 슬라이드의 뒷면에, PBS의 30 μl에 모든 튜비를 전송 (슬라이드의 상단은 양이온 충전으로 인해 피해야한다). 두 개의 집게의 끝을 사용하여, 조각으로 튜룰을 찢어. 두 개의 집게 끝 사이에 튜비를 클리핑하고 집게를 수평으로 당겨 서 튜블을 수평 방향으로 잘라. 약 10-20 초 동안이 단계를 계속하십시오.</li>
	<li>P20 파이펫을 사용하여 파이펫팅하여 서스펜션을 혼합합니다.</li>
	<li>서스펜션을 미세원심분리기로 옮기고 PBS로 약 1.3ml로 희석한다. 12개의 사이토스핀 챔버(총 1.2ml)에 각각 100 μl의 현탁액을 적용합니다. 이 단계에서, 세포의 농도는 결정될 필요가 없습니다.</li>
	<li>Cytospin는 실온에서 10 분 동안 2,000 rpm에서 샘플을 스핀합니다. 사이토스피닝 후 실온에서 몇 분 동안 실험실 벤치에서 건조 슬라이드가 제공됩니다. 슬라이드가 몇 분 동안 완전히 건조 할 수 있게 된 후 다음 단계로 이동하십시오.</li>
	<li>PBS가 들어있는 코플린 항아리를 사용하여 실온에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	<li>70% 에탄올을 함유한 코플린 항아리로 슬라이드를 옮기고 RNA FISH가 시작되기 전에 적어도 2분 이상 기다립니다. 슬라이드는 4 °C에서 70 % 에탄올에서 몇 주 동안 안정적입니다. 장기 보관을 위해 코플린 항아리에 80%와 100% 에탄올로 직렬 처리를 사용하여 탈수 슬라이드를 각각 2분 동안 사용하고 공기 건조는 슬라이드를 완전히 탈수합니다. 슬라이드 상자에 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 무작위 프라이밍에 의한 코트-1 DNA 프로브 준비
<ol><li>다음 시약을 준비합니다.<ol>
<li>혼성화 버퍼: 진행 구성 요소를 혼합하여 하이브리드화 버퍼 스톡 900ml를 준비합니다. 이 솔루션은 프로브를 재고하는 데 사용됩니다. 이러한 혼성화 완충제 스톡은 혼성화 전에 RNase 억제제 용액(리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체)의 10% 부피를 첨가할 수 있게 한다.<table><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
					<td>양(μl)</td>
					<td>최종 농도</td>
				</tr>
<tr>
<td>포르마미드</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% 더스네</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>혼성화 전에, 최종 농도에 맞게 혼성화 버퍼 스톡에 200mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스 또는 물의 1/10 vol을 추가한다. -20°C에서 이 혼합물은 1년 이상 안정적입니다.</li>
		<li>20x SSC: 구연산나트륨 88.2g과 NaCl 175.3g을 약 800ml의 물에 녹입니다. 1 M HCl의 몇 방울을 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 준비 후, 20 x SSC는 실온에서 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>50% (w/v) Dextran: 물을 저어서 천천히 50g의 황산염을 넣습니다. 실온에서 밤새 저어주세요. 물을 추가하여 최종 볼륨을 100ml로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 튜브에 아래에 나열된 다음 성분을 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 95°C에서 5분 동안 용액을 혼합하고 배양합니다.<table><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
				<td align="center">반응당 양(μl)</td>
				<td align="center">결승전</td>
			</tr>
<tr>
<td>코트-1 DNA: 1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>랜덤 9머 프라이머(키트에서)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>물</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>원심분리기는 잠시 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>다음 구성 요소를 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 37°C에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. (사용된 키트의 자세한 내용은 시약 및 장비 테이블을 참조하십시오).<table><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
