Name: 실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 실험성 자가면역 뇌척수염(EAE) 성인 마우스에 유리 척수 윈도우를 이식하는 방법을. 척수 클램프 삽입과 실리콘 엘라스토머를 이용한 윈도우 고정, 그리고 장기간 투광 현미경 관찰을 통해 세포 역학을 연구할 수 있습니다.

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C. Ricard, M-C.에게 감사드립니다. 유용한 토론을 해준 Amoureux, A. Jaouen, S. Meijia-Gervacio; M. Hocine 및 C. Meunier, 기술 지원을 위한 IBDML의 동물 및 PicSIL 이미징 시설 직원. 이 작업은 Centre National de la Recherche Scientifique의 기관 보조금과 ARSEP(Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque)(GR 및 K.K.F), Agence Nationale de la Recherche(ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau(FRC), Institut de Recherche sur la Moelle Epinière(IRME)(FD로)의 보조금으로 지원되었습니다. K.K.F.는 ARSEP 펠로우십의 지원을 받았습니다. 이미징은 IBDML의 PIcSIL 이미징 시설에서 수행되었습니다.

1. 창 및 지지 구조 준비
<ol>
	<li>창 준비 - 이식을 위해 다양한 크기(너비 = 1.8-2.2mm, 길이 = 4.5-5.2mm)의 여러 창을 준비합니다.
	<ol>
		<li>커버 유리를 절단하기 위해 수정 된 드릴 버 만들기 - 충분한 양의 치과 용 시멘트를 사용하여 드릴 버를 샤프트에 부착합니다 (이 경우 구형 불독 클램프). 더 쉽게 다룰 수 있도록 버가 샤프트에 대해 ~45°인지 확인하십시오. 
		참고: 다이아몬드 스크라이브는 커버 유리를 절단하는 데에도 적합합니다.</li>
		<li>슬라이드 A 만들기 - 표준 현미경 슬라이드를 사용하여 유리를 통해 눈금자를 볼 수 있도록 슬라이드 바닥에 짧은 눈금자 종이(~2cm)를 테이프로 붙입니다. 다음으로, 눈금자의 0mm 표시 가장자리를 따라 테이프 조각을 배치하여 다음 단계에서 커버 유리의 고정 장치 역할을 합니다.</li>
		<li>수정된 드릴 버, 슬라이드-A 및 수정되지 않은 현미경 슬라이드(슬라이드-B)를 사용하여 커버 유리(두께 1.5번)를 슬라이드-A의 0mm 표시에 놓습니다. 슬라이드-B를 사용하여 커버 유리를 제자리에 고정하고 의도한 절단선에 대한 지그로 사용합니다. 커버 유리를 약 5 x 22mm의 긴 직사각형으로 자릅니다. 절단된 유리를 90° 회전하고 사각형을 ~2 x 5mm의 더 작은 사각형으로 자릅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>스테이플 변형 - 창문을 척추에 지지하고 고정하기 위해 두 개의 수정된 스테이플이 이식됩니다(섹션 2.7-8 참조).
	<ol>
		<li>표준 작은 스테이플(크라운 = 8mm, 다리 = 4mm)을 사용하여 다리 끝이 거의 닿도록 크라운 중앙을 ~90° 구부립니다.</li>
		<li>다리의 말단 절반이 평행이 되도록 중간 지점에서 다리 끝을 바깥쪽으로 ~45° 구부립니다.</li>
		<li>다리의 말단 절반을 스테이플의 평면에 대해 위쪽으로 ~30° 구부립니다. 멸균을 위해 수술하기 전에 변형된 스테이플을 에탄올에 넣습니다. 
		참고: 스테이플은 에틸렌 옥사이드를 사용하여 멸균하거나 오토클레이브할 수도 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>클립 수정 - 챔버의 일부로 이식하고(섹션 2.9-10 참조) 수술 및 이미징을 위한 고정 클립 역할을 할 수정된 클립 하나를 준비합니다.
	<ol>
		<li>표준 25mm 클립을 사용하여 작은 구부러진 부분을 제거하여 길쭉한 U자형을 만듭니다.</li>
		<li>플라이어나 니들 드라이버를 사용하여 팁을 평행하게 유지하면서 굽힘의 직경을 ~2mm로 줄입니다.</li>
