Name: 휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 학습하세요 단일 세포 미세주입 기법으로 Lucifer Yellow를 이용해 생세포 간 갭정션을 통한 세포 간 소통을 시각화하는 방법을. 이 기술은 기능적 갭정션의 세포 결합 정도를 평가하여 신경과학과 면역학 연구에 활용됩니다.

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저자는 브라질에서 간극연접에 의한 세포간 통신에 대한 연구를 소개한 Gilberto Oliveira-Castro 교수를 기리기 위해 이 논문을 헌정합니다. 이 작업은 Capes, CNPQ 및 Faperj의 자금 지원을 받았습니다.

<html> 세포의 1. 준비 <ol><li> 흉선 상피 세포 라인 (IT76M1) 또는 셀의 문화를 유지하는 것은 인큐베이터에서 테스트하기 (37 ° C / 5 % CO 2). </li><li> PBS 1X와 세포를 씻으 (이 항목에 배를 반복). </li><li> 5 분 동안 세포에 트립신을 추가합니다. </li><li> 트립신 원심 분리 (5 분, 800 XG)와 함께 세포를 10 % FBS (소 태아 혈청)와 (항목 1.3 첨가 트립신 볼륨 회) 배지를 추가한다. </li><li> 혈구의 세포를 계산합니다. </li><li> 세포를 결합 할 수 있도록 서로 밀착 될 필요가 같은 세포 유형에 따른 세포의 농도를 조정. 주 : 우리의 경우는 35mm 배양 접시 당 3 × 105 세포를 사용 하였다. </li></ol> 2. 마이크로 피펫 준비 <ol><li> 직경의 최종 0.2 μm의 유리 모세관 마이크로 피펫 (1.5 mm 직경)로 지정된 약 30 MΩ의 최종 저항을 달성하도록 마이크로 피펫을 당겨F &quot;&gt; 17, 18. 참고 : 또는 주입 피펫을 구입할 수 있습니다. 저항이 셀 크기에 따라, 예를 들어 높은 저항 미세 예 (100-150 MΩ) 19, 췌장 선포 세포에 필요한 것이다. 발생할 수있는 일반적인 문제는 다음 마이크로 피펫을 방해 할 수 있습니다 전에 여과 또는 원심 분리를 요구할 수있다 루시퍼 노란색 용액의 침전이다. 주입 전에, 마이크로 피펫을 방해 또는 중단 (13)의 임의의 유형이 있는지 감지하는 현미경으로 분석한다. 마이크로 피펫을 식염수 내부 마이크로 피펫 팁 LY 주입함으로써 시험 될 수있다. </li></ol> 3. 테스트하기 마이크로 피펫 <ol><li> 150 밀리몰 / L LiCl을에서 루시퍼 노란색 용액 (5 %)을 준비하고 주사기를 사용하여 마이크로 피펫을로드하거나 메우기에 의해 (그것을 LY 솔루션에 넣어). </li><li> 마이크로 파이프를 배치마이크로 인젝션 워크 스테이션 IT76M1 세포와 35mm 페트리 접시 위에 TTE 셀 매체에 유리 마이크로 피펫의 팁 잠수함. 마이크로 피펫에 초점 펄스를 적용하여 염료 흐르는 테스트를 수행합니다. </li></ol> 4. 단일 셀 루시퍼 노란색 미세 주입 <ol><li> 천천히 미세 조작기를 이용하여 세포에 피펫을 낮추고, 오른쪽 높은 그니 인터넷 양이온 (40X)을 사용하여 전지 층 위에 초점 현미경. </li><li> 선단이 세포막을 터치하기에 충분히 근접 할 때 표적 세포 천공 및 세포 내로 LY 소개 작은 hyperpolarizing 펄스를 적용한다. 염료의 순 비용에 따라 달라집니다인가 전압을 주입한다. 표 1에 나타낸 바와 같이 다르게는, 다른 염료는 이러한 기술과 함께 사용될 수있다. 참고 : 원칙적으로 MW있는 모든 친수성 염료 이하 1KDa을 사용할 수있는 것보다. 그러나, 전송 속도는 무게와 친수성에 따라 달라질 수있다. 또한, 유를사용되는 염료의 nspecific 전송이 평가되어야한다. </li><li> 셀 이미지를 염료 주입 후 3 분을 캡처 또는 시간 경과 현미경 (초당 30 프레임)으로 작은 영화를 만들. 참고 : 유사한 접근 방식 (2015) 20 히토미 등으로 볼 수있다. 그림 2와 같이 간 교량에 의한 통신 (불완전 유사 분열), 갭 접합을 통과하지만 권장 간 교량 및 nanotubules의 특정 유형을 통과하지 않습니다 rhodamin 덱스 트란 (2에서 10 KDa의에)의 공동 주입을 방지하려면 . </li></ol>