				<td align="center">반응당 양(μl)</td>
				<td align="center">최종 농도</td>
			</tr>
<tr>
<td>2.2 단계에서 제조된 혼합물</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x 뉴클레오티드 버퍼(키트에서)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>클레나우 (키트에서)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>반응을 중단하려면 스톱 버퍼 2 μl(키트에서)을 추가합니다.</li>
	<li>마이크로스핀 컬럼을 사용하여 중지된 반응을 정화합니다.</li>
	<li>청어 정자 DNA (템플릿 Cot-1 DNA의 50 배 초과)의 50 μg (5 μl)를 정제 된 분획에 추가합니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 총 볼륨을 측정합니다. 0.7x 부피 100% 에탄올과 0.1x 부피 3M 아세테이트(pH 5.2),잘 섞고 원심분리기를 최대 속도(17,000 x g)로 4°C에서 사용하는 최대 속도(17,000 x g)로 섞는다.</li>
	<li>액체를 제거하고 70 % 에탄올의 200 μl을 추가하고 4 °C에서 최대 속도로 5 분 동안 잘 혼합하고 원심 분리기를 섞습니다.</li>
	<li>여분의 액체를 제거합니다. 실온에서 10-30 분 동안 침전을 건조시.</li>
	<li>펠릿을 하이브리드화 버퍼 스톡의 20μl로 용해합니다. 펠릿은 용해하기가 어렵기 때문에 파이펫을 반복적으로 구사합니다. 대체 옵션으로, 소용돌이 믹서는 펠릿을 효율적으로 용해시키는 데 사용할 수도 있습니다. 프로브는 사용 전까지 -20°C로 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 코트-1 RNA 물고기
<ol><li>아래에 나열된 구성 요소를 PCR 튜브에 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 80 °C에서 10 분 동안 배양하고 42 °C에서 약 10-30 분의 사전 단계로 배양합니다. 혼성화 될 때까지 42 °C에서 유지하십시오. 리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스는 선택 사항입니다. 물로 대체 할 수 있습니다.<table><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
				<td align="center">반응당 양(μl)</td>
				<td align="center">결승전</td>
			</tr>
<tr>
<td>Cot-1 DNA 프로브 (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스 (200mMM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>하이브리드화 버퍼</td>
				<td align="center">20에 추가</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>코플린 항아리에 80% 에탄올이 들어 있는 탈수 슬라이드가 2분 동안 100% 에탄올을 함유한 코플린 항아리가 2분 동안 들어오게 됩니다. 실온에서 실험실 벤치에 완전히 건조 슬라이드.</li>
	<li>팁 박스 챔버 (물 2 -3cm로 채워진)를 42 °C 인큐베이터에서 미리 예열합니다. 팁 박스 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 미리 된 프로브와 파이펫을 탈수 슬라이드에 직접 원심 분리합니다. 거품을 하지 마십시오. 커버 슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮습니다.</li>
	<li>42°C에서 하룻밤(14-15시간)까지 6시간 동안 혼성화한다.</li>
	<li>코플린 항아리 (2 x SSC와 50 % 포르마이드모두 2 개의 항아리, 2 배 SSC가있는 2 개의 항아리)에서 세척 솔루션을 준비하십시오. 수조에서 30 분 동안 42 °C에서 예열하십시오.</li>
	<li>면도날을 사용하여 슬라이드 가장자리에서 덮개 미끄러짐을 제거합니다. 시료를 긁지 마십시오. 45°C에서 2배 SSC와 50% 포름아미드를 함유한 코플린 항아리에서 슬라이드를 세척합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>45°C에서 5분 동안 2x SSC가 포함된 코플린 항아리에서 슬라이드를 세척합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>슬라이드에 DAPI 장착 용지 20 μl을 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 글래스를 부드럽게 눌러 장착 용지를 제거합니다. 청소 조직이있는 블롯 추가 마운팅 미디어. 슬라이드는 현미경 평가를 위해 준비됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

