Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

이 절차의 전반적인 목표는 CPE 기반 세포 생존력 분석을 사용하여 청설병 바이러스 또는 BTV에 대한 저분자 항바이러스제를 식별하고 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 세포 분석 효과 또는 세포 역가 글로우 시약과 함께 CPE 기반 분석을 사용하여 항바이러스 화합물 라이브러리를 스크리닝함으로써 수행됩니다. 다음으로, 항바이러스 효능을 확인하고 용량 반응 분석을 사용하여 선택한 항바이러스제의 세포 독성을 평가합니다.

마지막으로, 선택된 항바이러스제의 가능한 바이러스 수명 주기 단계를 결정하기 위해 추가 시간 분석을 수행하여 가능한 작용 기전을 유도합니다.궁극적으로, 용량 반응 분석 및 추가 분석 시간을 기반으로 강력한 항바이러스 CIE와 낮은 세포 독성을 가진 새로운 항바이러스제를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 플라크 분석에서 TCI D 50 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 감염된 세포 세포에서 측정 가능한 CP를 유도하는 글루텐 바이러스를 포함한 특정 바이러스에 대해 바이러스 백신을 스크리닝하고 분류할 수 있는 측정 가능한 방법에서 민감하고 강력하며 재현성이 높은 방법을 제공한다는 것입니다. 보충된 DMEM에서 유지되는 BSR 세포의 CPE 기반 분석을 준비하기 위해 마이크로플로우 선택 디스펜서를 사용하여 다음을 수행합니다. 5, 384로 우물 당 000의 세포에 세포의 20 마이크로리터를 씨를 뿌린다.

웰 마이크로플레이트는 세포가 플레이트에 완전히 부착되도록 2-3시간 동안 배양한 다음 각 웰에 최종 농도 10마이크로몰의 항바이러스 화합물을 추가하고 완전히 혼합합니다. 분석 배지를 사용하여 플라크를 희석하고 정제 및 전파된 BTV를 원하는 역가로 희석하고 대조군을 위해 각 웰에 MOI가 표시된 5마이크로리터의 BTV를 추가합니다. 5마이크로리터의 분석 배지를 추가하고 분석 플레이트가 들어 있는 젖은 상자를 인큐베이터에 넣고 감염된 세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 80-95%의 습도로 72시간 동안 배양합니다.

그런 다음 인큐베이터에서 분석 플레이트를 꺼내 CTG 버퍼와 동결건조된 CTG 기질을 실온으로 해동 및 평형화합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 동결건조된 효소 기질과 완충액 시약을 혼합하여 균질한 CTG 시약 용액을 재구성합니다. 분석 플레이트를 15분 동안 실온으로 평형을 이룬 후, 디스펜서를 사용하여 25마이크로리터의 CTG 시약을 각 웰에 추가하고 어둠 속에서 15분 동안 배양한 후 발광 신호 종자 5, 384웰 마이크로플레이트에서 웰당 000개의 BSR 세포를 측정하기 전에 항바이러스 효능 분석을 위해 20마이크로리터를 사용하고 25마이크로리터를 사용하여 발광 신호를 측정합니다. 세포 독성 분석.

2-3시간 배양 후 여기에 표시된 대로 분석당 각 화합물 농도에 대해 8개의 반복을 할당합니다. 첫 번째 열은 화합물 또는 바이러스를 추가하지 않고 양성 대조군으로 할당하고 마지막 열은 항바이러스 효능 분석에 대해서만 바이러스를 추가하여 음성 대조군으로 할당하고 분석 배지에서 50마이크로몰로 희석된 화합물을 두 번째 열에 웰당 20마이크로리터를 추가합니다. 8채널 반자동 피펫 사용.

화합물을 25 마이크로 몰의 농도로 5 번 혼합합니다. 다음으로, 두 번째 컬럼에 있는 혼합물 20마이크로리터를 3컬럼으로 옮기고 잘 혼합하여 12.5마이크로몰의 농도를 생성합니다. 이것을 두 번 반복하십시오.

11번째 컬럼까지 연속 희석, 최종 농도는 0.04마이크로몰입니다. 그런 다음 5마이크로리터의 배지를 세포 전용 양성 대조군으로 1컬럼에 추가하고 BTV 감염만 있는 12열에 BTV 웰당 5마이크로리터를 추가합니다. 음성 대조군은 세포 독성 분석을 위해 2열에서 11열까지 BTV 웰당 5마이크로리터를 추가하고 화합물을 200마이크로몰의 초기 농도로 희석합니다.

화합물 웰당 25마이크로리터를 2열에 추가하고 5회 혼합하여 농도를 100마이크로몰로 만듭니다. 25마이크로리터를 2열에서 인접한 3열로 옮겨 2중 시리즈 희석을 수행하고 12열까지 계속합니다. 컬럼 12를 혼합한 후 혼합물 25마이크로리터를 흡입하고 버립니다.

첫 번째 열은 항바이러스 및 세포 독성 분석 모두에 대한 세포 전용 대조군입니다. 분석 플레이트가 들어있는 젖은 상자를 인큐베이터에 72 시간 동안 넣고 나중에 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 CT G 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다.

