Name: 의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV)를 cDNA에서 구조하는 방법을 배울 수 있습니다. 포유류 세포 감염과 조류 세포 공배양을 통해 재조합 바이러스를 구조하고 백신 개발 및 유전자 치료 연구에 활용하는 기술을 익히세요.

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저자는 박사 부부의 실험실에서 과거와 현재 회원에게 감사의 말씀을 전합니다. 피터 Palese의와 NDV의 개발을위한 아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 유전학 기술과 기술 지원을 역방향. NIAD이 R01AI088770를 부여하고 우수의 국토 안보부 과학 기술 센터의 부서에 의해 의해 AG-S 실험실에서 뉴캐슬 질병 바이러스의 연구는 부분적으로 재정 지원 신흥 및 동물 매개 동물의 질병 (CEEZAD, 보너스 번호 2010-ST-061-AG001). LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시 (HHSN266200700008C)에 대한 우수의 NIAID 센터, Biodefense에 면역 모델링을위한 로체스터 센터의 대학 (HHSN272201000055C)에 의해 자금 지원 .

1. 포유 동물 세포의 준비 (그림 4A, 1 일) 분할 HEP-2 또는 A549 세포를 6 - 웰 플레이트에 형질 전날. 세포의 밀도는 다음 날 80-90% 합류에 도달해야합니다. 일반적으로 합류 100mm 요리 8 우물에 (물론 당 6 ~ 10 x 1 주위 세포)를 분할 할 수 있습니다. 각각의 바이러스가 구출 될 때까지, 2-4 다른 우물이 포함되어야한다,뿐만 아니라 각각 형질 전환 및 MVA-T7 감염의 효율성을 모니터링하기위한 제어는 pCAGGS-GFP 및 pCITE-GFP 18 2 여분의 우물,,. 2. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 (MVA-T7)를 발현하는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스와 포유 동물 세포의 감염 (그림 4A, 2 일) <ol><li> 37 ° C에서 PBS 1x/BA/PS와 미디어를 따뜻하게 </li><li> PBS 1x/BA/PS 1 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 감염의 다중성 (AT MVA-T7 바이러스로 배양 된 포유 동물 세포를 감염 모이1) 실온에서 1 시간 동안 PBS / BA / PS 200 μL의 최종 볼륨 PFU / 셀. </li><li> 3에 설명 된대로 바이러스 감염 배양하는 동안, 형질 믹스를 준비합니다. </li></ol> 3. 포유 동물 세포의 형질 (그림 4A, 2 일) <ol><li> 리포 펙 타민의 준비 : 구출 작전 당 티멤 250 ㎕ 씩 LPF2000 1-2 μg을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> DNA의 준비 : 티멤 50 μL의 각 구조에 대한 플라스미드 칵테일을 확인합니다. 0.4 pTM1-NP ㎍의, pTM1-P 0.2 μg, 튜브 당 pTM1-L의 0.2 μg을 추가합니다. 각 튜브에 구출 할 NDV의 전체 길이의 cDNA 클론의 1 μg을 추가합니다. 또한 두 개의 제어 형질,는 pCAGGS-GFP의 2 μg 하나 (형질 전환 효율을 확인하기 위해) 및 (T7 효소가 MVA-T7에 의해 발현을 구동 확인) pCITE-GFP의 2 μg과 다른 준비를합니다. </li><li> LPF2000-티멤 용액을 5 분 (단계 3.1)에 대한 예비 인큐베이션 한 후, 추가 250DNA 튜브에 대한 해결책의 μL (3.2 단계) 및 실온에서 20 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> MVA-T7과 부화 후, 흡인에 의해 바이러스 접종을 제거하고 DNA-LPF2000 형질 믹스 (단계 3.3)로 교체합니다. </li><li> 각 요리에 DMEM 10 % FBS / PS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2에서 6 ~ 8 시간 (또는 야간)에 감염된 / 형질 전환 세포를 품어하고 신선한 DMEM 10 % FBS / PS 1.5 ㎖로 형질 미디어를 교체합니다. </li><li> 24 시간 후 형질에서 제어 우물은 형질 전환 효율 (는 pCAGGS-GFP) 및 T7 효소 활동 (pCITE-GFP) (그림 5A)을 평가하기 위해 형광 현미경으로 관찰 할 수있다. 아래에 설명 된대로 새 섬유 아 세포로 감염된 / 형질 전환 세포의 공 배양을 진행합니다. </li></ol> 4. 조류 세포와 포유 동물 세포의 공동 문화 (그림 4A, 3 일) 일반적으로 닭의 합류 100mm 조직 배양 접시 (CEFs) OR 오리 (인증 된 정의) 배아 섬유 아 세포는 두 개의 형질 우물 당 사용된다. 사전에 모든 구조 시도 당 조류 세포의 충분한 100mm 조직 문화 요리를 준비해야합니다. 바이러스의 효율적인 구조를 들어, DMEM 10 % FBS / PS 미디어는 막액 30 mM의 MgCl2를 5 %로 보충된다. 이 시점에서 24 시간 파이, 포유 동물 세포 인해 MVA-T7 감염,도 5a에 asevident에 세포 변성 효과 (CPE)를 보여주는 시작할 수 있습니다. <ol><li> 37 ° C.