Name: 이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 조직 슬라이스 배양법을 이용한 태아 생쥐 치아 세균 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 계통 추적을 통해 세포 이동을 실시간으로 관찰하여 치아 조직의 역학적 특성을 이해하는 데 활용됩니다.

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사라 A. Alfaqeeh은 치과, 전문대, 교육부, 사우디 아라비아 왕국의 종류 사우드 대학 재정 지원됩니다.

1. 설정 <ol><li> (미네랄 오일로 윤활 숫돌을 사용하여) 해부 도구를 선명하게 및 70 % 에탄올 스프레이 건조 가열 살균을 사용하는 기관 배양을 위해 사용하기 전에 소독. 12 V 공급 장치를 사용하여 2 M 수산화 나트륨을 사용하여 전기 분해 해부 바늘을 선명. </li><li> 1 % 루타와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충 고급 둘 베코의 수정 이글 중간 F12 (DMEM의 F12)으로 구성된 배아 기관의 해부와 문화에 사용되는 배지를 준비합니다. </li></ol> 2. 배아 해부 <ol><li> 홈 오피스 또는 기타 관리위원회가 승인 한 일정 하나의 방법을 사용하여 일정 시간 성관계 임신 여성을 추려. 낮은 복부 주위의 피부를 멀리 해부 가위를 사용하여 복부를 열 컷. 낮은 중간 선에 함께 연결하는 두 개의 자궁 뿔을 찾습니다. </li><li> 얼음 매체로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 갔지N 얼음에, 조직은 몇 시간 동안 남아있을 수 있습니다. </li><li> 현미경으로 중간에있는 페트리 접시에있는 자궁과 장소를 제거합니다. 가능한 배아 해부 오염을 최소화하기 위해 층류 흐름 후드에서 수행되어야하는 위치. </li><li> 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 해방. </li><li> 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 참살하고 매체의 신선한 접시에 머리를 전송합니다. </li><li> 구강에 바늘을 배치하여 헤드의 턱을 분리하고 머리 뒤쪽 (그림 1A와 1B)으로 극복. 초핑 기다리는 동안 격리 하악골 일시적 얼음 매체에 저장 될 수있다. </li><li> 전체 하악 슬라이스 E11.5-E15.5 치아 세균 배양에 적합하다 스테이지. E15.5 후 하악의 개발 뼈 자르고 너무 어렵다. 치아 조각은 여전히​​ 할 수 있지만 뼈 (치골과 형성 치조골) 먼저 제거해야합니다9 자르고 전에 해부. 텅스텐 바늘과 집게를 사용하여 조심스럽게 뼈를 제거합니다. </li></ol> 3. 배아 슬라이스 <ol><li> 표준 테이블 조직 헬기 (그림 1C)를 사용하여 하악 조직 조각을 준비합니다. 약 200 턱 후 신선한 잎을 사용하고 떨어질 때 설치 디스크와 같은 높이가 놓여 있는지 확인하십시오. </li><li> 설치 디스크를 청소하고 사용하기 전에 70 %의 에탄올로 블레이드. 컴퓨터를 사용할 때 칼날이 매우 날카로운 있으므로주의는주의해야합니다. </li><li> 표본의 연령에 따라 200 ~ 400 μm의 사이의 절단 거리에 헬기를 설정하고 전체 치아 세균이 필요한지 여부에 따라 달라집니다. 최대의 블레이드의 힘을 설정합니다. </li><li> 피펫이나 집게를 사용하여 플라스틱 설치 디스크에 하악을 전송합니다. 방향이 아직 확실 있는지 디스크 만들기에 하악을 정렬합니다. 현상 혀 방향을 결정하기위한 유용한 마크로서 사용할 수있다. 