		<li>굽힘에서 약 8-10mm에서 팁을 바깥쪽으로 ~90° 구부립니다. 평평하게 놓이도록 필요한 조정을 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 창 이식
참고: 모든 수술 및 동물 관리 절차는 유럽 공동체 이사회 지침에 따라 수행되었으며 프랑스 국립 동물 연구 위원회(승인 번호 13,300)의 승인을 받았습니다.
<ol>
	<li>마우스 마취(Ket/Xyl, 유도 용량: 120mg/kg, 12mg/kg, 추가 용량, 40mg/kg, 4mg/kg)하고 눈에 연고를 바릅니다.</li>
	<li>흉부 혹을 중심으로 약 ~2cm 너비, ~5cm 길이의 등을 면도하고 노출된 피부를 요오드 비누와 요오드 용액으로 청소합니다. 90% 에탄올을 분사하여 장갑을 청소하십시오. </li>
	<li>조직 가위를 사용하여 척추 T11 위의 등쪽 피부를 세로로 L1(~2cm)까지 자릅니다. 메스를 사용하여 T11에서 L1까지 가시돌기와 횡돌기 사이를 양측으로 세로로 절개합니다.참고: 장갑이나 기구가 동물의 털이나 피부에 닿은 경우 90% 에탄올 또는 Germ-X와 같은 차가운 살균기를 사용하여 장갑이나 기구를 다시 세척합니다.</li>
	<li>Suspend the mouse in the spinal fork stereotaxic(척추 갈림뼈에 마우스 매달기) - 오른쪽 상단 척추 갈림쇠를 제자리에 고정하여 시작합니다. Adson 집게를 사용하여 T11을 잡고 T11 횡돌기를 고정된 척추 갈래 위에 놓습니다. 척추뼈를 제자리에 고정한 상태에서 반대쪽 척추 갈퀴를 반대쪽 횡돌기 아래에 고정합니다.</li>
	<li>2.4단계와 동일한 절차를 사용하여 척추 갈래 내에 L1을 위치시킵니다.</li>
	<li>메스(23번)를 사용하여 T11에서 L1까지 가시돌기와 횡돌기 사이의 근육을 부드럽게 긁어내어 얇은 판이 명확하게 보이도록 합니다. T11의 척추경을 더 잘 보려면 횡돌기 끝에서 가로로 돌출된 힘줄을 자릅니다.</li>
	<li>수정된 스테이플을 PBS로 헹구고 스테이플의 끝을 T11 및 L1의 척추 척추경 측면에 삽입하여 척추경에 가볍게 닿도록 팁 사이의 거리를 조정합니다. 
	참고: 덱사메타손(0.1%), 페니실린(1,000U/ml) 및 스트렙토마이신(1mg/ml)이 함유된 PBS만 사용하여 수술 후 염증을 줄이고 창문 투명도를 개선하십시오.</li>
	<li>각 삽입 지점에서 작은 한 방울의 시아노아크릴레이트로 스테이플을 제자리에 붙이고 척추 갈래에서 마우스를 제거합니다.</li>
	<li>피부의 절단된 가장자리와 제거된 척추 주위의 노출된 근육에 시아노아크릴레이트를 얇게 바르고 척추뼈를 접착하지 않도록 주의합니다. 수정된 클립의 끝을 구부려 이식된 스테이플의 돌출된 부분 아래로 들어가도록 하고 격리된 척추의 장축과 평행하게 놓고 이 위치에 둡니다.</li>
	<li>피부-근육 계면에서 시작하여 노출된 척추를 제외한 전체 개구부를 덮도록 여러 층의 치과용 시멘트를 바르고 치과용 시멘트 내부에 종이 클립을 단단히 이식해야 합니다.</li>
	<li>치과용 시멘트가 경화되면(5-15분) 이식된 종이 클립의 노출된 부분을 '클립 홀더'에 마우스에 부착합니다. 겸자를 사용하여 노출된 척추뼈의 가시돌기와 얇은 판 사이의 근육 및 기타 연조직을 제거합니다. 
	참고 : 클립/챔버에 스트레스를 주지 않고 클립의 노출된 부분을 단단히 잡을 수 있고 수술 내내 마우스의 방향을 바꾸도록 조작할 수 있는 모든 장치를 '클립 홀더'로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>뼈 제거 드릴을 사용하여 T12와 T13의 층을 양측으로 얇게 만듭니다. 등뼈를 제거하려면 뭉툭한 집게로 척추돌기를 잡고 척수를 향해 아래쪽으로 힘을 가하지 않도록 주의하면서 들어 올립니다. 뼈가 쉽게 떨어져 나가지 않으면 가시돌기가 쉽게 제거될 때까지 얇은 판을 계속 얇게 만듭니다.</li>
	<li>뼈 제거 드릴을 사용하여 척추의 측면 가장자리 모양을 계속 형성하여 창에 대한 지지 구조를 형성합니다. 경막에 닿는 모든 작은 뼈 조각을 뭉툭한 집게를 사용하여 부드럽게 제거합니다. PBS를 사용하여 경막의 습도를 유지하십시오.</li>
