이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 며칠에 걸쳐 치아 발달을 추적하는 것입니다. 체외 엑스플랜 배양은 태아 마우스의 발달 중인 하악골을 살아있는 조각으로 해부하여 두 번째 단계로 발달 중인 치아 세균을 노출시킴으로써 달성됩니다. 슬라이스를 선택하여 배양 배지 위의 필터에 놓고 발달을 허용하도록 배양합니다.

다음으로 배양 기간 동안 세포 이동을 추적하기 위해 계통 추적자로 절편을 라벨링하고, 엑스플랜 배양 중에 발달하는 치과 조직의 역동적인 특성을 보여주는 결과를 얻습니다. 기존 이식 배양에 비해 이 기술의 주요 장점은 치아 보석과 같은 내부적으로 발달하는 기관이 주변 조직의 맥락에서 발달 전반에 걸쳐 관찰될 수 있다는 것입니다. 기계의 설정이나 조직의 방향이 정확하지 않은 경우 절단 및 선택 단계가 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

먼저, 500ml의 고급 ECCO 변형 이글 배지 F 12에 1%글루타메이트 및 1%페니실린 스트렙토마이신을 첨가하여 배아 장기에 대한 해부 및 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 Takahashi Sumi의 비디오 기사에서 설명했듯이 발달 단계 E 11.5와 E 15.5 사이의 쥐 배아를 해부하고 신선한 배지가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 갓 날카롭게 한 멸균 텅스텐 바늘을 사용하여 배아의 목을 베고 머리를 얼음 위에 미리 냉각된 배지의 새 접시에 옮깁니다.

그런 다음 구강에 바늘을 꽂고 머리 뒤쪽을 임시로 잘라 하악골을 머리에서 분리한다. 분리된 하악골을 절단하기 전에 얼음 위에 미리 냉각된 매체에 보관하십시오. 하악 조직을 절단하기 전에 조직 다지기의 장착 디스크와 블레이드를 70% 에탄올로 청소하고 블레이드가 장착 디스크와 같은 높이에 있는지 확인하십시오.

약 200개의 하악골을 자른 후 칼날을 교체해야 하고, 표본의 나이에 따라 절단 거리를 200에서 400마이크로미터 사이로 설정해야 하며, 치아 세균의 격리가 필요한 E 14.5 배아에 전체 치아 세균이 필요한지 여부에 따라 250마이크로미터의 절단 거리가 사용됩니다. 다음으로, 하악골을 플라스틱 장착 디스크로 옮기고 발달 중인 혀가 정면 가로 방향이 되도록 배열합니다. 앞니를 분리하기 위해 어금니를 절개할 때는 하악골을 통해 시상 절편을 채취합니다.

방향이 올바르게 지정되면 조직 주변에서 여분의 매체를 제거합니다. 여과지를 사용하면 하악골이 약간 구동되어 장착 디스크의 제자리에 고정됩니다. 여과지로 건조시킨 직후 초퍼의 원형 스테인리스 스틸 테이블에 디스크를 놓습니다.

그런 다음 블레이드 힘을 최대로 설정하고 기계를 켠 다음 시작을 누릅니다. 테이블은 왼쪽에서 오른쪽으로 자동으로 이동하며, 동시에 칼날을 운반하는 도마는 분당 최대 200스트로크로 올리고 내립니다. 조직이 완전히 절단되면 기계를 끕니다.

블레이드 암이 올라간 위치에 있는지 확인한 다음 디스크를 제거합니다.블레이드 암 아래에 손가락을 넣거나 기계를 방치하지 마십시오. 조직을 다질 때는 장착 디스크를 가져다가 과도한 건조를 방지하기 위해 디스크의 슬라이스에 즉시 매체를 추가하십시오.