어금니 사용 AF에 대한앞니에 그들은 (그림 2A에 자르고면 참조) 성장이 치아의 서로 다른 방향을 반영하기 위해 하악을 통해 시상 슬라이스를 사용하는 동안 rontal / 가로 방향 (그림 1B에서 자르고면 참조). </li><li> 약간 설치 디스크의 하악골을 건조하기 위해 필터 종이를 사용하여 조직의 주위에서 초과 매체를 제거합니다. </li><li> 즉시 건조 후, 헬기의 원형 스테인리스 테이블에 디​​스크를 놓습니다. 에 컴퓨터를 켜고 키​​를 눌러 시작. 표 동시에 블레이드를 운반 초핑 아암가 발생 / 분까지 200 스트로크 삭제하면서 왼쪽에서 오른쪽으로 자동 이송. </li><li> 조직이 완전히 분리 한 후 컴퓨터의 전원을 끄십시오. 블레이드 암이 발생한 위치에 있는지 확인하고 디스크를 제거합니다. 블레이드 팔에서 손가락을하거나 자르고 때 무인 기계를 방치하지 마십시오. </li><li> 설치 디스크를 가지고 즉시 매체 t을 추가O 순서의 디스크 조각은 과도한 건조를 방지한다. 정중 매체의 소규모 배양 접시 (도 2A)에 텅스텐 바늘 후 피펫을 이용하여 디스크의 바닥으로부터 분리 된 조직을 제거. </li><li> 바늘을 사용하여 조각을 분리하고 입체 (그림 1D, 1E, 및 2B)에서 관심의 조직을 포함하는 조직 조각을 선택합니다. 매체 신선한 배양 접시에서 선택한 슬라이스를 놓습니다. </li></ol> 4. 슬라이스 문화 <ol><li> 탈수를 방지하기 위해 외부 웰에 멸균 물을 약 2 ㎖를 추가하고 요리의 중심에 걸쳐 금속 격자를 배치하여 문화에 대한 준비가 중앙 아니라 장기 배양 접시를 준비합니다 (그림 3a 및 3b). </li><li> 약 4cm 스테인레스 스틸 메쉬 시트에서 1.5 센티미터 x 다음 스트립을 절단하여 금속 그리드를 준비합니다. 중앙에 구멍을 뚫어 구부려 구멍 펀치를 사용하여엇갈린 말을 만들 수있는면. 그리드는 접시 (그림 3a 및 3b)의 바닥에 평행하게 누워, 중앙도에 걸쳐 평면 적합해야한다. 사용하기 전에 소독 그리드를 압력솥. </li><li> 투명 폴리에틸렌 테레 프탈레이트의 조각 그리드에 구멍을 커버하기에 충분한 크기 (PET) 막 (기공 크기 0.4 μm의) 절단. 선택한 슬라이스를 접시에 잘라 막 놓습니다. </li><li> 막 위에 슬라이스를 놓고 조심스럽게 중앙에 평평하게 슬라이스, 매체 밖으로 막을 올립니다. </li><li> 중앙에 원형 구멍을 통해 그리드에 필터를 배치하고, 멤브레인의 수준까지, 웰에 배지의 약 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 조작 (예 8) 매체에 단백질 또는 작은 분자 억제제를 추가하십시오. </li><li> 문화의 날 0시 형태의 레코드의 조각을 촬영하고 있습니다. </li><li> 5 % CO의 가습 분위기에서 요리를 배치 <s인큐베이터에서 37 ° C에서&gt; 2 UB. </li><li> 평균을 7 일 동안 정기적으로 문화를 사진. 문화 매체마다 48 ~ 72 시간을 변경합니다. 촬영을 위해 아래 (그림 2C-E)에서 광원으로 조각을 볼 수 있습니다. </li></ol> 5. 리니지 추적 계보 추적이 요구되는 경우에, 그러한 DII 또는 DIO 같은 친 유성 염료는 단계 4, 슬라이스 배양 전에 치아 세균에 주입 될 수있다. <ol><li> 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관 바늘을 빼냅니다. </li><li> 집게를 사용하여 바늘의 끝을 중단하고 아래로 염료 용액에 팁을 배치합니다. 염료는 모세관 작용에 의해 팁을 채우는 동안 몇 분 동안 둡니다. </li><li> 홀더에 가득 바​​늘을 놓고 인젝터 입 흡입기에 튜브를 통해 연결합니다. </li><li> 표시 될 예정 조각의 영역을 감동 배지에서 바늘의 끝을 배치합니다. 니들 중 염료의 소량 변위 공기압 적용조직에 거라고. </li><li> 바늘을 제거하고 형광에 따라 라벨을 확인합니다. </li><li> 성공적 표지 슬라이스 필터에 전송하고, 단계 4에 설명 된대로 배양 될 수있다. </li></ol>