	<li>준비된 창문 중 후판 절제술 개구부보다 약간 더 넓은 창문 중 하나를 선택하고 노출된 뼈에 얼마나 잘 놓여 있는지 테스트합니다. 이상적으로, 창은 양쪽 척추뼈에 양측으로 놓여 창의 중앙이 경막에 닿도록 합니다(그림 1a). 그러나 창은 창을 척수 쪽으로 밀 때에도 척수를 압박해서는 안 됩니다. 창이 불균형하거나 경막 위에 있으면 2.13단계를 반복합니다.</li>
	<li>후판 절제술이 만족스러우면 PBS에 적신 오토클레이브 티슈 페이퍼의 작은 조각을 경막의 건조를 방지하기 위해 척수에 놓고 마우스를 한쪽에 둡니다.</li>
	<li>창문 청소 - 창문을 창문 클리너 용액에 몇 초 동안 넣으십시오. 현미경 렌즈 티슈 조각을 사용하여 창을 닦아 말리십시오. 수술용 현미경으로 창문이 깨끗한지 확인하고 그렇지 않은 경우 청소 과정을 반복합니다. 2.19단계에서 창을 빠르게 검색하고 배치할 수 있도록 쉽게 접근할 수 있는 깨끗한 곳에 창을 배치합니다.</li>
	<li>마우스를 회수하고 티슈 페이퍼를 제거합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 경막에서 이물질을 부드럽게 제거하고 경막이 약간 끈적해질 때까지 건조시킵니다.</li>
	<li>실리콘(Kwik-sil) 믹서 튜브를 빠르게 채우고 팁에서 기포가 나오지 않을 때까지 실리콘을 깨끗한 슬라이드로 밀어냅니다. 노출된 척수의 정중선을 따라 작은 실리콘 구슬을 즉시 투여합니다.</li>
	<li>뭉툭한 집게를 사용하여 청소된 창문을 회수하고 즉시 실리콘 위에 놓습니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 창에 약간의 압력을 가하여 실리콘을 창 가장자리에 펴 바르고 ~1분 동안 제자리에 유지합니다. 
	참고: 혼합하기 전에 실리콘을 27°C 이하에서 보관해야 하며, 그렇지 않으면 경화 시간이 크게 증가할 수 있으며 창이나 경막에 부착되지 않아 광학 선명도가 떨어질 수 있습니다.</li>
	<li>창문에서 압력을 천천히 해제하십시오. 창이 움직이지 않으면 즉시 2.21단계로 진행합니다. 그러나 압력이 해제될 때 창이 올라가면(즉, 척추뼈가 움직인다) 창에 압력을 가하여 제자리에 고정시키면서 2.21단계로 진행한다.</li>
	<li>cyanoacrylate, 창의 꼬리 및 꼬리를 적용합니다. 시아노아크릴레이트가 창의 꼬리 가장자리와 꼬리 가장자리를 덮지 않는 경우 이쑤시개를 사용하여 액체 시아노아크릴레이트의 일부를 이 가장자리 위로 안내합니다. 다음으로, 창의 측면 가장자리를 따라 접착제를 안내하여(그림 1a) 주변 근육을 모두 덮습니다. 참고: 시아노아크릴레이트는 창의 바깥쪽 가장자리 표면을 덮어야 합니다. 시아노아크릴레이트가 너무 많으면 광학적 선명도가 손상될 수 있으며, 시아노아크릴레이트가 충분하지 않으면 실리콘과 창 사이에 기포가 생깁니다.</li>
	<li>시아노아크릴레이트를 보호하고 챔버의 구조적 무결성을 높이려면 시아노아크릴레이트로 덮인 모든 부위에 치과용 시멘트를 바르십시오(그림 1a). 시아노아크릴레이트와 마찬가지로 꼬리 가장자리에서 시작하여 작은 나무 막대기를 사용하여 창 가장자리를 따라 치과 시멘트를 안내합니다.</li>
</ol>
3. 수술 후 관리, EAE 유도 및 창 유지 관리
<ol>
	<li>덱사메타손(0.2mg/kg)과 리마딜(5mg/kg)을 골반 부위에 주사합니다. 중첩 재료가 있는 따뜻한 케이지(~26°C)로 마우스를 옮깁니다. 생쥐는 완전히 움직일 수 있어야 하고, 새장을 탐색하고, 마취제의 영향이 완전히 가라앉은 후(보통 2-3시간) 털을 손질해야 합니다. 동물을 개별적으로 수용하고 처음 1-2일 동안은 음식과 물에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.마우스가 마취제에서 회복되기 시작하면 부프레노르핀(0.05mg/kg) sq를 주사합니다. 마취제에서 완전히 회복된 후 마우스는 통증의 징후를 보이지 않아야 합니다.참고: 마취제에서 완전히 회복되면 통증이나 비정상적인 운동 활동의 징후는 창이 올바르게 이식되지 않았음을 나타냅니다.</li>
	<li>수술 후 첫 10일 동안 덱사메타손(0.2mg/kg)과 리마딜(5mg/kg)을 2일 간격으로 투여합니다(그림 1a). 생쥐에게 창문을 주입하려면 유도실에서 이소플루란으로 동물을 가볍게 진정시킵니다(공기 중 ~1.75% 이소플루란을 1-2분 동안 사용). 챔버에서 마우스를 제거하고 즉시 약물을 주입하십시오. 마우스는 <1분 후에 완전히 깨어나야 합니다. 
