고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법

이 3차원 슬라이드 준비 방법은 마우스의 고환 생식 세포에서 입증된 바와 같이 세포의 3D 염색질 배열을 보존합니다. 먼저, 세포질 물질을 제거하고 항체 및 어류 프로브와 같은 염색 시약의 접근성을 개선하기 위해 철 세뇨관을 투과합니다. 핵 물질을 고정한 후 겸자로 생식 세포를 기계적으로 해리하고 샘플을 슬라이드에 시토신으로 분리합니다.

다음으로, 3D 슬라이드 준비에서 얻은 결과를 전략적으로 적용할 때 3D로 핵을 덮기 위해 여러 Z 섹션이 있는 데이터를 수집합니다. COT를 사용하면 한 마리의 RNA 물고기가 핵 초기 RNA를 보여 핵의 전사 활성 영역을 검출할 수 있습니다. 저는 매사추세츠 종합 병원의 유전자 실험실에 있을 때 이 방법을 개발했습니다.

그 당시, 저는 nacent를 검출하기 위해 fish라고도 불리는 hybridization에 대한 cotton RNA 형광 통찰력을 위한 슬라이드 준비 방법을 최적화했습니다. RNA. 코튼 프로브는 인트론(intron)과 tls(tls)에서 반복적인 염기서열을 하이브리드화하고 활성 전사 부위를 시각화할 수 있습니다. 목화 RA 물고기는 핵 RNA 분포를 보존해야 합니다.

이 올바른 준비 방법의 핵심은 정착 단계를 진행해야 한다는 것입니다. Cy Plasmic background를 제거하기 위해 얼음 위에서 PBS의 파열된 고환에서 OUS 세뇨관을 풀고 5-10mm 길이의 세뇨관 여러 조각을 0.5%tritton X 100이 함유된 500마이크로리터의 CSK 버퍼로 옮기고 얼음 위에서 6분 동안 배양합니다. 이제 모든 세뇨관을 4%P-F-A-P-B-S 용액으로 옮기고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, PBS의 모든 세뇨관을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 유리 슬라이드 뒷면에 사이토 스핀 및 사이토 스핀 챔버를 설정하고 모든 세뇨관을 30마이크로리터의 PBS로 옮깁니다. 그런 다음 두 집게의 끝을 사용하여 세뇨관을 산산

두 집게의 끝 사이에 세뇨관을 끼우고 집게를 수평으로 당겨 세뇨관을 수평 방향으로 자릅니다. PBS 30마이크로리터를 첨가한 후 피펫팅으로 현탁액을 혼합한 다음 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 PBS를 총 부피 1.3ml에 추가합니다. 이제 100마이크로리터의 현탁액을 각 cyto spin chambers에 적용합니다. 사이토.

실온에서 10분 동안 2000RPM으로 샘플을 회전시킵니다. PBS가 들어있는 코플랜 용기를 사용하여 실온에서 실험실 벤치에서 몇 분 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 실온에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.

그런 다음 슬라이드를 70% 에탄올로 최소 2분 동안 옮깁니다. 20 마이크로 리터 반응에서 100 나노 그램 포착, 1D NA 프로브, 20 밀리 몰 리보 뉴클레오티드 바나딜 복합체 및 혼성화 완충액을 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 섭씨 80도에서 10분 동안 배양한 다음 prea를 배양합니다.

사용할 준비가 될 때까지 섭씨 42도에서 무릎을 꿇고 단계를 밟습니다. 이제 2분 동안 80% 에탄올에서 슬라이드를 연속적으로 탈수한 다음 2분 동안 100% 에탄올을 탈수합니다. 실온의 실험실 벤치에서 완전히 드라이 슬라이드합니다.

이제 슬라이드를 섭씨 42도의 팁 상자 챔버에 놓습니다. 다음으로, 사전 필요 프로브를 간단히 원심분리하고 탈수된 슬라이드에 직접 피펫팅합니다. 섭씨 42도에서 최소 6시간의 혼성화 단계를 위해 슬라이드 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다.

면도날을 사용하여 수조에서 섭씨 42도의 coplan 용기에 담긴 세척 용액을 30분 동안 예열하고, 샘플을 긁지 않고 슬라이드 가장자리에서 커버 슬립을 제거하고 슬라이드를 각각 5분 동안 세척 용액에 점진적으로 담그십시오. 두 개의 XSSC와 50% 폼 어미드를 포함하는 첫 번째 코플랜 항아리부터 시작하여 두 개의 XSSC와 50% 폼 미드를 포함하는 두 번째 코플랜 항아리가 이어집니다. 그리고 두 개의 XSSC를 포함하는 마지막 두 개의 항아리.

그런 다음 샘플에 20마이크로리터의 DPI 장착 미디어를 추가하고 커버 슬립을 놓습니다. 커버 유리를 부드럽게 누르고 청소용 티슈로 추가 장착 매체를 닦아냅니다. 이 실험에서 포착된 하나의 RNA 물고기를 수행하여 XY체 면역조직화학에 국한된 단백질의 초기 전사 및 면역염색을 동시에 검출했습니다.

이 PACU에서 정모세포는 XY체에서 이염색질 단백질 CCB X 1과 히스톤 변이체 H 2 A X의 인산화된 형태를 검출했습니다. 결과 물고기는 저장성 용액으로 처리 된 표면 스프레드에서 e 색채 영역에 축적 된 신호를 잡았습니다. 3차원 염색질 구조가 중단되고 모든 근 염색체 축을 단일 Z 평면 내에서 캡처할 수 있습니다.

그러나 3D 슬라이드 준비는 이 절차에 따라 손상되지 않은 염색질 구조를 보존합니다. 이 올바른 준비 방법은 면역형광 DNA 및 RNA 물고기와 이러한 검출 방법의 조합에 적용할 수 있습니다.