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<li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li>
<li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme%3A+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

치아 배양이 방법은 치아의 세균에 대한 액세스 장점은 정확한 계보가 상피 세포 또는 중간 엽에서 추적 및 구슬의 배치를 허용, 우수한 있습니다. 개발 치아 세균의 정의 영역은 따라서 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다. 배양 중에 치아 세균의 변화 형태는 다음 될 수 있고, 조작의 효과는 빠르게 평가. 이 정확하게 다진 할 수있는 방법은, 그러나, 이러한 덴틴과 에나멜과 같은 단단한 조직의 실질적인 형성하기 전에 젊은 치아 세균에만 적합합니다. 턱의 경우 후 E15.5는 마 전에 뼈를 제거 할 필요가있다. 이것은 잠재적 밀접 E16.5에서 뼈와 관련된 치아 세균, 손상의 단점이있다. 우리는 성공적으로 치아로 인해 에나멜의 증착에 잘라 헬기 너무 어렵게되어 그 후, 생후 4 해부 치아의 세균을 분리했다. 슬라이스 Method는 꽃 봉오리 단계 1,6 즉, E13.5에서 치아 세균에 잘 작동합니다. 치아 상피 두껍게 단계에있을 때이 시간 지점 전...

실험의 번호는 문화 조직 생체 개발을 따르도록하는 것이 중요합니다. 조직 개발 농경 개발의 정의 기간에 액세스를 제공하고, 배양 배지에 요소를 첨가하여 유전자의 조작, 또는로드 구슬 및 형질 및 일렉트로 하나의 사용에 의해 허용한다. 많은 실험을 위해 그것이 성장함 조직 형태 형성을 겪는다로서 혈통 표지화 된 세포의 운명을 따라, 예를 들어, 조직을 시각화 할 수있는 것이 중요하다. 이 배아에서 조직의 블록을 배양 할 때 분명하지 않은 깊은 배아 내 개발 조직에 특히 문제가 될 수 있습니다. 그들은 하악, 상악과 정면 코 프로세스 내에서 개발로 이빨이 좋은 예입니다. 전체 하악이 배양되면 고정 된 조직으로 구획 한 후, 치아의 표면 구조는 볼 수 있지만, 형태 변화만을 분석 할 수있다 <s업&gt; 2. 우리는 우리가 치아 세균의 개발을 수행 할 수 있도록 개발 중에 치아의 다른 부분에 대한 액세스를 제공하는 라이브 슬라이스 문화 기술을 적용했다. Trowell에서 변성 방법 3을 사용하여 기체 - 액체 계면에서 기술 배양 치아 세균 조각. 이러한 슬라이스 문화를 직접 치아의 형태 형성을 다음과 같은 에나멜 매듭 치과 유두와 여포 1,4-7과 같은 별개의 구성 요소의 혈통 추적을 수있는 매우 유용하고있다. 기술은 마우스 배아에 한정되지 않고 성공적으로 돼지의 배양 라이브 슬라이스 및 뱀 치과 티슈 8,9에 사용되어왔다. 치아 전개를 시각화 할 수 있다는 장점 외에, 슬라이스 방법은 또한 조직의 얇은 조각은 인큐베이터에서 중형 및 공기로부터 영양분에 대한 액세스를 증가 이점을 갖는다. 이것은 생체 내에서 개발을 일치 치아 세균 및 쇼 invas의 개선 된 성장 결과돌기 (7)에 내피 세포의 이온. 반면, 전체 하악 문화 치아 세균 생체 내에서보다 느린 개발하고, 문화의 중심지 장기 문화에 괴사가 많습니다. 슬라이스 문화, 치아는 턱의 조각에서 개발하고 주변 개발 뼈와 다른 조직과의 상호 작용을 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 방법으로 조직을 똑바로 지지체 (10, 11)에 포함 할 필요하고 도마에 조직을 연결하는 모든 시스템에 대한 필요와 절개 후 다진된다. 상기 방법은 많은 턱뼈가 한 세션에서 절개 할 수 있도록, 따라서 비 침습적 신속한이다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>101077Y</td><td>100% 에탄올을 증류된 H2O에 70%까지 희석하였다.</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>DiI (분자 프로브)</td><td>Vybrant</td><td>V-22885</td><td>세포 표지 용액</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td></tr><tr><td>DiO ( 분자 프로브)</td><td>Vybrant</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Geminator 500</td><td>Thomas</td><td>Thomas No. 3885A20</td><td>Dry-heat sterilization</td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td>표준 테이블</td></tr><tr><td>장기 배양 접시 (Center-Well Organ Culture Dish)</td><td>팔콘</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>막 (세포 배양 인서트, 0.4 &mu; m 기공 크기)</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>PET 트랙 에칭 멤브레인, 6웰 형식</td></tr><tr><td>금속 그리드(스테인리스강 - AISI 304 - 메쉬)</td><td>Goodfellow</td><td>FE228710</td><td>(Fe/Cr18/Ni10)</td></tr><tr><td>AutoFlow 직접 가열 CO2 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>NU-5500</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Intracel Ltd</td><td>051-0500-900 0-100 psi</td><td>단일 채널 picospritzer III</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 유리 모세관 1mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어 0.1mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005138</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어 0.38mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005155</td><td></td></tr><tr><td>흡인기 튜브</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td>입 흡인 계통 추적기에 사용</td></tr></tbody></table>

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

이식편의 문화는 특정 시점에서 장기를 개발하고 조작 따라서 발달 생물학을위한 중요한 방법입니다 수 있습니다. 많은 기관의 경우는 체외 배양시 모니터링 할 수 있도록 개발 조직에 접근하기가 어렵습니다. 슬라이스 문화 방법은 수 있습니다 조직에 액세스 할 수 있도록 형태 형성의 움직임이 따라 할 수있는 특정 세포 집단이 조작 또는 계보 추적 대상이 될 수있다. 본 논문에서 우리는 종의 범위에서 치아 세균의 문화에 매우 성공적이었다 슬라이스 문화의 방법을 설명합니다. 방법은 다른 턱 조직으로 둘러싸인 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 비율로 개발 치아 세균에 우수한 액세스를 제공한다. 이것은 치아와 주위 조직 사이의 조직 상호 작용을 모니터링 할 수있다. 이 논문은 치아 세균에 집중되지만, 동일한 프로토콜이 수의 개발을 수행하도록 적용될 수있다이러한 침샘, 메켈의 연골, 코 분비, 혀, 귀 등 다른 장기의.