생물 통계 및 그래픽 소프트웨어를 사용하여 각 화합물 농도에 대한 평균값, 표준 편차 계수 변동 및 세포 생존율 백분율을 계산하고 비선형 회귀 분석을 수행하여 각 화합물의 EC 50 및 CC 50을 측정합니다. 384의 란 1에서 24에 있는 15 마이크로리터에 있는 well에 5, 000의 세포를 파종해서 추가 또는 TOA 분석의 시간을 준비하십시오. 각 화합물에 대한 웰 마이크로플레이트.

각 시점에 대해 8번의 반복이 있는 24개의 열을 모두 활용합니다. 분석 매체 마크 열 24의 웰당 10마이크로리터를 BTV 감염 전용으로 추가하여 열 1을 세포 전용 대조군으로 할당합니다. 분석 배지 웰당 5마이크로리터, MOI 0.01에서 바이러스 웰당 5마이크로리터를 첨가하여 음성 대조군.

웰 당 25 마이크로 리터의 최종 부피에서, 감염 후 다른 시간에 항 바이러스 효능 평가 컬럼으로 2 열에서 22 열까지 짝수 번호의 열을 선택하거나 이러한 열에서 HPI를 선택하고, 다른 HPI에서 0.01의 MOI에서 BTV 웰 당 5 마이크로 리터로 세포를 감염시키고, 또한 표시된 마이너스 2에 대해 웰 당 25 마이크로 리터의 최종 부피에서 희석 된 화합물의 웰 당 5 마이크로 리터를 추가합니다. HPI 1을 뺀 값입니다. BTV 감염 전에 BSR 세포에 화합물을 첨가하고, HPI가 없는 경우 화합물과 BTV를 동시에 배양액에 첨가합니다. 병렬로, 3에서 23까지의 홀수 번호 열을 이러한 열의 다른 시점에 해당하는 복합 전용 컨트롤로 지정합니다.

분석 배지의 웰당 5마이크로리터와 희석된 화합물의 웰당 5마이크로리터를 웰당 25마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다. 인큐베이터에서 세포를 72 HPI로 배양한 후 분석 플레이트를 꺼내고 cell titer glow kit를 사용하여 세포 생존율을 확인합니다. 마지막으로, 다중 모드 리더를 통해 얻은 발광 신호를 처리하는 소프트웨어를 사용하여 평균값을 결정합니다.

S-T-D-E-V CV 및 보호 세포 생존율 살아있는 세포에서 세포 A TP를 정량화하기 위해 CPE 분석을 사용하여 각 치료에 대해 이전에 강력한 항바이러스 효능, 낮은 독성 및 높은 선택성을 가진 몇 가지 유망한 선도 화합물을 확인했습니다. 예를 들어, 화합물 0 5 2는 0.27 플러스 또는 마이너스 0.12 마이크로몰의 EC 50 및 82.69 마이크로몰의 CC 50을 갖는 것으로 결정되었으며, 둘 다 전형적인 회귀 곡선을 보여줍니다. 비선형 회귀 분석 분석에서 C 0 5 2의 SI 50은 EC 50 및 CC 50 값을 기반으로 306이 나노 몰 스케일 항바이러스 효능, 낮은 독성 및 결과적으로 높은 SI 50을 기반으로 결정되었습니다. 세포는 10개의 서로 다른 농도의 C0,5,2가 존재하는 상태에서 0.01의 MOI에서 BTV에 감염되었고, 세포 생존율은 72 HPI에서 결정되었다.

CTG 키트를 사용하여 각 데이터 포인트는 5회 반복의 평균과 SD를 나타냅니다. TOA 분석은 화합물이 표적으로 하는 바이러스 수명 주기의 가능한 단계를 결정하는 데 사용되었습니다. BTV 감염 1시간 또는 2시간 전에 C0 5 2를 첨가했을 때, 항바이러스 효능은 이 그림에서 볼 수 있듯이 나노 몰 규모로 유지되었습니다.

또한, 32 및 48 HPI에서 C0 5 2를 추가했을 때 세포 생존율이 더욱 감소했는데, 이는 C 0 5 2 가 바이러스 진입과 같은 바이러스 수명주기의 초기 단계를 넘어 작용할 수 있음을 나타냅니다. BTV 바이러스 복제의 첫 번째 주기는 일반적으로 24 HPI 이내의 감염된 세포에서 완료되기 때문에 본 연구의 결과는 C 0 5 2 가 바이러스 복제, 패키징, 성숙 및 배출과 같은 BTV 바이러스 수명주기의 후반 단계에서 작용할 수 있음을 시사했습니다. 한편, C 0 5 2 가 바이러스 수명 주기의 후반 단계에서 기능하는 숙주 세포 기계에 작용하는 것도 가능합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 측정 가능한 CPE 감염 후 유발하는 바이러스에 대한 잠재적인 바이러스 백신을 식별하고 분류하기 위해 CPE 베스트 에세이를 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.