에 PBS의 1X 및 미디어 워밍업 </li><li> PBS 1X 1 ㎖로 2 배, 포유 동물 세포를 씻으십시오. </li><li> 그들은 분리 될 때까지 EDTA-트립신의 0.2 ml의 포유 동물 세포를 Trypsinize. DMEM 10 % FBS / PS 1 ㎖로 세포를 재현 탁 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를하고 100mm 조직 배양 접시로 전송. 동일한 매체의 3 ML을 추가합니다. </li><li> PBS 1X의 4 ㎖로, 두 번, 조류 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 1 EDTA-트립신 ㎖ 및과를 Trypsinize 조류 세포는 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 재현 탁 일8 DMEM 10 % FBS / PS, 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를 2 ㎖ 및 8의 총 볼륨의 공 배양 100mm 조직 배양 접시에있는 포유 동물 세포에 트립신 세포 4 ㎖를 추가를 추가 전자 셀 ML (4 ML의 포유류, 4 ㎖의 조류 세포). </li><li> 부드럽게 균일 한 분포가 다음 3 ~ 4 일 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 위해 손으로 100mm 접시에 공동 배양 된 세포를 흔들. 3 4 일 포유류 및 조류 세포의 공동 배양 후 계란을 감염에 대한 기준은 (세포 반올림, 죽음, 표면 박리 등이.) MVA-T7 바이러스 감염에서 관찰 얼마나 많은 세포 변성 효과에 따라 달라집니다. </li></ol> 5. 닭 유정란의 감염 (그림 4A, 일 6 ~ 7) <ol><li> 포유 동물 및 조류 세포의 공 배양 3-4 일 후, 조직 배양 상등액 1 ㎖를 제거하고 에펜 도르프 튜브에 추가한다. </li><li> 벤치에서 12,000 rpm에서 1 분 동안 조직 배양 상층 액을 원심 분리기세포 파편을 제거하는 최고 원심 분리기. </li><li> 공기 주머니와 뇨 공동 사이의 인터페이스를 확인하기 위해 빛을 불빛에 비춰 조사 상자를 사용하여 계란을 촛불. 인터페이스 테두리 혈관 지역화를 피하는 표시를합니다. 무균 조건을 확립하기 위해 계란을 통해 70 % 에탄올 스프레이. 부드럽게 표시된 자리에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 뇨 공동으로 수직으로 직접 바늘을 목표로, 인슐린 (1 ㎖)을 주사기를 사용하여 상층 액 500 μl를 접종. (그림 4B). </li><li> 녹은 왁스 나 파라핀 달걀 껍질에 흠을 봉인. </li><li> 37 ℃에서 2 ~ 3 일 계란을 품어 </li></ol> 6. 감염된 닭 유정란에서 뇨의 유체 (그림 4A, 8 ~ 10 일)의 수확 <ol><li> 닭 배아를 죽이고 피를 응고하기 위해 4 ° C에서 2-4 시간 또는 하룻​​밤 감염된 알을 품다. </li><li> 70 % 에탄올 (멸균 조건을 유지하기 위해)으로 스프레이 계란. </li><li> 조심스럽게 숟가락으로 공기 구멍을 통해 계란의 꼭대기 부분을, 누르십시오. 달걀 껍질에 균열이되면, 집게와 조각을 제거하고 완전히 뇨 막을 노출. </li><li> 혈관의 손상과 노른자를 피하고, 집게와 가위로 뇨 막을 절개하여 뇨 구멍을 노출합니다. </li><li> 조심스럽게 주걱으로 배아를 아래로 누르고 10 ㎖ 피펫으로 상향 유동 막액 (달걀 당 8 ~ 12 ㎖)에 수집합니다. 노른자 막 손상을 방지. 얼음에 15 ML의 원심 분리기 튜브 (달걀 당 하나의 튜브를 사용)에 막액을 전송합니다. </li><li> 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 막액 명확화. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 저장 샘플, 혈구 응집 분석에 의해 NDV의 존재를 확인한까지. </li></ol> 7. 혈구 응집 (HA) 분석 allant에서 바이러스의 존재감염된 계란에서 OIC 유체는 칠면조 적혈구 (RBC)를 hemagglutinate 할 수있는 능력에 의해 육안으로 확인할 수 있습니다. NDV의 경우에는, 밀리리터 당 단위를 형성하는 약 10 6 플라크 (PFU)는 HA 분석에서 양성 신호를 제공하기 위해 요구된다. HA의 분석은 V-바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시된다. 네거티브 (PBS 1X, 비감염 막액)뿐만 아니라 양극 (모든 NDV 바이러스로부터 막액) 컨트롤 샘플은 항상 검증을 어떤 HA 분석에 포함되어야한다. HA 분석을 수행하려면 : <ol><li> 피펫 V-바닥 96 - 웰 플레이트에 웰 당 PBS의 1X의 50 μL. </li><li> 피펫 판의 첫 ​​번째 열에서 우물에 막액 샘플 50 μL. 판의 나머지 부분을 통해 2 배 시리얼 희석을 수행하고 마지막 열에서 우물에서 마지막으로, 추가 50 μl를 폐기합니다. </li><li> 잘 당 PBS 1X 0.5 % 칠면조 RBC의 50 μl를 분배. 부드럽게 눌러 판을 흔들. </li><li> 4 ° C에서 (또는 얼음) F에서 접시를 품어또는 30 ~ 45 분 또는 클리어까지 펠릿은 음성 대조군 웰에 형성된다. </li></ol>

