의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 복제된 DNA에서 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 NDV를 구출하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 세포를 T 7 중합효소를 인코딩하는 보조 바이러스로 감염시킨 다음, 해당 세포를 플라스미드로 형질주입하여 T 7 프로모터의 제어 하에 있는 바이러스의 최소 복제 메커니즘을 암호화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 형질주입된 포유류 세포를 바이러스의 자연 숙주에서 유래한 조류 세포와 함께 배양하는 것입니다.

포유류 세포에서 방출된 새로 생성된 바리안은 1차 증폭을 위해 조류 세포를 감염시킵니다. 다음으로, 구조된 바이러스의 추가 성장을 위해 공동 배양의 상층액을 배아 계란에 접종하고, 마지막 단계는 접종된 계란에서 LAN toic fluid를 채취하는 것입니다. 궁극적으로, 간단한 Hemagglutinin nation assay를 사용하여 LAN toic 유체 내 NDV의 존재와 구조 과정의 성공을 보여줍니다.

이 방법으로 구출된 재조합 바이러스는 감염에 영향을 미치는 다양한 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 백신 접종 및 항종양 요법을 위한 항원 전달을 위한 벡터로도 사용할 수 있습니다. 6개의 웰 플레이트에서 형질주입 전날 포유류 간암 2개 또는 5개 49개 세포를 분할하기 시작하려면, 세포의 밀도는 다음날 80-90% 합류점에 도달해야 합니다. 구출할 각 바이러스에 대해 2-4개의 다른 웰을 포함하십시오.

또한 PCA, GFP 및 pite, GFP는 각각 transfection 및 MVAT 7 감염 효율을 모니터링하는 것을 목표로 하는 제어 PCA를 위한 2개의 추가 웰을 포함합니다. 1ml의 데운 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 배양된 포유류 세포를 세포당 하나의 PFU로 여러 번 감염시킵니다. PBS에서 200 μl의 최종 부피에서, 바이러스 감염 배양 중 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하도록 방치하고, 지방 절제술 최적 용액을 준비하고 5분 동안 사전 배양한 후 서면 텍스트에 설명된 대로 transfection mix를 준비합니다.

250 마이크로리터의 용액을 DNA 튜브에 넣고 MVAT 7로 배양한 후 실온에서 20-30분 동안 배양한 후 흡인에 의해 바이러스 접종물을 제거하고 DNA lipo transfection mix로 교체합니다. 각 요리에 DMEM 10%FBS 1밀리리터를 첨가합니다. 감염된 형질주입된 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6-8시간 동안 배양합니다.

그런 다음 transfection 배지를 1.5ml의 새로운 DMEM 10%FBS로 교체합니다.24시간 후에 형광 현미경으로 transfection control well을 관찰하여 transfection 효율 및 T seven 중합효소 활성을 평가한 후 감염된 transfection된 포유류 세포와 조류 섬유아세포의 공동 배양을 진행할 수 있습니다. 일반적으로 닭 또는 오리 배아 섬유아세포의 합류 100mm 조직 배양 접시가 두 개의 형질주입된 웰당 사용됩니다. 충분히 미리 준비하십시오.

바이러스의 효율적인 구출을 위한 모든 구조 시도당 조류 세포의 100mm 조직 배양 접시. DMEM 10%FBS 배지에는 5%엘란 토익 플루이드와 30밀리몰 염화마그네슘이 보충됩니다. 포유류 세포를 데운 XPBS 트립신으로 두 번 세척한 후 세포가 분리될 때까지 0.2ml의 EDTA 트립신으로 세포를 주시합니다.

보충된 DMEM 1ml에 세포를 다시 현탁시키고 동일한 배지 3ml에서 100mm 조직 배양 접시로 옮깁니다. 조류 세포를 데운 XPBS로 2회 세척한 후 1ml의 EDTA 트립신으로 세포를 주시하고 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 1-2분 동안 배양합니다. 제조된 배지 8ml를 첨가하여 조류 세포를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 트립 화 된 조류 세포 4 밀리리터를 공동 배양 100 밀리미터 조직 배양 접시의 포유류 세포에 총 8 밀리리터의 부피로 첨가한다. 100mm 접시에 담긴 공동 배양된 세포를 부드럽게 흔들어 균일하게 분포되도록 한 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 3-4일 동안 놓습니다. 난자는 모든 공동 배양 세포가 MVAT 7 바이러스 감염으로 인한 세포요법 효과의 영향을 받을 때 감염됩니다.