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</ol>

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

간 채널에 의해 투과성 16 요구되지만, 기능적 간 간극 결합의 존재, 불 투과성 멤브레인 추적자의 사용을 확인하기 위해. 형광, 제 형광 염료는 세포 간 결합 (22), 비 접합부 (3) 사이의 막 투과성이므로 루시퍼 옐로우 염료 (15)에 의해 치환 된 관찰. 현재, 형광 추적자의 많은 다른 유형 중에서 최선의 선택 범위와 실험의 조건에 따라 달라집니다 찾을 수 있습니다. 형광 염료 셀 로딩의 과정 형태의 평가, 단셀의 기능과 셀 간의 이동의 운동 속도를 허용한다. 또한, 염료는 마이크로 인젝션 C 정도되므로, 셀 (21), (23) 사이의 갭 정션의 생리적 역할에 대한 이해를 허용ellular 통신 연결된 셀의 개수와 관련이있다. <p cla...

갭 접합은 인접 셀 1 사이에서 상호 통신을 허용 간 채널입니다. 이 통신은 각각의 채널 간을 형성 connexon 또는 hemichannel에 기여 둘 이상의 이웃 셀을 연결한다. 포유 동물 세포에서, connexon는 세포질 내에서이 네 개의 경막 도메인 및 C 및 N 단자 여섯 코넥 단량체에 의해 형성된다. 간극 연접 만 이온 초 메신저 작은 대사의 흐름을 허용하지만, 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장과 분화 3, 4, 5, 6 등의 많은 생리적 과정에 셀룰러 통신의 여러 형태에 기여하지 7,8. 또한 갭 접합이와 관련이있다암 9, 10, 11 근위축증 일부 유전 질환 및 질병 12 탈수 초성 질환을 포함하는 많은. 간 크로스 토크의이 유형은 여러 가지 방법으로 13, 14, 15, 16에 의해 평가 될 수있다. 본 논문에서는, 우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 셀과 마이크로 피펫의 미세 조작기의 사용과 흉선 상피 세포 라인에 루시퍼 노란색 염료의 주입을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 일반적으로이 실험 절차는 염료와 함께로드 셀에 연결 셀의 평균에 의해 분석 될 수있다. 또한,이 방법은 갭 아래 분자량을 갖는 다른 형광 염료로 사용될 수있다약 1,000 달톤 인 접합 차단.

<table><tbody><tr><td>Lucifer yellow</td><td>Sigma</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>리튬 클로라이드</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Cultilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>진동 절연 테이블&nbsp;</td><td>Newport</td><td>VH3036W-OPT</td><td>진동으로부터 실험을 보호하고 세포 손상을 방지하기 위해 진동 절연 테이블이 필요합니다</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MMO-203</td><td>이 장비는 세포 마이크로 주입에 필요한 마이크로 피펫의 정밀 조정을 가능하게 합니다.</td></tr><tr><td>전류 발생기&nbsp;</td><td>디지타이머</td><td>DS2</td><td>마이크로피펫을 통한 염료 흐름을 생성하기 위해 마이크로피펫 내부에 전극이 있는 전류 발생기 또는 커패시턴스 보상 회로(구형 전위계) 또는 새로운 패치 클램프 증폭기의 전류 주입 기능이 있는 증폭기 및 플레이트 접시에 잠긴 접지선을 사용하여 1나노 암페어 미만의 전류를 공급했습니다. 또는 공장 권장 사항에 따라 공압 마이크로 인젝터로 염료를 주입할 수 있습니다.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

간연접은 이웃 세포의 통신을 허용하는 세포 간 채널입니다. 이 통신은 갭 접합을 형성하기 위해 각 인접 세포에 의한 반채널의 기여에 따라 달라집니다. 포유류 세포에서 반채널은 6개의 커넥신(connexin), 4개의 막관통 도메인이 있는 단량체, 세포질 내의 C 및 N 말단에 의해 형성됩니다. 간극연접(gap junctions)은 이온, 2차 전달자(second messenger) 및 작은 대사 산물의 교환을 허용합니다. 또한 시냅스 전달, 심장 수축, 세포 성장 및 분화와 같은 생리학적 과정 내에서 다양한 형태의 세포 통신에서 중요한 역할을 합니다. Lucifer Yellow의 단일 세포 미세 주입을 수행하여 살아있는 세포의 간극 연접을 통한 세포 통신을 시각화하는 방법을 자세히 설명합니다. 기능적 갭 접합에서 염료는 적재된 셀에서 연결된 셀로 확산될 것으로 예상됩니다. 형광의 확산을 실시간으로 평가할 수 있기 때문에 간극연접을 연구하는 데 매우 유용한 기술입니다. 세포와 마이크로피펫을 준비하는 방법, 마이크로매니퓰레이터를 사용하는 방법, 상피 세포주에 저분자량 형광 염료를 주입하는 방법에 대해 논의합니다.

