자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 결핵 및 말라리아와 동시 감염의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있는 실험용 마우스 모델을 확립하는 것입니다. 이것은 먼저 실험 동물을 em에 노출시킴으로써 달성됩니다. 흡입 노출 시스템을 사용하는 감염성 에어로졸 비말을 포함하는 결핵.

두 번째 단계에서는 폐 조직의 CFU 분석을 통해 원하는 수의 M 결핵 흡수를 확인합니다. 에어로졸 감염 하루 후인 40일 후, 생쥐는 혈액 식사 중에 전체 피부 아래에 침착되는 플라스모디움 스포로조이트의 자연 전파를 위해 전염성 모기에 노출됩니다. 마지막 단계에서는 giemsa 얼룩, 혈액 도말 분석을 통해 말라리아 혈액 단계 기생충의 발달을 모니터링합니다.

궁극적으로, 폐 내 em의 결핵 부담과 동시 감염된 동물의 혈액 내 기생충 수를 열거하여 각각 결핵과 말라리아의 진행 과정을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 다음과 같은 결핵, 말라리아 동시 감염 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 말라리아 기생충과의 동시 감염이 결핵균 감염의 발병 및 통제에 어떤 영향을 미치는가? 이 프로토콜은 오듐 부리와의 동시 감염이 면역 능력이 있는 C 57 PL 6 마우스인 미생물 결핵의 만성 단계에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 개발되었습니다.

또한 녹아웃 마우스를 포함한 다른 마우스 균주에 적용하거나 다른 마이코박테리움 또는 오듐 종과 함께 사용할 수 있습니다. 결핵균을 데우는 것으로 시작하십시오. 알려진 CFU 역가의 스톡.

세포가 해동되면 27 게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 현탁액을 조심스럽게 5번 혼합하여 박테리아 덩어리를 분산시키고 에어로졸 생성을 피하고, 원하는 감염 용량에 따라 필요한 부피의 마이코박테리아 스톡을 멸균 PBS가 들어 있는 50ml 튜브로 최종 부피 6ml로 이동합니다. 다음으로, 실험 동물을 구획 된 메쉬 바구니에 개별적으로 놓습니다. 바구니를 원형 에어로졸 챔버에 넣고 챔버의 뚜껑을 닫습니다.

Venturi 분무기 장치를 3개의 스테인리스강 소켓 이음매에 부착합니다. 18게이지 뭉툭한 바늘이 장착된 10ml 주사기에 마이코박테리아 현탁액을 흡인하고 주사기를 밀폐된 운송 상자에 넣어 에어로졸 챔버로 운반합니다. 이제 분무기 나사 캡을 제거하고 마이코박테리아 현탁액을 장치에 조심스럽게 주입합니다.

에어로졸 생성을 피하도록 주의하십시오. 주사기를 2%Burton이 들어 있는 날카로운 물건 용기에 버리고 분무기를 밀봉합니다. 사이클이 완료되면 흡입 장치를 작동하십시오.

에어로졸 챔버를 열기 전에 마이코박테리아 현탁액이 완전히 분무되었는지 확인하십시오. 동력이 공급되는 공기 정화 호흡기 헬멧을 착용한 다음 동물을 우리로 되돌리고 분무기 바구니와 에어로졸 챔버 내부를 살균하고 에어로졸 감염 후 하루 만에 지정된 안락사 대조 동물을 2등급 생물 안전 캐비닛의 해부 보드에 흡수성 종이에 놓고 각 마우스에 대해 70%의 에탄올을 사용하여 마우스를 소독합니다. 먼저 복부 중앙을 작게 절개한 다음 동물의 머리 위 피부를 집어넣습니다.

그런 다음 수술용 가위를 사용하여 복부와 흉곽을 엽니다. 폐가 접근할 수 있도록 흉벽을 제거한 다음 제거합니다. 2밀리리터의 균질화 완충액이 있는 15밀리리터 튜브로 폐를 옮긴 다음 5밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 100마이크로미터 체를 통해 조직을 작은 페트리 접시에 걸러냅니다.