이 시점에서 조직 배양 상층액 1ml를 제거하고 eend DPH 튜브 원심분리기에 추가합니다. 12, 벤치탑 원심분리기에서 000RPM으로 1분 동안 조직 배양 상등액. 세포 파편을 제거하려면 가벼운 캔들링 상자를 사용하여 알에 촛불을 꽂아 공기 주머니와 Alan Toic 구멍 사이의 계면을 확인합니다.

혈관 국소화를 피하기 위해 계면 경계에 표시를 합니다. 계란에 70% 에탄올을 분사하여 무균 상태를 설정합니다. 표시된 지점의 달걀 껍질에 부드럽게 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 1ml 주사기를 사용하여 500마이크로리터의 스내트를 접종하고 바늘을 수직으로 조준하여 Alan Toic 구멍에 직접 조준합니다. 녹인 왁스 또는 파라핀으로 달걀 껍질의 흠집을 밀봉하십시오. 섭씨 37도에서 2-3일 동안 알을 품습니다.

감염된 알을 2-4시간 동안 부화시키거나 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부화시켜 닭 배아를 죽이고 혈액을 응고시킵니다. 무균 상태를 유지하기 위해 계란에 70% 에탄올을 뿌립니다. 숟가락으로 공기강 위에 계란의 정점 부분을 조심스럽게 두드립니다.

난자 달걀 껍질에 금이 가면 집게로 파편을 제거하고 LAN toic membrane을 완전히 노출시킵니다. 집게와 가위로 ENT toic membrane을 절제하여 LAN toic cavity를 노출시키고 혈관과 참나무의 손상을 방지합니다. 주걱으로 배아를 조심스럽게 누르고 10ml 피펫으로 위로 흐르는 LAN toic 액체를 모읍니다.

난황 멤브레인을 손상시키지 마십시오. LAN toic 유체를 얼음 위의 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1500RPM에서 5분 동안 원심분리하여 LAN toic 유체를 정화합니다.

펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. Hemagglutinin Nation 분석에서 NDV의 존재 여부를 확인할 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 감염된 난자의 Alan Toic 유체 내 바이러스 존재 여부는 8개의 터키 적혈구, XPBS 또는 감염되지 않은 Alan Toic 유체와 같은 음성 대조군 샘플, NDV 바이러스의 Al Toic 유체와 같은 양성 대조군 샘플을 검증하기 위해 항상 HA 분석에 포함해야 하는 능력에 의해 거시적으로 확인할 수 있습니다.

HA 분석을 수행하기 위해 V bottom 96 well 플레이트에서 웰당 1개의 XPBS로 구성된 50 microlit를 피펫한 다음 50 microlit의 LAN toic 유체 샘플을 플레이트의 첫 번째 컬럼에 있는 well에 피펫으로 넣습니다. 플레이트의 나머지 부분을 통해 2중 연속 희석을 수행하고 웰에서 마지막 추가 50마이크로리터를 버립니다. 마지막 열에서 웰당 하나의 XPBS에 0.5%터키 적혈구 50마이크로리터를 분배하고, 플레이트를 가볍게 흔들어 두드려 4°C에서 30-45분 동안 또는 음성 대조군 웰에 투명한 펠릿이 형성될 때까지 배양합니다.

NDV 구조 절차의 초기 단계, 특히 transfection 효율 및 MVAT seven에 의한 감염을 모니터링할 수 있습니다. PAG GFP로 형질 주입되거나 MVAT 7에 감염되고 P 8 GFP 구성으로 형질 주입된 5 49 세포의 대표적인 형광 및 명시야 이미지. PCAs에 의해 유도된 GFP 발현은 transfection efficiency의 지표인 반면, P site에 의한 T seven promoter driven GFP 발현은 MVAT 7 감염 및 T 7 중합효소 활성에 대한 control입니다.

이미지는 조류 포유류 공동 배양 및 배아 난자에서 여러 차례의 증폭 후 성공적인 NDV 구출에 충분한 형질 주입 및 형질 주입 감염 효율을 보여주며, 구조된 바이러스의 존재는 HA 분석에서 양성 웰에 의해 검출됩니다. NDV는 적혈구를 연결하여 적혈구를 유도하여 V자형 우물의 바닥에서 적혈구가 침전되는 것을 방지합니다. 그러므로, HA 활성의 부족은 구조 구조 후 얻은 3개의 알려지지 않은 샘플에서 음성 대조군과 1개의 음성 결과에서 볼 수 있듯이 적혈구의 적색 원형 펠릿의 형성으로 쉽게 구별할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 높은 재현성으로 CDNA에서 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 구출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.