제 어금니 치과 여포의 움직임에 추종하기 위하여, 250 μM 정면 슬라이스는 상기 한 방법을 사용하여 하악 통해 촬영했다. 치아 뿌리는 개발 치아의 바깥 쪽 에나멜 상피 (OEE)을 둘러싸는 중간 엽의 층이며, 이전에 치주 6의 조직의 형성에 참여하는 것으로 나타났다. 턱은 E14.5, 치아 개발의 캡 단계에서 해부했다. 슬라이스 내의 치과 상피의 윤곽이 맑아 응축 치과 간엽은 치아 상피 세포 (도 4a)의 주위에 어두운 링으로서 식별 될 수있다. DII는 설측 (그림 4A)에 치아 조각의 외부 에나멜 상피 옆에있는 중간 엽에 주입 하였다. 라벨 후 조각은 4 일 동안 배양 및 간격 (그림 4B 및 4C)에서 촬영. 생체 치아 세균에 도달 할 것E18.5 바이 벨 스테이지와 별개 종 단 형상은이 기간 동안 유사한 진행을 나타내는 슬라이스에서 관찰되었다. DII의 자리는 ...

여기에 디테일이 조직 헬기를 이용하여 하악 조각 문화 치아 세균에 방법을 우리는. 이 방법은 전통적인 배양 방법을 사용하여 사용 가능한 조작과 혈통 추적하지를위한 절호의 기회를 제공하고, 개발하는 동안 치아에 고유 한 액세스 할 수 있습니다.