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아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 시나이 산에서 의학의 아이칸 학교가 소유하고 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 대한 특허의 발명가이다.

몇몇 요인 NDV 구출하면서 좋은 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 사용되는 전장 cDNA 구조체는 NDV 게놈에 트랜스 진 새로운 / 수정 기능 내장 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. (II)에는 추정 GE 또는 GS 시퀀스가​​ 외국에없는, 위에서 언급 한 바와 같이이 (I) 해당 유전자의 끝 (GE), intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가​​ 필요한 경우 추가 할 수 있다는 것을, 의미 유전자, 그리고 (iii) 전체 재조합 게놈은 &quot;6의 규정&quot;을 다음과 같습니다. 구조 과정으로, 플라스미드 준비의 품질, MVA-T7 주식뿐만 아니라 세포의 적절한 유지 관리가 중요합니다. 도입 유전자의 크기 또는 특성상 어렵다 복제 및 복구 프로세스, CSCL 밀도 구배 원심 분리를 통해 DNA를 정제함으로써 개선 될 수 있지만, 대부분의 경우를 들어, 플라스미드 DNA의 표준 maxiprep 정화는 충분하다. 리를 사용하여 형질 전...

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 Avulavirus 속 1에 속하는 조류 paramyxovirus은 심각하게 전 세계의 가금류에 영향을 미칠 수있는 경제 관련 때문에 널리 연구되고 감시를 받고 인수 공통 에이전트입니다. 아니 인간의 병원체이지만, NDV는 철저 모델 paramyxovirus로 인해 고도의 흥미, 자연, 온 콜리 틱 속성 6 모두 수의사 필드 이상으로 연구되고있다. NDV에 대한 연구는 크게 첫 번째 Conzelmann 및 coleagues 2로 광견병 바이러스에 대한 설명 단일 가닥이 아닌 분할 된 음의 센스 RNA 바이러스에 대한 역 유전학 기술의 개발 혜택. 외국 유전자 또는 야생형 유전자의 변형을 운반 유전자 변형 NDVs의 다양한 널리 그 이후로 연구되고있다. 이러한 재조합 바이러스로 작업은 NDV의뿐만 아니라 관련 구호 물자의뿐만 아니라 다른 독성 요소를 특성화하는 것이 중요했습니다N 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체 7 - 나 응급 니파 바이러스 8. 또한, 서로 다른 다수의 연구는 주로 바이러스의 면역 자극 특성을 향상시킴으로써, NDV 6,9,10의 타고난 항 종양 활성을 개선하기 위해 이러한 기술을 사용하는 방법을 살펴 보았다. 재조합 NDVs에 대한 연구의 관련 영역이 인플루엔자 5,11,12와 같은 다른 바이러스 성 질병에 대한 백신 후보의 생성하고있다, HIV (13)는, SARS 15, 14 홍역, 또는 그 호흡 sincytial 바이러스 (RSV) (16)에 의해 발생합니다. NDV 의해 제공된 다양한 주목할만한 장점은 인간 개체군에서 기존 면역 결핍이다 사이에, 외래 유전자 삽입, recombinatory 활성의 결여와 전체적으로 전술 천연 면역 자극 특성 (17)과 결합 된 높은 안전성 프로파일의 안정성. 또한 P의 재조합 이가 백신의 잠재적 인 사용을 주목할oultry, NDV 모두에 대한 보호 및 고병원성 조류 인플루엔자는 11, 12를 바이러스. 이 때문에 또한 인간에 지칠대로 지친 조류 독감의 가능한 간 특정 점프를 방지하는 데 도움이, 길 들여진 동물을 야생에서 확산 후자의 가능성을 줄일 수있는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 마지막으로, 리포터 발현 NDV은 선천성 면역 반응의 평가뿐만 아니라 여러 바이러스 18-27 의해 인코딩 인터페론 길항 물질의 식별을 위해 사용되었다. 재조합의 구조 과정은 비 분할, 음의 가닥 RNA 바이러스는 기본적으로 인위적으로 리보 또는 RNP로 알려진 최소한의 감염성 분자 기계, (그림 2)를 코딩하는 cDNA를 형질 전환에 의해 생산 세포에서 바이러스의 복제 사이클을 강제에 구성되어 있습니다. RNP들이 바이러스 중합 효소 (P와 L 단백질)로 구성되어, 핵 단백질 (NP)와 바이러스의 전체 길이 antigenomic RNA. 