	참고: 임플란트된 창문이 있는 마우스는 임플란트에서 피부가 분리될 수 있으므로 스크러핑하지 마십시오. 생쥐가 앞발로 케이지 뚜껑을 잡고 뒷다리를 부드럽게 들어 올리도록 하여 진정제 없이 i.p.를 주입할 수 있습니다. 그러나 이 위치에서 마우스는 때때로 당겨져 이식된 창에 스트레스를 줍니다. 이로 인해 창과 척수 사이에 출혈이 발생하여 광학적 선명도가 손상될 수 있습니다.</li>
	<li>EAE는 항염증 치료 중단 후 2-3주(수술 후 ~3-4주)에 유도될 수 있습니다. 3.2단계에 설명된 대로 마우스를 가볍게 진정시킵니다. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 코에 이소플루란 마스크를 씌워 진정 상태를 유지합니다.</li>
	<li>MOG35-55 펩타이드(800μg의 결핵균을 함유한 Freund's adjuvant의 75μg)를 3개의 다른 sq 위치(양측으로 대퇴골 위, 꼬리 기저부)에 주입하고 백일해 독소(400ng) i.p.14,15<br />
	참고: EAE가 있는 마우스는 창문만 있는 마우스에 비해 추가 관리가 필요합니다. 매일 EAE 마우스의 무게를 측정하고 항상 음식과 물에 쉽게 접근할 수 있는지 확인하십시오. 동물의 수분과 체중을 유지하기 위해 3% 아가로스 젤리가 함유되어 있습니다. 포도당(1-3%)을 젤리에 첨가하여 칼로리를 추가할 수도 있습니다.</li>
	<li>EAE 유도 2일 후, 3.2단계에서 설명한 진정 프로토콜을 반복하고 백일해 독소(400ng) i.p.를 두 번째 투여합니다.</li>
	<li>척수를 이미지화하려면 먼저 3.2단계에서 설명한 대로 동물을 진정시키고 케타민/자일라진(100mg/kg, 10mg/kg) ip로 가볍게 마취합니다. 이것은 ~ 1시간의 이미징을 제공합니다.</li>
	<li><2시간 동안 지속되는 이미징 세션의 경우, 45-60분마다 케타민/자일라진(50mg/kg; 5mg/kg)의 보조 주사로 광 마취를 유지할 수 있습니다. 또는 더 긴 이미징 세션의 경우 마우스에 이소플루란(가습된 공기 중 0.75-1.25% 이소플루란)을 지속적으로 진정시킬 수 있습니다. 
	참고: 창문은 티슈 모서리나 면봉으로 잔여물을 부드럽게 닦아내어 수술용 현미경으로 청소할 수 있습니다. 알코올은 일부 유형의 치과 시멘트를 분해할 수 있고 척수를 냉각시킬 수 있으므로 창문을 청소할 때 알코올을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>가볍게 마취되면 마우스는 이식된 클립의 노출된 부분에 의해 클립 홀더에 단단히 부착됩니다(그림 1b).</li>
	<li>척수는 홀더 내 클립의 위치를 조정하고, 홀더의 위치를 조정하고, 스테이지의 위치를 조정하여 대물 렌즈에 수직으로 정렬됩니다. 척수의 등쪽 표면은 빠르게 이미지화되고 등쪽 혈관 구조는 척수의 방향을 결정하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 시간 경과에 따른 EAE의 동적 진행을 연구하기 위해 성체 마우스의 노출된 척수 위에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명했습니다. 유사한 유리창 이식 접근법이 척수 손상 모델을 연구하는 데 사용되었으며13 교모세포종, 수막염 또는 정상 척수의 세포 생리학과 같은 다른 척수 병리를 연구하는 데에도 유용할 수 있습니다. 우리의 방법에서는 유리창을 이 외골격에 고정한 상태에서 단단히 고정된 4개의 척추뼈 주위에 외골격을 구축하여 척추 안정화를 달성했습니다. 이 실험에서 창은 척추 수준 T13-L1에 이식되었습니다. 일부 예비 실험을 위해 우리는 더 많은 주둥이와 꼬리 수준에 창을 이식했지만 이러한 창의 신뢰성에 대한 자세한 조사는 아직 수행되지 않았습니다. 척추 내강 내부의 척추 조직 움직임은 경막을 투명한 실리콘의 얇은 층으로 유리에 붙임으로써 감소되었습니다. 따라서 이 시멘트, 접착제 및 실리콘 접근 방식은 챔버의 모든 지점과 모든 동물에 대해 단단히 밀봉할 수 있는 고유한 맞춤 제작 가능성을 제공합...