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

다음 실험의 전반적인 목표는 며칠에 걸쳐 치아 발달을 추적하는 것입니다. 체외 엑스플랜 배양은 태아 마우스의 발달 중인 하악골을 살아있는 조각으로 해부하여 두 번째 단계로 발달 중인 치아 세균을 노출시킴으로써 달성됩니다. 슬라이스를 선택하여 배양 배지 위의 필터에 놓고 발달을 허용하도록 배양합니다.다음으로 배양 기간 동안 세포 이동을 추적하기 위해 계통 추적자로 절편을 라벨링하고, 엑스플랜 배양 중에 발달하는 치과 조직의 역동적인 특성을 보여주는 결과를 얻습니다. 기존 이식 배양에 비해 이 기술의 주요 장점은 치아 보석과 같은 내부적으로 발달하는 기관이 주변 조직의 맥락에서 발달 전반에 걸쳐 관찰될 수 있다는 것입니다. 기계의 설정이나 조직의 방향이 정확하지 않은 경우 절단 및 선택 단계가 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.먼저, 500ml의 고급 ECCO 변형 이글 배지 F 12에 1%글루타메이트 및 1%페니실린 스트렙토마이신을 첨가하여 배아 장기에 대한 해부 및 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 Takahashi Sumi의 비디오 기사에서 설명했듯이 발달 단계 E 11.5와 E 15.5 사이의 쥐 배아를 해부하고 신선한 배지가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 갓 날카롭게 한 멸균 텅스텐 바늘을 사용하여 배아의 목을 베고 머리를 얼음 위에 미리 냉각된 배지의 새 접시에 옮깁니다.그런 다음 구강에 바늘을 꽂고 머리 뒤쪽을 임시로 잘라 하악골을 머리에서 분리한다. 분리된 하악골을 절단하기 전에 얼음 위에 미리 냉각된 매체에 보관하십시오. 하악 조직을 절단하기 전에 조직 다지기의 장착 디스크와 블레이드를 70% 에탄올로 청소하고 블레이드가 장착 디스크와 같은 높이에 있는지 확인하십시오.떨어지면 약 200개의 하악골을 자른 후 칼날을 교체해야 하고, 표본의 나이에 따라 절단 거리를 200에서 400마이크로미터 사이로 설정해야 하며, 치아 세균의 격리가 필요한 E 14.5 배아에 전체 치아 세균이 필요한지 여부에 따라 250마이크로미터의 절단 거리가 사용됩니다. 다음으로, 하악골을 플라스틱 장착 디스크로 옮기고 발달 중인 혀가 정면 가로 방향이 되도록 배열합니다. 앞니를 분리하기 위해 어금니를 절개할 때는 하악골을 통해 시상 절편을 채취합니다.방향이 올바르게 지정되면 조직 주변에서 여분의 매체를 제거합니다. 여과지를 사용하면 하악골이 약간 구동되어 장착 디스크의 제자리에 고정됩니다. 여과지로 건조시킨 직후 초퍼의 원형 스테인리스 스틸 테이블에 디스크를 놓습니다.그런 다음 블레이드 힘을 최대로 설정하고 기계를 켠 다음 시작을 누릅니다. 테이블은 왼쪽에서 오른쪽으로 자동으로 이동하며, 동시에 칼날을 운반하는 도마는 분당 최대 200스트로크로 올리고 내립니다. 조직이 완전히 절단되면 기계를 끕니다.블레이드 암이 올라간 위치에 있는지 확인한 다음 디스크를 제거합니다.블레이드 암 아래에 손가락을 넣거나 기계를 방치하지 마십시오. 조직을 다질 때는 장착 디스크를 가져다가 과도한 건조를 방지하기 위해 디스크의 슬라이스에 즉시 매체를 추가하십시오.