이 RNA + antigenome는 일입니다또한 바이러스 RNP의 단백질의 나머지 부분과 연관된 상보적인 RNA-게놈의 생성에 필요한 전자 서식, 천연 바이러스 감염시 세포의 세포질 (도 2A에 출시 것이라고 같은 감염성 복잡한 되풀이되었습니다 ). 이후이 단계에서 바이러스 성주기는 자연스럽게 진행하고 수정 된 게놈을 encapsidating 재조합 비리는 (그림 2B)를 생성됩니다. 현저하게, 대신 antigenomic의 cDNA 게놈 cDNA를 형질 크게 손상 또는 완전히 복구 효율 2,28-30을 폐지. antigenomic cDNA를 형질 감염이 되어도, 형질 감염된 세포에서 RNP들로 재조합 RNA의 이입의 효율은 아마도 매우 낮다. 이 때문에, NDV에 대한 구조 프로토콜은 종종 관대 한 세포 및 / 또는에 의해를 공동 배양하여 원래 형질 세포에서 방출되는 몇 가지 바이러스 입자의 증폭에 대해 서로 다른 단계를 포함유정란의 감염. 이전 구조로, cDNA를 원하는대로 수정을 생성하기 위해 표준 복제 절차에 의해 조작 할 수 있습니다. 다른 유전자 생성물 및 바이러스 조절 서열의 특정 돌연변이는 똑 바르게 이러한 방법을 달성 할 수 있지만, 재조합 NDV 관련된 발행 작업의 대부분은 NDV 게놈에 전사 단위의 새로운 첨가를 요구했다. paramyxovirus 제품군의 다른 제품과 마찬가지로, NDV 게놈 차등 바이러스의 생활주기 1 중요한 감소 그라데이션의 3 &#39;말단에 자신의 위치와 관련에 따라 표현되는 여섯 전사 단위로 8 개의 서로 다른 단백질을 인코딩합니다. 이 때문에, 게놈 내 새로운 전사 유닛의 위치는 신중 바이러스 복제의 형질 전환 유전자 및 장애의 발현 사이의 균형을 달성하도록 선택되어야한다. P와 M의 사이 유전자 삽입은 대부분, t를 사용되어왔다무릎 다른 사이트는 13,31을 테스트되었습니다. (I) NDV 게놈에 포함되는 새로운 유전자가 바이러스 성 RNA 의존-RNA에 해당하는 신호의 통제하에 있어야한다 : 무엇이든간에 삽입, NDV의 cDNA에 복제는 rescuable 구조를 생성하기 위해 몇 가지 규칙을 따라야합니다 중합 효소. 이러한 시퀀스는 새로운 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 상류에 추가되어야하므로 폴리머는 단일 염기 intergenic 서열 (IG)에 의해 이격 된, 이전의 유전자 (GE)과 새로운 형질 전환 유전자 (GS)의 시작 부분의 끝을 인식 할 수있다 . Paramyxoviridae 가족의 대부분의 회원으로 NDV의 (II)의 효율적인 복제, 게놈 길이의 여러 존재에 의존, 유효한 코작 (K) 진핵 생물의 리보솜의 번역을 개선하기 위해 일련의 추가는 또한 더 나은 외국 단백질 발현 32에 추천 여섯 (33)는, 따라서, NDV에 모든 삽입이 &quot;6의 규정&quot;에 따라해야합니다. 필요한 경우, REQuired 추가 뉴클레오티드 하류 새로운 ORF를 추가 할 수 있습니다, 그리고 (iii) 유전자의 순서가 찾아 확인해야 할 GE 및 구조의 효율성, 유전자 발현 및 / 또는 바이러스의 생존 능력에 지장을 줄 수있는 시퀀스 등 GS. 존재하는 경우,이 시퀀스는 침묵 돌연변이에 의해 제거해야합니다. 상술 한 규칙에 따라 재조합 전체 길이 cDNA를 효율적으로 생성 여기서 설명하는대로 유전자 재조합 NDV를 생성하기 위해 첫 번째 단계이다. 시스템의 모든 DNA 구조는 T7 RNA 중합 효소 프로모터 (그림 3)의 제어하에 있습니다. 이 세포질 효소는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스 (MVA-T7) (34)와 동시 감염에 의해 트랜스에 제공된다. 그림 3a는 전체 길이 antigenomic cDNA를 5 인코딩 pNDV-B1 플라스미드를 보여줍니다. 그림 3b는 pTM1 플라스미드는 NP를 인코딩을 보여줍니다, P와 L의 ORF. , U를 인코딩 플라스미드 pCITE-GFP,개 nder T7 프로모터, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 닭 베타 액틴 프로모터 35에서 동일한 ORF를 암호화는 pCAGGS GFP (18)는, 컨트롤로 사용됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 lentogenic NDV 변형 Hitchner의 B1 5 (그림 4)의 cDNA의에서 재조합 NDV를 구출하는 절차를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% 소 알부민(BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>모든 공급업체</td></tr><tr><td colspan="4"> Cell lines A549 세포(카탈로그 번호 CRL-185), HEp-2 세포(카탈로그 번호 CRL-185), 닭 배아 섬유아세포(카탈로그 번호 CRL-12203) 및 오리 배아 섬유아세포(카탈로그 번호 CCL-141)는 다음과 같습니다. American Type Culture Collection(ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA)에서 구할 수 있습니다. 