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3D 슬라이드 준비에서, 투과단계는 고정 단계 앞에 있다. 이러한 단계는 반열구관에서 직접 수행되어 3차원 크로마틴 구조를 보존합니다. RNA/DNA FISH에 대한 크로마틴 구조를 보존하는 대체 옵션은 투과화 단계와 고정 단계를 동시에 수행하는 것입니다. 이 대체 기술은 marsupial 세균 세포및 마우스 전 이식 배아7,8에서수행되었습니다. 그러나, 고정 단계가 투과화 단계보다 앞서는 경우, 높은 세포질 배경을 야기할 수 있다. 따라서, RNA 및 DNA FISH에 대한 슬라이드 최적화의 중요한 결정요인은 투과화 및 고정 단계의 순서에 의존한다. 투과화 단계의 지속 시간또한 슬라이드 준비의 최적화를 위한 중요한 요소입니다. 6분은 이 방법의 일반적인 조건입니다. 그러나 사용되는 재료의 변화에 따라 조정할 수 있습니다.
3차원 크로마틴 구조의 보존은 표면 확산 슬라이드와 뚜렷하게 분리되는 3D 슬라이드의 특징입니다. 이 장점은 염색체 퍼짐 준비와 크게 다릅...

고환에서, 생식 세포는 성숙으로 meiosis를 통해 diploid 정자고니아에서 분화, haploid 정자. 이 과정에서 세균 세포의 핵 크로마틴 구조는 지속적으로 동적으로 리모델링됩니다. 표면 확산은 일반적으로 개별 정자 생성 세포의 세포학적 검사에 사용됩니다. 표면 확산의 지배적인 방법은 개별 적인 정자 세포가 퍼지고 1을 평평하게 하는 저혈압 처리를채택합니다. 이 조건은 메이오성 염색체의 상세한 분석에 최적입니다. 시냅스 상태 및 재조합 포시와 같은 염색체 기능은 이 방법을 사용하여 쉽게 관찰된다. 그러나, 저혈압 처리는 핵 염색체 건축을 방해합니다, 따라서 이 기술은 핵의 구조분석에 적합하지 않습니다. 따라서, 향상된 방법은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하도록 설계되었습니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드방법(도 1)으로지칭되었다. 상기 3D 슬라이드 방법은 시상 혼성화(FISH)2,3에서RNA 형광에 의한 고환 세균 세포 분화 시 유전자 발현 및 크로마티닌 상태를 검사하도록 최적화되었기 때문에 핵에서 초기 RNA 국소화의 검출을 가능하게 하였다. 이 3D 방법은 면역 형광, DNA 및 RNA FISH의 조합에도 적용됩니다. 추가적으로, 이 방법은 포스트 메이오틱 성 크로마틴 (PMSC)의 발견에 도움이되었습니다, 포스트 meiotic 정자2에서발견 된 성 염색체의 조용한 구획.
3D 슬라이드 방법은 원래 핵 염색에 일반적으로 사용되는 슬라이드 제제의 두 가지 필수 단계의 조합을 통해 최적화되었다: 핵 물질을 고치기 위한 고정 단계와 세포질 물질을 제거하기 위한 투과성 단계, 항체 및 FISH 프로브와 같은 염색 시약의 접근성을 향상시키기 위한 것입니다. 앞서 다른 간행물3에설명된 바와 같이, 투과성 단계는 낮은 세포질 배경으로 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계에 선행되어야 한다고 판단되었다. 이 3D 슬라이드 방법에서, 투과 단계 및 후속 고정 단계는 반열관에서 직접 수행되며, 슬라이드에 사이토스피닝하기 전에 포셉을 가진 세균 세포의 기계적 해리에 선행된다. 정자 세포의 RNA FISH에 대한 대체 방법은 다른 실험실4에서개발되었다. 이 방법에서, 3D 방법과 일치, 침투 단계는 RNA FISH의 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계 앞에 있어야합니다.
다음 프로토콜은 3D 슬라이드 방법을 설명하고 핵 초기 RNA의 검출을 위한 가능한 응용 프로그램인 Cot-1 RNA FISH의 예를 제공한다. Cot-1 DNA는 게놈에 있는 반복적인 요소로 이루어져 있습니다. 여기서, Cot-1 DNA 프로브는 초기 성적증명서의 인트론 및 UTR에 혼성화되어 핵5,6에서전사 활성 영역을 검출한다. 3D 슬라이드는 다재다능하며 크로마틴 아키텍처 간의 공간 적 관계에 대한 상세한 검사를 얻기 위해 면역 형광, DNA 및 RNA FISH 기술의 조합에 적용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>콧-1 DNA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor 형광 라벨링 키트</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>청어 정자 DNA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>에탄올. 200 proof (absolute)</td> <td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionized</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Leuconostoc spp.의 덱스트란 황산염 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>인비트로겐</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>수당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>파이프</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 마운팅 배지 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleoside-vanadyl complex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 열:</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td>, <td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td>, <td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4-웰 디쉬</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>공기 인큐베이터</td><td>Revolutionary Science</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