그런 다음 텅스텐 바늘이나 피펫을 사용하여 디스크 바닥에서 슬라이스 조직을 조심스럽게 제거하고 배지의 작은 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 다음으로, 바늘을 사용하여 개별 절편을 분리한 다음 실체 현미경에서 관심 영역을 포함하는 조직 절편을 선택합니다. 선택한 조각을 신선하고 중간 크기의 배양 접시에 놓고 스테인레스 스틸 평직 시트에서 4cm x 1.5cm 크기의 스트립을 잘라 배양 시스템을위한 금속 그리드를 준비합니다.그런 다음 표준 고정 구멍 펀치를 사용하여 중앙에 구멍을 뚫고 그리드가 중앙 우물을 가로질러 평평하게 맞고 접시 바닥과 평행하게 놓이도록 측면을 구부립니다. 그리드의 모양이 올바르게 형성되면 사용하기 전에 오토클레이브에서 멸균하십시오. 다음으로, 탈수를 방지하기 위해 외부 우물에 2ml의 오토클레이브 물을 추가하여 배양을 위해 중앙 우물 장기 배양 접시를 준비합니다.그런 다음 접시 중앙을 가로질러 멸균 금속 그리드를 배치합니다. 기공 크기가 0.4마이크로미터인 투명 폴리에틸렌 테레프탈레이트 멤브레인 조각을 그리드의 구멍을 덮을 수 있을 만큼 충분히 크게 자릅니다. 그런 다음 혈통 추적이 필요한 경우 선택한 하악 절편이 있는 절단된 멤브레인을 접시에 놓습니다.먼저 바늘 풀러로 유리를 당겨 유리 모세관 바늘을 준비합니다. 그런 다음 바늘 끝을 부러 뜨려 다이 아이 또는 다이 오 등의 친유 성 염료 용액에 끝을 넣고 모세관 작용으로 염료 용액의 일부를 끌어 올립니다. 몇 분 후 채워진 바늘을 홀더에 넣고 입 흡입기에 부착합니다.바늘 끝을 배양 배지에 배치하여 여기에 표시된 치아 여포와 같이 라벨링할 영역에 닿도록 합니다. 그런 다음 소량의 염료를 조직에 옮깁니다. 다음으로, 절편을 형광 현미경 스테이지로 옮기고 절편이 성공적으로 라벨링되었는지 확인합니다.성공적으로 라벨링되면 멤브레인 위로 슬라이스를 조심스럽게 들어 올린 다음 중앙에서 평평하게 슬라이스를 사용하여 멤브레인을 매체 밖으로 옮깁니다. 그런 다음 배지 수준이 멤브레인 수준이 될 때까지 약 1ml의 배양 배지에 있는 그리드 중앙의 원형 구멍 위에 필터를 놓습니다. 이 시점에서 단백질 또는 소분자 억제제를 배지에 추가합니다.또한 최상의 사진을 위해 해부 현미경을 사용하여 0일차의 형태를 기록하기 위해 슬라이스를 이미지화하고 아래에서 광원으로 슬라이스를 봅니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%의 가습한 분위기에서 접시를 유지하고 정기적으로 2-3일에 한 번씩 매체를 교체하십시오. 진행 상황을 추적하기 위해 문화를 계속 이미지화합니다.여기에 표시된 것은 염료 눈 형광 염색으로 표시된 첫 번째 어금니 치아 여포의 발달을 문서화한 일련의 이미지입니다. 이 절편은 E 14.5에서 쥐의 하악골에서 절개된 250미크론 두께의 정면 절편입니다. 검은색 점으로 윤곽선이 표시된 치아는 0일차의 캡 단계에서 시작됩니다.4일째가 되면 치아 세균이 벨 단계에 도달하고 치아 난포 세포가 발달 중인 외부 법랑질 주위에 호를 그리며 퍼지는 것이 보입니다. 상피: 이 기술을 완전히 익히면 배아에서 최종 배양까지 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양에서 장기 발달을 성공적으로 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