모든 세포주는 37°C로 유지됩니다. DMEM 10% FBS, 1% PS. in DMEM 10% CO2를 함유한 C 인큐베이터 배아 계란 배아 계란은 Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA)에서 유지되며 37°C로 유지됩니다. 배아의 생존 능력은 난자 캔들러로 평가합니다. 난자는 생후 8-10일이 되면 감염됩니다. 알란토산 액체의 감염과 채취는 모두 무균 상태에서 발생합니다. 모든 난자는 표준 실험실 생물 안전 프로토콜에 따라 오토클레이브 및 폐기됩니다. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC는 Truslow Farms(201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)에서 구입하여 4 &deg;C에 보관할 수 있습니다. HA 분석을 위해 RBC를 준비하려면 50ml 원뿔형 튜브에 5ml의 PBS 1x 45ml로 상업용 스톡 5ml를 세척합니다. 1,000rpm에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 펠릿화된 RBC를 PBS 1x에서 1:1,000으로 희석하여 최종 0.5-1.0% 농도를 만듭니다. 세척된 적혈구는 4°C에서 보관할 수 있습니다. C 몇 일 동안. Plasmids Plasmid 제제는 제조업체&#039를 따르는 상업적으로 이용 가능한 maxiprep 키트로 얻어집니다; s 명령어를 ddH20으로 희석하여 최종 농도 1 &mu로 만듭니다. 지/&무; l 및 -20 &deg;C에 저장됩니다. DNA 농도 및 순도는 260 및 280 nm에서 분광 광도계로 평가됩니다. 260/280 비율이 1.8보다 높은 제제는 구조에 적합한 품질로 간주됩니다. 플라스미드 DNA의 품질은 또한 아가로스 겔 크로마토그래피에 의해 일상적으로 재확인됩니다. Viruses 렌토제닉 NDV 균주 Hitchner B1의 구출을 위해 설명된 프로토콜은 생물안전성 수준(BSL) 2 조건 하에서 수행될 수 있습니다. T7 RNA 중합효소(MVA-T7)를 발현하는 Modified Vaccinia Ankara는 34를 기술하고 Bernard Moss 박사로부터 얻었습니다. 이 바이러스는 닭 배아 섬유아세포의 합류 단층에서 성장하고 포유류(A549 또는 HEp-2) 세포에서 적정됩니다. NDV 스톡은 배아된 닭고기 달걀에서 성장하며 정제된 비리온에 대해 배양된 다클론 혈청을 사용하여 IFA에 의해 적정됩니다. 모든 오염된 물질은 안전하게 멸균하고 표준 생물안전 절차에 따라 폐기되어야 합니다. 조직 배양 매체 및 솔루션: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#039; s 수정된 독수리&#039; 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 S 배지(DMEM): DMEM 445ml, 열 불활성화 FBS 50ml, 100x 상업용 P/S 용액 5ml. 4 &deg;C. 10x Phosphate buffered Saline (PBS): NaCl 80g, KCl 2g, Na2< 11.5g/sub>HPO4.7H2O, KH2PO4 2g. ddH2O를 최대 1L까지 추가합니다. pH를 7.3으로 조정합니다. 오토클레이브로 살균하십시오. 실온에서 보관하십시오. 1x PBS: ddH2O.로 10x PBS 1:10을 희석하십시오. 오토클레이브로 살균하고 실온에서 보관하십시오. 100x Ca/Mg : 1.327g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O를 첨가하고 ddH2O를 최대 100 ml까지 첨가합니다. 오토클레이브 및 실온에서 보관하십시오. 1x PBS/BA/PS: 437ml ddH2O. 오토클레이브에 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 50ml 및 실온으로 냉각되면 5ml 100x 페니실린/스트렙토마이신 3ml 35% 소 및 100x Ca/Mg 5ml를 추가합니다. 4°C.</p에서 보관하십시오> </td></tr></tbody></table>