다발성 경화증은 진행성 수초와 축삭 손상을 일으키는 중추신경계의 자가 면역 질환입니다. CNS 자가면역 탈수초성 질환에 대한 표준 연구 모델은 성체 설치류의 EAE입니다. 그러나 EAE 진행의 기저에 있는 동적 세포 이벤트는 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 한 가지 접근법은 생체 내 이광자 현미경 검사를 사용하여 EAE가 있는 성인 마우스의 척수에서 장기간 동안 형광 마커로 세포 집단을 시각화하는 것입니다.
생체 내 이광자 현미경 검사는 세포 내 해상도1로 살아있는 동물에서 세포 생리학, 세포 상호 작용 및 질병의 동적 진행을 연구하는 강력한 방법입니다. 그러나 이 접근 방식의 주요 장애물은 관심 영역에 대한 광학 액세스가 필요하다는 것입니다. 예를 들어, 두개골 유리창은 몇 주에 걸쳐 뇌의 동일한 미세 구조를 반복적으로 이미징하는 잘 정립된 방법론입니다2,3. 그러나 이 방법론을 척수 영상에 적용하는 것은 간단하지 않으며 관절이 있는 척추 내에서 등쪽 척추 조직을 고정하기 위해 몇 가지 기술적 수정이 필요합니다.
이전에는 척수에 대한 광학적 접근을 위해 각 영상 세션이 시작될 때 척수를 외과적으로 다시 노출시키고 각 세션이 끝날 때 피부를 봉합해야 했습니다4-12. 이러한 반복적인 수술은 동물에게 트라우마를 입히고, 영상 촬영 횟수와 길이를 제한하며, 기계적 교란을 통한 척수 손상 및 염증과 같은 수술 관련 인공물의 가능성을 높입니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 우리는 최근 반복적인 수술 없이 장기간 생체 내 이광자 현미경 검사 실험을 위해 외상성 척수 손상을 입은 성인 형광 형질전환 마우스의 노출된 척수에 유리창을 이식하는 프로토콜을 개발했습니다13. 여기에서 우리는 성체 마우스에서 EAE의 진행의 기저에 있는 동적 세포 이벤트를 연구하기 위한 응용 프로그램의 맥락에서 이식 프로토콜의 자세한 적응을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>뼈 제거 드릴</td><td>World Precision Instruments</td><td>IDEAL MICRO-DRILL</td><td>Harvard Apparatus에서도 판매합니다. 고품질 수술용 뼈 드릴이면 충분합니다.</td></tr><tr><td>드릴 버 (#1/4 또는 1/2 카바이드 라운드 버)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860 (#1/4) 501860 (#1/2)</td><td>Harvard</td></tr><tr><td>Apparatus Staples</td><td>Lyreco</td><td>5.002.567</td><td>크라운 = 8 mm 다리 = 4 mm</td></tr><tr><td>페이퍼클립</td><td></td><td></td><td>모든 표준 25 mm 페이퍼클립</td></tr><tr><td>니들 드라이버</td><td>Fine Science Tools</td><td>12003-15</td><td></td></tr><tr><td>티슈 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Adson 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>1 x 2 치아</td></tr> 무<tr><td>딘 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>척추 포크</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724813</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>GACD</td><td>12-565 & 12-568</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>은 Coherent Scientific 및 Fisher Scientific을 통해서도 사용할 수</td></tr> 있습니다: <tr><td>Cyanoacrylate</td>, <td>Eleco-EFD</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>, Zeiss</td><td>7MP</td><td>당사의 현미경은 직립 구성이며 5개의 NDD 검출기가 장착되어 있습니다.</td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm</td><td>작동 거리 = 1.8mm</td></tr></tbody></table>

