Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 유래 벡터의 생산 및 정제

지난 15년 동안 개 아데노바이러스 2형(CAV2) 유래 벡터는 in vitro 및 in vivo 세포를 transduction하는 효율성이 입증되었으며 백신 접종 및 유전자 치료에 널리 사용됩니다. 여기에서는 CAV2 벡터를 생성, 생산 및 정제하여 high-titer 바이러스 현탁액을 생성하는 절차를 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 개 아데노바이러스 type 2 유래 벡터를 구축, 생산 및 정제하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자를 셔틀 플라스미드에 클로닝함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 상동 재조합에 의한 재조합 게놈 플라스미드를 얻는 것입니다.

다음으로, 재조합 결함 있는 송아지, 두 개의 바이러스가 트랜스 보완 세포주에서 생성되고 증폭되었습니다. 마지막 단계는 생성된 재조합 바이러스를 in vivo 및 in vitro의 다양한 응용 분야를 위해 정제하고 농축하는 것입니다. 궁극적으로, 면역형광 컨포칼 현미경 검사는 설치류 뇌에서 바이러스 전달의 예를 보여주는 데 사용됩니다.

인간 광고 신경증에서 파생된 벡터와 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 인간 개체군에서 송아지 2에 대한 기존 면역이 없다는 것입니다. 따라서 이 방법은 특정 뇌 영역에서 발현되는 단백질의 역할을 평가하는 것과 같은 백신 접종 또는 유전자 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 절차를 시연하는 것은 KY와 Corin Bergeron이 될 것입니다.

저희 연구실의 박사후 연구원 2명은 7%의 열, 불활화 태아 송아지, 혈청 나트륨, 피루브산, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 고포도당을 가진 DMEM에서 섭씨 37도, 5%CO2의 세포를 성장시키는 6개의 웰 플레이트에 DKE 1개의 세포를 파종하여 형질주입 하루 전에 이 절차를 준비합니다. 다음 날, 세포는 형질주입을 위해 70-80%confluent여야 하며, 2마이크로그램의 pcal GOI를 분해하고, 재조합 cav 2개의 게놈 플라스미드를 ASC와 함께 1개씩 플라스미드의 비바이러스 서열을 방출하고, 0.8%Agro gel 전기영동 분해로 생성된 제한 패턴을 확인하고, 재조합 게놈을 포함하는 약 31 kilobase 쌍 단편과 플라스미드 골격에 해당하는 2 kilobase 쌍 단편을 생성해야 합니다. 분해된 DNA를 200마이크로리터의 제트 프라임 버퍼와 10초 동안 와류와 혼합합니다.

4마이크로리터의 제트 프라임을 넣고 10초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 짧게 돌려 비말을 제거하고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 transfection mix를 DKE one cells에 적가적으로 추가합니다.

플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합물이 고르게 분포되도록 하고 섭씨 37도에서 배양합니다. transfection 일주일 후 15ml 폴리프로필렌 튜브에서 세포와 배양 배지를 수집합니다. 세 번의 동결 사고 주기로 세포를 교란합니다.

1, 800 시간에 10 분 동안 분리기분리에 의하여 lysate를 맑게 하십시오 G.Collect 상층액을 및 바이러스를 전파하기 위하여 연속적인 바이러스 번식을 위해 마이너스 20에 저장하십시오 상등액을 포함하는 바이러스의 0.5 밀리리터를 가진 6개의 웰 플레이트의 1개의 우물에서 성장한 DKE의 80-90%confluent 단층을 감염하십시오. 섭씨 37도에서 1시간 동안 가벼운 교반으로 1시간 후에 배양합니다. 접종물을 제거하고 5%를 포함하는 1.5ml의 완전한 DMEM으로 교체하십시오.가열이 불활성화된 FCS는 섭씨 37도에서 3-4일 동안 세포를 배양합니다.

세포는 세포병성 효과 또는 CPE의 출현에 대해 매일 모니터링해야 합니다. 명확한 CPE가 표시되지 않는 경우. 배양 4일 후 세포를 채취하고 명확한 CPE가 대부분의 세포에 영향을 미칠 때 바이러스 증폭을 반복합니다.