의 cdna에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 가족 Paramyxoviridae 1의 Avulavirus 속의 프로토 타입 멤버가 아닌 분할, 음의 의미는 단일 가닥, 예방 접종에 대한 벡터 잠재적 인 응용 프로그램과 RNA 바이러스 (그림 1)을 포위하고있다 인간의 질병의 치료. 이러한 응용 프로그램의 심층 탐사는 cDNA를 2-5로 자신의 완전한 게놈을 암호화하는 플라스미드로부터 재조합 바이러스를 구출하는 역 유전학 기술의 설립 후 수있게되었다. 바이러스 cDNA를 편리 바이러스의 유전자형을 변경 및 / 또는 새로운 전사 단위를 포함하는 표준 클로닝 절차를 사용하여 시험 관내에서 수정 될 수있다. 이러한 유 전적으로 변형 된 바이러스의 구조는 인자 감염의 여러 단계에 영향을 미치는뿐만 아니라 항원의 발현 및 전달을위한 벡터의 개발 및 개선을 허용을 이해하기 위해 유용한 도구를 제공한다예방 접종 및 치료를위한. 여기에서 우리는 재조합 NDVs의 구조에 대한 프로토콜을 설명합니다.

NDV의 구조는 정기적으로 바이러스의 전체 cDNA를 액세스 할 수있는 실험실에서 수행 잘 설립 절차입니다. 그러나, 본 방법의 본질적인 스토캐스틱 자연 어려운 100 % 복구 효율을 달성 할 수있다. 프로세스의 초기 단계, MVA-T7과 특수 형질 전환 효율과 감염을 모니터링 가능한 문제. 그림 5A 표준 형질 성공적인 NDV 구조에 대한 충분한 형질 전환 / 감염의 효율을 보여줍니다를 식별하는 데 도움이됩니다. 조류 - 포유류의 공동 문화와 유정란 증폭 라운드 후, 구조 바이러스의 존재는 HA 분석에서 긍정적 인 우물에 의해 검출된다. NDV는 적혈구를 연결하여 혈구 응집을 유도하고, 따라서 잘 V 자형의 하부에 그 침강을 방지한다. 따라서 HA 활성의 결여는 쉽게 RBC의 빨강, 둥근 펠릿 (도 5b)의 형성에 의해 구별 될 수있다. 부정적인 결과HA 분석에 의한 막액에있는 바이러스의 부족 역가에 할 수있다 : 약 10 6 PFU / ㎖의 최...