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 windows를 이식

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

성체 설치류의 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증과 같은 자율신경 탈수초성 질환을 연구하기 위한 표준 실험 모델입니다. 여기에서는 생체 내 현미경 검사에 적합하고 EAE를 가진 살아있는 성인 마우스에서 세포 내 해상도를 가진 척수 세포 구조의 역학을 연구하는 데 적합한 저렴하고 재현 가능한 유리창 이식 프로토콜을 제시합니다. 간단히 말해서, 우리는 수술을 통해 척추 T12-L2를 노출시키고 시아노아크릴레이트와 치과용 시멘트의 조합을 사용하여 노출된 척추 주위에 챔버를 구성합니다. T13에서 L1까지 후판 절제술을 시행하고, 노출된 척수의 등쪽 표면에 투명한 실리콘 엘라스토머의 얇은 층을 적용합니다. 변형된 유리 커버 슬립은 유리가 척수에 직접 닿지 않도록 주의하면서 노출된 척수 위에 이식됩니다. 창과 척수 사이의 염증 세포의 침투를 줄이기 위해 이식 후 첫 10일 동안 2일마다(윤리위원회의 권고에 따라) 항염증 치료를 시행합니다. EAE는 항염증 치료 중단 후 2-3주 후에 유발됩니다.
이 접근법을 사용하여 창문을 이식한 동물의 87%에서 EAE를 성공적으로 유도했으며, Thy1-CFP-23 마우스(등쪽 척수의 파란색 축삭돌기)를 사용하여 EAE 진행 전반에 걸쳐 축삭 손실을 정량화했습니다. 종합하면, 이 프로토콜은 다양한 세포 집단의 동원과 상호 작용 역학, 세포 내 해상도 및 장시간 동안 연구를 수행하는 데 유용할 수 있습니다. 이 생체 내 이미징 방식은 EAE와 같은 자가면역 탈수초성 질환을 치료하기 위한 치료 전략을 개발하기 위한 유용한 도구입니다.

만성적으로 이식된 유리창을 생체 내 이광자 현미경 및 EAE 모델과 결합하여 사용하는 것은 자가면역 탈수초성 질환 병리의 기저에 있는 세포 메커니즘을 이해하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 본 연구의 이식 방법을 사용하여 EAE 유도 시점에 대부분의 유리창이 투명했으며, EAE 진행 과정 전반에 걸쳐 투명함이 유지됨을 확인하였습니다(그림 1c). 이러한 접근 방식을 통해 유리창이 이식 후 전체 기간(평균 ~68 d±7 s.e.m.; n = 21마리 생쥐) 동안 투명하게 유지되었으며, 당사의 실험 결과 EAE 유도 전후로 36일 동안 최대 12회까지 이광자 이미징을 반복적으로 수행할 수 있었습니다.
이 접근 방식의 타당성을 테스트하는 첫 번째 단계로, 윈도우를 이식한 동물과 이식하지 않은 동물의 EAE 임상 진행 상황을 비교하였습니다(그림 1d). EAE 마우스에서 임상 증상의 발현이 약간 지연되는 것을 확인하였으나...