이 세포는 (43) (21) 넥신에 의해 형성 기능 갭 접합을 표현 설명했다으로 흉선 상피 세포주 IT-76MI는 갭 접합에 의해 염료 커플 링을 평가하는 데 사용되었다. 피펫의 팁 아래 하나의 셀에 적용 할 때 그림 1은 루시퍼 노란색의 주입을 보여줍니다. 몇 분 후, 연결된 셀 갭 정션을 통한 형광 염료의 확산을 나타내는 형광체 (별표)가된다. 세포 및 시간 형광되었다 할 수는 직접 이들 세포 간의 셀룰러 통신의 정도와 관련된다. 도 2는 흉선 상피 세포 LY의 주입 및 삽입 (삽입 d)는 LY 로다 민 및 덱스 트란 (10KDa)의 공동 - 주입을 보여 나타낸다. 예상대로 로다 민 덱스 트란 안 때문에 고 분자량의 수행 있지만 LY는, 인접 셀에 전달합니다. 또한, GJ 차단제의 존재 (삽입 F), 옥탄 올, BLO주변 셀들에 대한 염료의 통로 cked. 대안 적으로, 하나의 특정 셀 또는 ...

우리는 살아있는 세포에서 갭 접합을 통해 셀룰러 통신을 시각화 루시퍼 노란색의 단일 세포 미세 주입을 수행하고 몇 가지 유용한 팁을 제공하는 방법을 여기에 대해 설명합니다. 우리는이 논문으로 인해 기능 갭 접합에 세포 결합의 정도를 평가하기 위해 모두 도움이 될 것으로 기대하고있다. 여기에 설명 된 모든 1,000 달톤 이하의 분자량을 가진 다른 형광 염료에 적응 원칙적으로 될 수있다.

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

안녕하세요, 제 이름은 아나엘입니다. 저는 Oswaldo Cruz Foundation의 Cellular Communication Laboratory에서 일하고 있습니다. 우리는 여기에서 면역 체계와 간의 맥락에서 P2 수용체와 갭 주사를 연구합니다.오늘은 세포의 미세 주입을 소개하겠습니다. 갭 주사는 시냅스 전달, 심장 수축 등과 같은 생리학적 역할을 합니다. 이 기술의 경우 갭 주입이 기능적인지 여부를 연구할 수 있습니다.자, 미세 주입 설정의 기본 구성 요소를 살펴 보겠습니다. 여기 우리가 세포를 볼 수 있는 거꾸로 된 형광 현미경이 있습니다. 결과를 기록하기 위한 CCD 카메라입니다.우리는 여기에 염료를 세포에 도입 할 전류 발생기를 가지고 있습니다. 다음으로 미세 전극이 연결된 홀더가 있습니다. 그리고 홀더에 연결되어 Z, Y, X의 3축에서 미세전극의 이동을 허용하는 미세매니퓰레이터는 실험을 시작하기 전에 미세전극을 만들어야 합니다.우리는 이 붕규산 유리 모세관과 polar라는 장비를 사용합니다. 여기에 붕규산 모세관을 부착합니다. 이 텅스텐 필라멘트를 가열하여 두 개의 미세 전극을 만듭니다.이제 텅스텐 필라멘트의 가열과 여기의 파동을 통해 두 개의 미세 전극을 만들기 위해 아래로 당길 것입니다. 쉬운. 첫 번째 단계는 미세 전극에 염료를 채우는 것입니다. 여기서 한 가지 팁은 실험을 수행하기 위해 팁에만 몇 마이크로리터를 채워야 한다는 것입니다.모든 것을 채울 필요는 없습니다. 자세한 내용을 메모하십시오. 끝부분만 채웁니다.실험을 시작해 보겠습니다. 우리는 여기 나트륨 용액의 페트리 접시에 세포를 가지고 있습니다. 현재 발전기에 연결된 은색선.이제 헤드 스테이지에 미세 전극을 부착해야 합니다. 여기 헤드 스테이지에는 전류 발생기에 연결된 또 다른 은색선이 있습니다. 마이크로 전극이 부착되면 욕조 내부에 넣을 수 있습니다.피펫의 끝이 욕조에 조심스럽게 닿고 있습니다. 이 절차는 페트리 접시 바닥에 있는 팁이 충돌하지 않도록 매우 신중하게 수행됩니다. 욕조 안으로 들어가면 현미경으로 이동하여 마이크로 피펫의 그림자를 찾을 수 있습니다.확대 렌즈를 살펴보기 시작하는 것이 좋습니다. 피펫의 그림자를 찾으면 미세 조작기를 사용하여 미세 전극을 세포 쪽으로 이동할 수 있습니다. 일단 세포에 매우 가까워지면 미세 전극이 막히지 않았는지 확인하기 위해 테스트 포스트를 수행할 수 있습니다.우리는 다음에 어떻게 볼 것인가. 여기서 우리는 마이크로피펫을 보고 있으며 마이크로피펫을 세포에 매우 가깝게 조정하고 있습니다. 세포의 좌우 움직임을 볼 수 있습니다.그런 다음 필터, 형광 필터로 변경합니다. 과분극 펄스를 적용하여 피펫 끝이 막히지 않았는지 테스트할 수 있습니다. 마이크로피펫은 세포 내부에 있기 때문에 과분극 펄스를 적용하여 세포에 염료를 주입할 수 있습니다.우리는 여기에 느슨한 무료 노란색 염료를 사용합니다. 세포에 염료를 주입한 후 이웃 세포가 갭 주입으로 연결되어 있으면 몇 분 동안 기다리면 이러한 갭 주입에 의한 염료의 확산으로 이웃 세포가 밝아지는 것을 볼 수 있습니다. 우리의 실험에서 우리는 별이 표시된 5 개의 세포가 형광을 나타내는 것을 볼 수 있습니다.여기에 흉선 상피 세포에서 미세 주입의 실험의 좋은 예가 있으며, 그림 C와 D B.In A와 D는 느슨한 자유 노란색 및 다른 염료의 흉선 불활성 세포에 미세 주입을 보여주며, 삽입물에 나타난 갭 주입을 투과하지 않습니다. 그림 E 및 F의 흉선 상피 세포주는 느슨한 자유 황색으로 미세 주입되고 삽입물에는 느슨한 자유 황색과 갭 주입 블록이 있습니다. 결과는 느슨한 자유 노란색이 이웃 세포로 퍼지지 않았음을 보여줍니다.다음으로 우리는 덱사메타손의 존재 하에서 흉선 상피 세포에 미세주입을 보고 B.덱사메타손의 정량화는 그림 B.100 주사 중 3개 또는 4개의 세포가 연결된 수가 이 약물의 존재 하에서 더 빈번하게 결합의 정도를 증가시켰습니다. 초보자가 셀룰러 통신 연구에 이 중요한 기술을 수행하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다. 고맙고 안녕히 계세요.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.