배리어 팁이 장착된 1밀리리터 피펫을 사용하여 체를 여러 번 세척한 다음 약 250마이크로리터의 폐 균질액을 8개의 한천 플레이트에 분배합니다. 플레이트가 건조될 때 일회용 스프레더를 사용하여 샘플을 조심스럽게 플레이트화합니다. 각 플레이트를 퍼필로 밀봉합니다.

알루미늄 호일로 싸서 섭씨 37도에서 최소 4주 동안 똑바로 세워서 배양합니다. 모기에 물려 말라리아에 감염된 미접촉 또는 마이코박테리움 생쥐를 감염시키려면, 마취된 동물을 모기 케이지의 그물 위에 올려 놓아 전염성 모기가 막을 통해 먹이를 먹도록 하여 성공적인 포자 전염을 보장합니다. 쥐를 10-15 분 동안 케이지에 두십시오.

생쥐를 종이 타월에 얹어 케이지로 다시 옮기고 종이 타월로 덮어 마취에서 깨어날 때까지 따뜻하게 유지합니다. 케이지의 그물을 통해 모기에 70% 에탄올 또는 기타 소독제를 뿌려 모기를 죽이고 오토클레이브로 케이지를 살균합니다. 파라를 모니터링하려면 바늘을 사용하여 감염된 각 동물의 정맥 끝 부분을 뚫고 혈액 한 방울을 모으십시오.

유리 슬라이드의 양쪽 끝에서 다른 슬라이드를 사용하여 혈액 한 방울을 하단 슬라이드 길이의 절반 이상으로 끌어당깁니다. 그런 다음 퍼짐 슬라이드를 뒤집고 다른 가장자리를 두 번째 번짐에 사용합니다. 슬라이드를 염색 선반에 놓습니다.

혈액 얼룩을 절대 메탄올로 간단히 고정한 다음 자연 건조합니다. 다음으로 슬라이드는 기자에 얼룩을 담그십시오. 10분 후 탈이온수로 채워진 염색 정맥에 슬라이드를 몇 번 담그고 빼서 과도한 얼룩을 헹굽니다.

마지막으로 슬라이드를 수직 위치로 자연 건조합니다. 모기에 물린 실험 동물의 스포로조이트 유도 감염은 4-5일 후 혈액 단계 기생충의 존재로 확인된 바와 같이 100% 감염률을 보입니다. 표에서 볼 수 있듯이, 모기에 물려 플라스모디움 부리에 감염된 미숙한 쥐와 m 결핵 모두 감염되면 실험군 내의 모든 동물이 일관되고 재현 가능한 감염을 초래합니다.

pre patency 및 naive control 마우스를 그것 및 mycobacterium tuberculosis 동시 감염 동물과 비교함으로써, pre patency가 약간 지연되는 것을 관찰할 수 있습니다. 흡입 노출 시스템을 사용하여 결핵균에 감염된 마우스에서 결핵균에 감염된 마우스의 경우, 개별 마우스 간의 변동성이 상대적으로 낮은 동물의 폐로 박테리아를 성공적으로 증착시킵니다. 감염된 C 57 블랙 6 마우스의 폐에 있는 마이코박테리아 부하가 p burga의 존재 하에서 증가합니다.

대조적으로, 동시 감염된 마우스는 플라스모듐 단일 감염 마우스에 비해 파라혈증이 감소했습니다. 이 절차에 따라 유세포 분석 PCR Eliza 또는 조직학적 기법을 관심 조직 또는 체액에 대해 수행하여 mal 기생충 및 결핵 기저부에 대해 동시에 유도된 면역 반응과 동시 감염된 숙주에서의 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 인간 병원균인 미생물 결핵과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 감염성 에어로졸에 노출되지 않도록 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

결핵균과 관련된 모든 실험 작업은 적절한 생물안전 레벨 3 시설에서 수행되어야 합니다.