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

이 절차의 전반적인 목표는 복제된 DNA에서 재조합 뉴캐슬병 바이러스 또는 NDV를 구출하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 세포를 T 7 중합효소를 인코딩하는 보조 바이러스로 감염시킨 다음, 해당 세포를 플라스미드로 형질주입하여 T 7 프로모터의 제어 하에 있는 바이러스의 최소 복제 메커니즘을 암호화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 형질주입된 포유류 세포를 바이러스의 자연 숙주에서 유래한 조류 세포와 함께 배양하는 것입니다.포유류 세포에서 방출된 새로 생성된 바리안은 1차 증폭을 위해 조류 세포를 감염시킵니다. 다음으로, 구조된 바이러스의 추가 성장을 위해 공동 배양의 상층액을 배아 계란에 접종하고, 마지막 단계는 접종된 계란에서 LAN toic fluid를 채취하는 것입니다. 궁극적으로, 간단한 Hemagglutinin nation assay를 사용하여 LAN toic 유체 내 NDV의 존재와 구조 과정의 성공을 보여줍니다.이 방법으로 구출된 재조합 바이러스는 감염에 영향을 미치는 다양한 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 백신 접종 및 항종양 요법을 위한 항원 전달을 위한 벡터로도 사용할 수 있습니다. 6개의 웰 플레이트에서 형질주입 전날 포유류 간암 2개 또는 5개 49개 세포를 분할하기 시작하려면, 세포의 밀도는 다음날 80-90% 합류점에 도달해야 합니다. 구출할 각 바이러스에 대해 2-4개의 다른 웰을 포함하십시오.또한 PCA, GFP 및 pite, GFP는 각각 transfection 및 MVAT 7 감염 효율을 모니터링하는 것을 목표로 하는 제어 PCA를 위한 2개의 추가 웰을 포함합니다. 1ml의 데운 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 배양된 포유류 세포를 세포당 하나의 PFU로 여러 번 감염시킵니다. PBS에서 200 μl의 최종 부피에서, 바이러스 감염 배양 중 세포를 실온에서 1시간 동안 배양하도록 방치하고, 지방 절제술 최적 용액을 준비하고 5분 동안 사전 배양한 후 서면 텍스트에 설명된 대로 transfection mix를 준비합니다.250 마이크로리터의 용액을 DNA 튜브에 넣고 MVAT 7로 배양한 후 실온에서 20-30분 동안 배양한 후 흡인에 의해 바이러스 접종물을 제거하고 DNA lipo transfection mix로 교체합니다. 각 요리에 DMEM 10%FBS 1밀리리터를 첨가합니다. 감염된 형질주입된 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6-8시간 동안 배양합니