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Medaka 및 zebrafish는 척추 게놈 기능의 유전자 해부에 대한 보완하고 있습니다. 이 프로토콜은 medaka의 배아에 성공 microinjection, 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하여 embryological 및 유전자 분석을위한 중요한 기술에 대한 핵심 포인트를 강조 표시합니다.

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이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

크기가 크고 조직이 비교적 단순하기 때문에 초파리 간호사 세포는 살아있는 세포 이미징 연구에 이상적으로 적합합니다. 이 동영상은 외인성 화합물이 세포로 전달되기 위한 미세주입 방법을 설명하며, 주요 프로토콜은 내인성 mRNA 전사체를 시각화하는 데 사용되는 분자 비콘(MB)이라고 하는 형광 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 절차를 보여줍니다.

Drosophila Nurse Cells의 미세주입: 세포 내 전달 방법

이 비디오에서는 자기주입기를 사용하여 마우스 배아 뇌의 유기형 절편에 있는 피라미드 뉴런에 형광 표지된 다당류를 로봇으로 미세주입하는 방법을 시연합니다. 자기주입기는 관심 생체 분자를 단일 세포로 정밀하게 전달하기 위해 현미경에서 얻은 이미지를 활용하는 로봇 플랫폼입니다.

이미지 유도 로봇 세포 미세주입: 유기형 뇌 절편 배양에서 형광 표지된 다당류를 단일 신경 세포로 정밀하게 전달하기 위한 자동화된 고처리량 기술

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

이 프로토콜은 단일 신경 줄기 세포와 뇌 슬라이스의 뉴런으로 미세 주입을위한 로봇 플랫폼의 사용을 보여줍니다. 이 기술은 다재다능하며 높은 공간 해상도로 조직에서 세포를 추적하는 방법을 제공합니다.

로봇 미세 주입을 사용하여 뇌 조각의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작

학습하세요 단일 세포 미세주입 기법으로 Lucifer Yellow를 이용해 생세포 간 갭정션을 통한 세포 간 소통을 시각화하는 방법을. 이 기술은 기능적 갭정션의 세포 결합 정도를 평가하여 신경과학과 면역학 연구에 활용됩니다.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

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