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

이 절차의 전반적인 목표는 종방향 생체 내 두 광자 현미경으로 실험적 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 척수와 성체 마우스의 창 보기를 만드는 것입니다. 이것은 수술 및 영상 촬영을 위해 척추 뼈를 지지하기 위해 먼저 척추 클램프를 이식함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 척수를 노출시키고 유리창을 지지하기 위해 척추의 측면 가장자리를 준비하는 것입니다.그런 다음 창과 경막 사이에 얇은 실리콘 엘라스토머 층을 창에 이식합니다. 이식 후 몇 주 후의 마지막 단계는 이식된 마우스에서 EAE를 유도하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 두 개의 광자 현미경을 사용하여 EAE 마우스의 척수에서 세포 분포 및 세포 상호 작용의 시공간 변화를 보여줄 수 있습니다.이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 이 방법은 시간에 민감하고 높은 수준의 정밀도가 필요하기 때문에 배우기 어려울 수 있습니다. 수술마다 성체 쥐를 마취하고 눈 연고 면도를 하는 것으로 시작합니다.등은 폭 약 2cm, 길이 5cm로 흉부 혹을 중심으로 노출된 피부를 요오드 비누와 요오드 용액으로 청소합니다. 조직 가위를 사용하여 T 11에서 L 1까지 약 2cm 높이로 등쪽 피부를 세로로 자릅니다. 다음으로, 메스를 사용하여 T 11에서 L 1까지 가시돌기와 횡돌기 사이를 양측 세로 절개를 만듭니다.먼저 오른쪽 상단 척추 갈래를 제자리에 고정하여 척추 갈림길에 마우스를 매달아 놓습니다. 둘째, 애드인 집게를 사용하여 T 11을 잡고 척추 포크 내에서 L 1과 동일한 절차를 사용하여 고정된 척추 포크 위에 T 11 횡돌기를 배치합니다. 이제 숫자 23 메스를 사용하여 T 11에서 L 1로 가시 돌기와 횡돌기 사이의 근육을 부드럽게 긁어내어 레모네이드가 명확하게 보이도록 합니다.T 11의 척추경을 더 잘 보려면 가로 돌기의 끝에서 돌출된 힘줄을 자릅니다. 변형된 스테이플을 보충된 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 스테이플의 끝을 T 11 및 L 1의 척추 척추경 측면에 삽입합니다.척추경에 가볍게 닿도록 팁 사이의 거리를 조정하고 각 삽입 지점에 시아노아크릴레이트를 약간 떨어뜨려 스테이플을 제자리에 붙이고 척추 갈래에서 마우스를 제거합니다. 이제 피부의 절단된 가장자리와 제거된 척추 주위의 노출된 근육에 시아노아크릴레이트를 얇게 바르십시오. 척추뼈에 접착제를 붙이지 않도록 주의하세요.수정된 클립의 끝을 구부려 이식된 스테이플의 돌출 부분 아래로 들어가고 격리된 척추의 장축과 평행하게 놓고 이 위치에 두도록 합니다. 피부 근육 경계면에서 시작하여 노출된 척추를 제외한 전체 개구부를 덮도록 여러 층의 치과용 시멘트를 바르고 치과용 시멘트 내부에 클립을 단단히 이식하도록 주의합니다. 5분에서 15분 후에 치과용 시멘트가 경화됩니다.그런 다음 클립이나 챔버에 스트레스를 주지 않고 클립의 노출된 부분을 단단히 잡을 수 있는 장치에 마우스를 부착합니다. 겸자를 사용하여 가시돌기와 노출된 척추뼈의 라미네이트 사이의 근육 및 기타 연조직을 제거합니다. 이제 뼈 제거 드릴을 사용하여 T 12와 T 13을 양측으로 라미네이트합니다.그런 다음 등뼈를 제거합니다. 뭉툭한 집게로 척추 돌기를 잡고 들어 올리되 척수에 아래쪽으로 힘을 가하지 않도록 주의하십시오. 뼈가 쉽게 떨어져 나가지 않으면 척추가 처리되어 쉽게 제거 될 때까지 얇은 판을 계속 얇게하십시오.뼈 제거 드릴을 사용하여 척추의 측면 가장자리 모양을 계속 형성하여 지지 구조를 형성합니다. 창문의 경우. 경막 물질에 닿는 모든 작은 뼈 조각을 부드럽게 제거합니다.뭉툭한 집게를 사용하여 경막 물질의 습도를 유지하십시오. PBS를 사용하여 준비된 창문 중 후판 절제술 개구부보다 약간 넓은 창 중 하나를 선택하고 노출된 뼈에 얼마나 잘 놓여 있는지 테스트합니다. 이상적으로, 창은 양쪽 척추에 양측으로 놓여 창의 중앙이 경막 물질에 닿도록 합니다.그러나 창은 창을 척수 쪽으로 밀 때에도 척수를 압박해서는 안 됩니다. 창이 불균형하거나 경막 위에 있으면 척추의 측면 가장자리를 더 형성합니다. 후판 절제술이 만족스러우면 PBS에 적신 작은 티슈 조각을 척수에 올려 경막의 건조를 방지하고 마우스를 한쪽에 둡니다.창문을 세척액에 몇 초 동안 담그십시오. 그런 다음 현미경 렌즈 티슈 조각을 사용하여 수술용 현미경으로 창문을 닦습니다. 창이 깨끗한지 확인합니다.그렇지 않으면 청소 과정을 반복하십시오. 그런 다음 이식할 준비가 된 깨끗한 장소에 창을 보관하십시오. 실리콘 엘라스토머를 척수에 도포한 다음 창을 배치하는 것은 빠르게, 이상적으로는 15초 이내에 완료되어야 합니다.모든 자료에 쉽게 접근할 수 있도록 작업 공간을 배치하는 것이 매우 중요합니다. 먼저 마우스에서 티슈 페이퍼를 제거하고 뭉툭한 집게를 사용하여 경막에서 이물질을 부드럽게 제거하고 경막이 약간 끈적해질 때까지 건조시킵니다. 이제 섭씨 27도 미만에서 실리콘 믹서 튜브에 실리콘을 빠르게 채우고 거품이 나타나지 않을 때까지 깨끗한 슬라이드에 실리콘을 압출합니다.그런 다음 노출된 척수의 정중선을 따라 작은 실리콘 구슬을 즉시 투여합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 깨끗한 창을 집어 실리콘 위에 놓습니다. 겸자 사용.