정밀하게 절단된 절편을 포함하는 유기형 1차 조직 이식 배양은 3차원(3D) 조직 구조와 천연 조직의 다세포 상호 작용을 나타냅니다. 이 비디오는 조직을 산소와 영양분에 간헐적으로 노출시킬 수 있는 시스템인 회전 배양 장치를 사용하여 쥐 폐 종양 유래 조직 절편을 배양하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 약물 반응 연구를 위해 정밀하게 절단된 폐 종양 절편을 생성하고 배양하는 방법론을 설명합니다.

폐 종양 조직 이식 배양: 정밀하게 절단된 폐 종양 절편을 생성하고 배양하는 절차

이 비디오는 교모세포종 조직에서 유기형 절편 배양의 생성 및 유지를 보여줍니다. 분리된 조직은 아가로스 매트릭스에 내장되고 얇은 절편은 비브라톰을 사용하여 얻습니다. 그런 다음 이러한 절편을 마이크로플레이트 내의 투과성 멤브레인 삽입물에 놓고 장기 유지 관리를 위해 슬라이스 배양 유지 매체에서 배양합니다.

인간 교모세포종 조직으로부터 Slice 배양 생성 및 유지

이 비디오는 치아 생식 치수와 삼차신경절 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 미세유체 장치를 활용하는 방법을 보여줍니다. 미세유체 장치 내부의 조직 배치를 보여주고 장치의 미세 홈을 통해 치아 세균을 향한 삼차 신경돌기 성장에 대한 자세한 시각화를 제공합니다. 또한, 치아 생식 치수로의 신경돌기 확장을 촉진하거나 억제하는 치아 유래 분자 요인의 역할을 강조하며, 이는 효율적인 출생 후 치아 신경 분포를 보장하는 데 중요합니다.

미세유체 공동 배양 시스템을 사용한 치아 세균 및 삼차신경절 상호 작용 분석

공동 배양은 신경과 표적 조직 및 장기 간의 상호 작용을 연구하는 귀중한 방법을 나타냅니다. Microfluidic 체계는 다른 배양 매체에 있는 신경절 및 전체적인 발달 기관 또는 조직을 CO 배양하는 것을 허용해, 따라서 신경세포와 그들의 표적 사이 누화의 생체외 학문을 위한 귀중한 공구를 대표하.

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

우리는 생성, 재배 및 organotypic 조각 murine 폐 종양에서 파생 된의 체계적인 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다. 우리는 또한 슬라이스 두께 대 한 최적화 하는 방법과 종양 조각 치료 약물 농도 선택 하는 방법을 설명 합니다.

설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

배우세요 조직 슬라이스 배양법을 이용한 태아 생쥐 치아 세균 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 계통 추적을 통해 세포 이동을 실시간으로 관찰하여 치아 조직의 역학적 특성을 이해하는 데 활용됩니다.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

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