고환 세균 세포 분화 하는 동안, 핵 크로마틴의 구조는 동적으로 변경. 다음은 마우스에서 발견되는 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 배열을 보존하도록 설계된 방법을 설명합니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드 방법으로 불려졌다. 이 방법에서 고환 튜블러는 세포질 물질을 제거하는 투과화 단계로 직접 처리되고 핵 물질을 고치는 고정 단계가 뒤따릅니다. 튜블러는 그 때 해리되고, 세포 현탁액은 시토스펀이고, 세포는 슬라이드에 부착됩니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출에 대한 민감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)와 이러한 검출 방법의 조합에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다. 3D 슬라이드 방법의 가능한 적용의 예로, Cot-1 RNA FISH는 초기 RNA를 검출하는 것으로 나타났다. 3D 슬라이드 방법은 고환 세균 세포 분화 중에 크로마틴 구조, DNA 및 RNA 사이의 공간 적 관계의 상세한 검사를 용이하게 할 것이다.

3D 슬라이드의 대표적인 결과는 도 2에표시됩니다. 본 실험에서, Cot-1 RNA FISH는 항 CBX1 및 γH2AX 항체를 사용하여 면역 염색과 함께 초기 전사를 검출하기 위해 수행되었다. RNA FISH와 면역염색을 결합하기 위하여는, 면역염색은3에서기술된 바와 같이 RNA FISH에 선행된 1차 행하되었습니다. CBX1은 XY 바디 (또는 성몸)에게 불린 메이오시스에 있는 pericentromeric 이종및 침묵하는 성 염색체에 현지화하는 이종국단백질 단백질입니다. γH2AX는 히스톤 변종 H2AX의 인포화 형이며 XY 본체에 국한된다. 이 그림에서, Cot-1 신호는 유축 영역에 축적되지만, pericentromeric 이종학 및 XY 바디에서 제외됩니다.
표면 확산 준비 중에 저혈압 용액을 가진 치료는 핵을 팽창시키고 물리적으로 비핵화 구조를 확장합니다. 메이오틱 연구를 위한 이 일반적인 방법은 단일 z-plane<s...

여기서 물질은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이를 3차원(3D) 슬라이드 방법이라고 합니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출을 위한 감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다.