실리콘이 창 가장자리에 퍼지도록 창에 약간의 압력을 가하고 약 1분 동안 제자리에 고정됩니다. 창문에서 압력을 천천히 해제하십시오. 압력이 해제되었을 때 창이 올라오면 창에 압력을 가하여 제자리에 고정하십시오.다음으로, cyanoacrylate, rostral 및 coddle을 창문의 coddle을 적용합니다. 이쑤시개를 사용하여 필요한 경우 시아노아크릴레이트를 가장자리로 안내합니다. 그런 다음 창의 측면 가장자리를 따라 접착제를 사용하여 주변 근육을 모두 덮습니다.창의 바깥쪽 가장자리만 덮지 않으면 광학 선명도가 손상됩니다. 접착제가 충분하지 않으면 실리콘과 창 사이에 기포가 생겨 시아노아크릴레이트를 보호하고 챔버의 구조적 무결성을 높일 수 있습니다. 시아노아크릴레이트로 덮인 모든 부위에 치과용 시멘트를 바르십시오.시아노아크릴레이트와 마찬가지로 및 코들 가장자리에서 시작하여 창의 가장자리를 따라 치과 시멘트를 안내합니다. 먼저 덱사메타손과 릴을 10일 동안 이틀에 한 번씩 골반 부위에 주사합니다. 덱사메타손과 릴을 주입하여 마우스에 이식된 창을 주입합니다.먼저, 유도 챔버에서 iso 불소로 가볍게 진정시킵니다. 이미지를 촬영하기 위해 이식된 창문이 있는 마우스를 긁지 마십시오., 마우스를 가볍게 마취하고 이식 방법을 사용하여 이식된 클립의 노출된 부분을 클립 홀더에 단단히 부착하십시오. EAE 유도 시점에는 대부분의 창이 명확했으며 EAE 진행 전반에 걸쳐 명확하게 유지됩니다.2개의 광자 이미징은 36일 동안 최대 12회까지 실현 가능했습니다. 창문을 이식한 동물과 이식하지 않은 동물의 EAE 임상 진행을 비교한 결과, EAE 마우스는 임상 징후의 발병이 약간 지연되었습니다. 그러나 발병 후에는 전반적인 진행 정도나 최고 임상 점수에 차이가 없었다.EAE로 대표되는 축삭 퇴행의 타임라인은 생체 내 두 광자 현미경에 의해 EAE 진행 과정에서 척수에서 검사되었습니다. 국소 팽창이 있는 축삭과 같이 다양한 퇴행 단계에 있는 축삭뿐만 아니라 다치지 않은 축삭돌기가 많았습니다. 단편화된 축삭돌기도 관찰되었습니다.임상 징후의 시작과 관련하여 여러 시점에서 손상되지 않은 축삭돌기의 평균 수는 5개로 계산되었습니다. 마우스 수는 관심 영역 내의 혈관 마커로 방향을 지정하여 세션에서 세션으로 동일한 영역 내에서 이루어졌습니다. 국소 팽창이 있는 축삭돌기의 수는 단편화된 축삭돌기와 마찬가지로 정량화되었습니다.EAE 임상 징후가 시작됨에 따라 손상된 축삭돌기의 수가 증가했으며 축삭돌기 악화는 부종에서 나중에 단편화로 진행되었습니다. 요점: 창문 이식 수술을 마스터하면 제대로 진행된다면 약 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 따라서 오늘 수술에 대해 주의해야 할 몇 가지 사항이 있습니다.첫째, 창문 이식 중에 중심 정맥에 약간의 압박이 있었습니다. 이것은 축삭 손상이 발생하기 전에 허용 가능한 최대 압축 양으로 간주하는 것입니다. 둘째, 배치 후 퀵 씰의 창 아래에 약간의 기포가 있었습니다.이 거품 중 몇 개는 구형이며 퀵 씰 내에 위치한 반면 하나는 세균 외부와 퀵 씰 사이에 위치했습니다. 약 15분 후. 이 두 번째 거품은 재흡수되었으며 실제로 이미징에 어떠한 영향을 미치지 않습니다.다른 두 개의 거품은 시야에서 rostral 및 coddle 이었으므로 우리는이 두 위치 사이에서 여전히 매우 멋진 이미지를 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 비디오는 형질전환 마우스의 광학 창을 통해 뇌의 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 쥐는 신경 활동을 감지할 수 있는 형광 단백질을 발현합니다. 두개골의 작은 부분을 조심스럽게 제거하여 광학 창을 설치하고, 두개골을 검은색 시멘트로 덮어 이미징 전에 빛을 차단합니다.

신경 활동을 이미지화하기 위해 형질전환 마우스의 뇌에 광학 창 설치

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

출처: Pietruczyk, E. A., et al. 마우스의 추궁 절제술 및 척수 창 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 척수 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 붕규산 커버 유리와 3D 프린팅 백플레이트를 사용하여 노출된 척수를 안정화합니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 2광자 현미경을 사용하여 혈액-뇌 장벽 역학 및 신경혈관 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

생체 내 이미징을 위한 마우스의 척수 창 이식

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 프로토콜은 쥐의 척수에 유리 창을 이식하여 분사 내 현미경 검사법에 의한 시각화를 용이하게 합니다.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

학습하세요 실험성 자가면역 뇌척수염(EAE) 성인 마우스에 유리 척수 윈도우를 이식하는 방법을. 척수 클램프 삽입과 실리콘 엘라스토머를 이용한 윈도우 고정, 그리고 장기간 투광 현미경 관찰을 통해 세포 역학을 연구할 수 있습니다.

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

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