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

출처: Yates, J. G. E., 외. 요막액으로부터 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 바이러스에 감염된 유정란에서 수집하여 정제한 요막액으로부터 바이러스 입자를 정제하고 농축하는 과정을 보여줍니다. 여기에는 온전한 바이러스를 분리하기 위한 뎁스 필터레이션(depth filtration), 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 및 밀도 구배 초원심분리를 포함한 일련의 여과 및 분리 단계가 제시됩니다. 이후 바이러스가 풍부한 분획물을 투석하여 잔류 염과 구배 성분을 확산으로 제거하고, 고장액을 이용한 삼투 현상을 통해 농축합니다. 그 결과, 실험에 적합한 정제된 고역가 바이러스 조제물이 얻어집니다. Yates, J. G. E., 외 등 요막액으로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스 생산. J. Vis. Exp. (2022)본 영상에서는 바이러스에 감염된 유정란에서 수집하여 정제한 요막액으로부터...

유정란 요막액으로부터의 바이러스 정제

BHK-21(baby hamster kidney-21) 세포를 150 mm 배양 접시에 접시당 3 × 106 cells의 밀도로 분주하여 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다.

박테리아 인공 염색체 유래 합성 RNA가 형질전환된 세포로부터의 감염성 비리온 복구

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

지난 15년 동안 개 아데노바이러스 2형(CAV2) 유래 벡터는 in vitro 및 in vivo 세포를 transduction하는 효율성이 입증되었으며 백신 접종 및 유전자 치료에 널리 사용됩니다. 여기에서는 CAV2 벡터를 생성, 생산 및 정제하여 high-titer 바이러스 현탁액을 생성하는 절차를 설명합니다.

Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 유래 벡터의 생산 및 정제

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

Zika 바이러스의 최근 전염병은 백신 및/또는 치료 전략을 개발하기 위하여 역유전 접근을 확립의 중요성을 강조합니다. 여기서, 우리는 인간 시토메갈로바이러스의 제어하에 세균성 인공 염색체에 조립된 전신 cDNA 클론으로부터 전염성 재조합 Zika 바이러스를 즉각적으로 조기 프로모터로 구출하는 프로토콜을 기술한다.

세균성 인공 염색체 cDNA 클론에서 재조합 Zika 바이러스의 구조

여기에서 우리는 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산, 정제 및 정량화를 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt; 6 × 10,9 플라크 형성 단위 / mL를 산출하여 생체 내 동물 연구에 적합한 바이러스 양을 제공합니다. 생체내 안전성을 보장하기 위한 추가의 품질 관리 분석법이 기재되어 있다.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

이 프로토콜 논문은 렌즈 발달 중 단백질의 in situ 기능 및 발현을 연구하기 위한 도구로서 RCAS(A) 레트로바이러스의 배아 닭 수정체 미세 주입 방법론을 설명합니다.

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

이 기사는 뉴캐슬병 바이러스 혈청학적 검사를 위해 4개의 혈구응집소 항원을 준비하는 간단한 방법을 제시합니다. 보다 엄격한 역적정 방법 및 잘 정의된 조정 프로세스와 결합하여 항원의 혈구응집역가를 정확하게 측정함으로써 테스트 효율성을 높이고 위양성을 줄이며 가금류의 질병 감시를 개선합니다.

뉴캐슬 질병 바이러스 혈청학의 혈구 응집 억제 분석을 위한 항원 준비의 최적화

학습하세요 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV)를 cDNA에서 구조하는 방법을 배울 수 있습니다. 포유류 세포 감염과 조류 세포 공배양을 통해 재조합 바이러스를 구조하고 백신 개발 및 유전자 치료 연구에 활용하는 기술을 익히세요.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

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