일반적으로 2-4번의 바이러스 증폭 라운드 후에 배양 배지로 세포를 수집하고 앞에서 설명한 것처럼 3회 동결 해동합니다. 80-90%를 감염시킵니다. CPE가 완료되면 3-4일 후에 접시당 상등액이 포함된 1.5ml의 바이러스를 사용하여 10cm 직경의 조직 배양 접시 3개에서 성장한 DKE one 세포.

이 10 센티미터 직경의 접시에서 세포를 수확하면 3 개의 자유형주기로 세포를 방해하고 10 분 동안 원심 분리로 용해물을 1, 800 회 제거합니다. G는 상층액을 수집하여 대규모 Cav 2 증폭을 위해 영하 20도에서 저장하여 스케일업 절차를 시작하기 위해 80-90%의 DKE 단층을 감염시키고, 40, 10cm 직경의 조직 배양 접시에서 자란 하나의 세포를 감염시키고, 각 접시에 대해 FCS 없이 완전한 DMEM 1밀리리터에 희석된 상등액이 함유된 바이러스 0.1밀리리터를 사용하여 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 세포를 배양합니다. 3-4시간 후, 5%FCS가 보충된 완전한 DMEM 5ml를 추가하고 3일 동안 배양합니다.

3일 후, 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 담긴 10cm 접시 40개에서 감염된 세포를 채취하고, 펠릿 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 200배 G로 채취합니다. Resus는 15ml의 DMEM 배지 교란 세포에 3번의 동결-해동 주기로 현탁시킵니다. 1, 800회 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.

바이러스 입자 정화를 위해 바이러스 입자를 정제하기 전에 상층액을 영하 20도로 보관하십시오. 14ml UltraClear 튜브에서 불연속적인 염화세슘 구배를 준비합니다. 먼저 2ml의 고밀도 염화 세슘 용액을 튜브 바닥에 붓습니다.

그런 다음 첫 번째 용액 위에 2ml의 저밀도 염화 세슘 용액을 천천히 첨가합니다. 바이러스 상등액을 cesium chloride 구배 위에 조심스럽게 로드합니다. 원심분리 후 섭씨 130, 000회 및 섭씨 18도에서 1시간 30분 동안 스윙 SW 40 로터의 상단 원심분리기에서 최대 2-3mm의 미네랄 오일을 튜브에 채웁니다.

두 개의 흰색 띠가 두 개의 염화 세슘 용액 층 사이의 계면에서 명확하게 볼 수 있습니다. 21 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 성숙한 cav 두 입자가 포함된 아래쪽 밴드를 옆으로 뚫습니다. 빈 바이러스 입자에 해당하는 상위 밴드를 모으지 않도록 가능한 한 많이 시도하십시오.

집단 바이러스 입자를 염화세슘 용액과 혼합하여 14ml 투명 튜브에 연속 염화 세슘 구배를 준비합니다. 스윙 SW 40 로터의 상단 원심 분리기에서 최대 2-3mm의 미네랄 오일을 130, 000 회 G 및 18도에서 18 시간 동안 채 웁니다. 원심분리 후, 앞서 설명한 대로 주사기로 나란히 구멍을 뚫는 밴드가 포함된 흰 송아지 2개를 수집합니다.

다시 말하지만, 나머지 상위 밴드를 수집하지 마십시오. 이것은 두 밴드를 더 잘 분리하는 이 연속 그라디언트에서 더 쉬워야 합니다. 수집된 현탁액의 총량은 2밀리리터를 초과해서는 안 됩니다.

다음으로 cidex G 25 PD 10 컬럼을 30mL의 PBS와 평형을 이룹니다. 바이러스 현탁액을 컬럼에 로드하고 500마이크로리터 분획으로 용리를 통해 흐름을 버리고 PBS는 일반적으로 탈염된 cav 2 입자를 포함하는 분획 5-7을 수집합니다. 분획을 함유한 바이러스는 축복받은 냄새가 있기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다.