그런 다음 텅스텐 바늘이나 피펫을 사용하여 디스크 바닥에서 슬라이스 조직을 조심스럽게 제거하고 배지의 작은 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 다음으로, 바늘을 사용하여 개별 절편을 분리한 다음 실체 현미경에서 관심 영역을 포함하는 조직 절편을 선택합니다. 선택한 조각을 신선하고 중간 크기의 배양 접시에 놓고 스테인레스 스틸 평직 시트에서 4cm x 1.5cm 크기의 스트립을 잘라 배양 시스템을위한 금속 그리드를 준비합니다.

그런 다음 표준 고정 구멍 펀치를 사용하여 중앙에 구멍을 뚫고 그리드가 중앙 우물을 가로질러 평평하게 맞고 접시 바닥과 평행하게 놓이도록 측면을 구부립니다. 그리드의 모양이 올바르게 형성되면 사용하기 전에 오토클레이브에서 멸균하십시오. 다음으로, 탈수를 방지하기 위해 외부 우물에 2ml의 오토클레이브 물을 추가하여 배양을 위해 중앙 우물 장기 배양 접시를 준비합니다.

그런 다음 접시 중앙을 가로질러 멸균 금속 그리드를 배치합니다. 기공 크기가 0.4마이크로미터인 투명 폴리에틸렌 테레프탈레이트 멤브레인 조각을 그리드의 구멍을 덮을 수 있을 만큼 충분히 크게 자릅니다. 그런 다음 혈통 추적이 필요한 경우 선택한 하악 절편이 있는 절단된 멤브레인을 접시에 놓습니다.

먼저 바늘 풀러로 유리를 당겨 유리 모세관 바늘을 준비합니다. 그런 다음 바늘 끝을 부러 뜨려 다이 아이 또는 다이 오 등의 친유 성 염료 용액에 끝을 넣고 모세관 작용으로 염료 용액의 일부를 끌어 올립니다. 몇 분 후 채워진 바늘을 홀더에 넣고 입 흡입기에 부착합니다.

바늘 끝을 배양 배지에 배치하여 여기에 표시된 치아 여포와 같이 라벨링할 영역에 닿도록 합니다. 그런 다음 소량의 염료를 조직에 옮깁니다. 다음으로, 절편을 형광 현미경 스테이지로 옮기고 절편이 성공적으로 라벨링되었는지 확인합니다.

성공적으로 라벨링되면 멤브레인 위로 슬라이스를 조심스럽게 들어 올린 다음 중앙에서 평평하게 슬라이스를 사용하여 멤브레인을 매체 밖으로 옮깁니다. 그런 다음 배지 수준이 멤브레인 수준이 될 때까지 약 1ml의 배양 배지에 있는 그리드 중앙의 원형 구멍 위에 필터를 놓습니다. 이 시점에서 단백질 또는 소분자 억제제를 배지에 추가합니다.

또한 최상의 사진을 위해 해부 현미경을 사용하여 0일차의 형태를 기록하기 위해 슬라이스를 이미지화하고 아래에서 광원으로 슬라이스를 봅니다. 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%의 가습한 분위기에서 접시를 유지하고 정기적으로 2-3일에 한 번씩 매체를 교체하십시오. 진행 상황을 추적하기 위해 문화를 계속 이미지화합니다.

여기에 표시된 것은 염료 눈 형광 염색으로 표시된 첫 번째 어금니 치아 여포의 발달을 문서화한 일련의 이미지입니다. 이 절편은 E 14.5에서 쥐의 하악골에서 절개된 250미크론 두께의 정면 절편입니다. 검은색 점으로 윤곽선이 표시된 치아는 0일차의 캡 단계에서 시작됩니다.

4일째가 되면 치아 세균이 벨 단계에 도달하고 치아 난포 세포가 발달 중인 외부 법랑질 주위에 호를 그리며 퍼지는 것이 보입니다. 상피: 이 기술을 완전히 익히면 배아에서 최종 배양까지 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양에서 장기 발달을 성공적으로 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.