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

이 3차원 슬라이드 준비 방법은 마우스의 고환 생식 세포에서 입증된 바와 같이 세포의 3D 염색질 배열을 보존합니다. 먼저, 세포질 물질을 제거하고 항체 및 어류 프로브와 같은 염색 시약의 접근성을 개선하기 위해 철 세뇨관을 투과합니다. 핵 물질을 고정한 후 겸자로 생식 세포를 기계적으로 해리하고 샘플을 슬라이드에 시토신으로 분리합니다.다음으로, 3D 슬라이드 준비에서 얻은 결과를 전략적으로 적용할 때 3D로 핵을 덮기 위해 여러 Z 섹션이 있는 데이터를 수집합니다. COT를 사용하면 한 마리의 RNA 물고기가 핵 초기 RNA를 보여 핵의 전사 활성 영역을 검출할 수 있습니다. 저는 매사추세츠 종합 병원의 유전자 실험실에 있을 때 이 방법을 개발했습니다.그 당시, 저는 nacent를 검출하기 위해 fish라고도 불리는 hybridization에 대한 cotton RNA 형광 통찰력을 위한 슬라이드 준비 방법을 최적화했습니다. RNA. 코튼 프로브는 인트론(intron)과 tls(tls)에서 반복적인 염기서열을 하이브리드화하고 활성 전사 부위를 시각화할 수 있습니다. 목화 RA 물고기는 핵 RNA 분포를 보존해야 합니다.이 올바른 준비 방법의 핵심은 정착 단계를 진행해야 한다는 것입니다. Cy Plasmic background를 제거하기 위해 얼음 위에서 PBS의 파열된 고환에서 OUS 세뇨관을 풀고 5-10mm 길이의 세뇨관 여러 조각을 0.5%tritton X 100이 함유된 500마이크로리터의 CSK 버퍼로 옮기고 얼음 위에서 6분 동안 배양합니다. 이제 모든 세뇨관을 4%P-F-A-P-B-S 용액으로 옮기고 실온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, PBS의 모든 세뇨관을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 유리 슬라이드 뒷면에 사이토 스핀 및 사이토 스핀 챔버를 설정하고 모든 세뇨관을 30마이크로리터의 PBS로 옮깁니다. 그런 다음 두 집게의 끝을 사용하여 세뇨관을 산산조각냅니다.두 집게의 끝 사이에 세뇨관을 끼우고 집게를 수평으로 당겨 세뇨관을 수평 방향으로 자릅니다. PBS 30마이크로리터를 첨가한 후 피펫팅으로 현탁액을 혼합한 다음 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 PBS를 총 부피 1.3ml에 추가합니다. 이제 100마이크로리터의 현탁액을 각 cyto spin chambers에 적용합니다. 사이토.실온에서 10분 동안 2000RPM으로 샘플을 회전시킵니다. PBS가 들어있는 코플랜 용기를 사용하여 실온에서 실험실 벤치에서 몇 분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 실온에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.그런 다음 슬라이드를 70% 에탄올로 최소 2분 동안 옮깁니다. 20 마이크로 리터 반응에서 100 나노 그램 포착, 1D NA 프로브, 20 밀리 몰 리보 뉴클레오티드 바나딜 복합체 및 혼성화 완충액을 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 섭씨 80도에서 10분 동안 배양한 다음 prea를 배양합니다.사용할 준비가 될 때까지 섭씨 42도에서 무릎을 꿇고 단계를 밟습니다. 이제 2분 동안 80% 에탄올에서 슬라이드를 연속적으로 탈수한 다음 2분 동안 100% 에탄올을 탈수합니다. 실온의 실험실 벤치에서 완전히 드라이 슬라이드합니다.이제 슬라이드를 섭씨 42도의 팁 상자 챔버에 놓습니다. 다음으로, 사전 필요 프로브를 간단히 원심분리하고 탈수된 슬라이드에 직접 피펫팅합니다. 섭씨 42도에서 최소 6시간의 혼성화 단계를 위해 슬라이드 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다.면도날을 사용하여 수조에서 섭씨 42도의 coplan 용기에 담긴 세척 용액을 30분 동안 예열하고, 샘플을 긁지 않고 슬라이드 가장자리에서 커버 슬립을 제거하고 슬라이드를 각각 5분 동안 세척 용액에 점진적으로 담그십시오. 두 개의 XSSC와 50% 폼 어미드를 포함하는 첫 번째 코플랜 항아리부터 시작하여 두 개의 XSSC와 50% 폼 미드를 포함하는 두 번째 코플랜 항아리가 이어집니다. 그리고 두 개의 XSSC를 포함하는 마지막 두 개의 항아리.그런 다음 샘플에 20마이크로리터의 DPI 장착 미디어를 추가하고 커버 슬립을 놓습니다. 커버 유리를 부드럽게 누르고 청소용 티슈로 추가 장착 매체를 닦아냅니다. 이 실험에서 포착된 하나의 RNA 물고기를 수행하여 XY체 면역조직화학에 국한된 단백질의 초기 전사 및 면역염색을 동시에 검출했습니다.이 PACU에서 정모세포는 XY체에서 이염색질 단백질 CCB X 1과 히스톤 변이체 H 2 A X의 인산화된 형태를 검출했습니다. 결과 물고기는 저장성 용액으로 처리 된 표면 스프레드에서 e 색채 영역에 축적 된 신호를 잡았습니다. 3차원 염색질 구조가 중단되고 모든 근 염색체 축을 단일 Z 평면 내에서 캡처할 수 있습니다.그러나 3D 슬라이드 준비는 이 절차에 따라 손상되지 않은 염색질 구조를 보존합니다. 이 올바른 준비 방법은 면역형광 DNA 및 RNA 물고기와 이러한 검출 방법의 조합에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

배우세요 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하는 슬라이드 준비 방법을. 면역형광 및 FISH 기술과 호환되어 핵 내 전사 활성 영역을 정밀하게 시각화할 수 있습니다.

고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법

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