마지막으로, 1.5ml의 CAV 2 현탁액에 150마이크로리터의 글리세롤을 첨가하고 섭씨 영하 80도의 Eloqua에 보관하여 종말점 희석으로 cav 2를 적정하고 정제된 바이러스의 분취액을 얼음에서 해동한 후 10에서 마이너스 2, 10에서 마이너스 12에 이르는 10배 연속 희석을 수행합니다. 각 바이러스 희석액 50마이크로리터를 96웰 플레이트의 5웰에 첨가하고, 네 번째 DKE에 1.5배, 10을 첨가하고, 각 웰에 1개의 세포를 첨가하고, 5일째에 섭씨 37도에서 5일 동안 5%CO2로 플레이트를 배양합니다. 감염 후 현미경 관찰을 통해 CPE 출현을 모니터링합니다.

감염성 역가는 바이러스 벡터를 생산하기 전에 read and men 통계적 방법을 사용하여 조직 배양 감염 선량의 중앙값으로 결정됩니다. 전이유전자에 대한 발현 카세트를 지닌 재조합 CAV 2 게놈은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 구축됩니다. 먼저, 관심 유전자를 거대세포바이러스 조기 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 함께 발현 카세트로 셔틀 플라스미드에 클로닝하고, 그 양옆에는 업스트림 및 다운스트림 재조합 표적 염기서열을 나타내는 2개의 CAV 2개의 유래 게놈 염기서열이 있습니다.

제 2 단계에서, 발현 카세트는 상동 재조합에 의해 셔틀 플라스미드로부터 CAV 2 게놈으로 삽입된다. GOI 발현 카세트의 삽입은 재조합 게놈에서 EA와 E one B 유전자의 일부를 결실시킵니다. 재조합 게놈 플라스미드가 얻어지면 DKE one 세포를 보완하는 CAV 2 E one을 사용하여 바이러스 입자를 생성합니다.

감염된 세포에서 생성되는 많은 양의 바이러스 입자로 인한 명확한 세포병성 효과는 명시야 현미경 검사 또는 형질전환 유전자 발현으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이 예는 CAV 두 벡터를 발현하는 GFP입니다. 새로운 DKE one 세포를 사용하여 여러 차례 바이러스 증폭 라운드를 거친 후 바이러스 입자는 염화 세슘 구배에서 초원심분리로 정제됩니다.

농축된 바이러스 입자는 세슘 구배(cesium gradient) 내에서 두 개의 유백색 띠로 나타납니다. 하단 밴드는 수집해야 하는 성숙한 재조합 cav 2에 해당합니다. 위쪽 밴드에는 피해야 하는 비어 있는 비감염성 입자가 포함되어 있습니다.

그 결과로 생성된 재조합 송아지 2 벡터는 in vitro 또는 in vivo 등 다양한 종에서 거의 모든 세포 유형을 transduction하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 도시된 것은 CAV 2를 발현하는 GFP가 스테레오 택시에 의해 마우스 중추 신경계의 다른 영역에 주입된 하나의 응용 사례입니다. 이 프로토콜은 높은 역가와 순수하고 순수한 바이러스 스톡을 생성하기 때문에 치상회(dentate gyrus) 또는 DG에서 CAV 2 벡터를 발현하는 PBS 희석 GFP를 1마이크로리터 정도로 주입하면 40-50%의 신경 세포 형질도입이 이루어집니다.

더욱, 선조체에서 2개의 벡터를 표현하는 PBS의 2 마이크로리터의 축삭 주입에서 수송되는 C 2의 능력 때문에, 선조체에 있는 2개의 벡터를 표현하는 묽게 된 GFP는 거의 80%의 nigro stri AAL 신경세포의 transduction를 가능하게 한다, nigra pars compacta 그것의 발달 후에. 이러한 기술은 백신학 또는 신경과학 분야의 연구자들이 다양한 동물 모델에서 뇌의 새로운 항원과 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 따라서 CAF 두 파생 벡터로 작업하는 것은 개인 보호 장비 및 BSL 두 실험실의 층류 후드 작업을 포함한 적절한 봉쇄 및 폐기물 처리 조치와 같은 매우 위험하고 신중할 수 있음을 잊지 마십시오.