수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 환경, 리간드 결합 또는 단백질 단백질 상호 작용에 대한 반응으로 단백질의 확인 유연성 및 그 변화를 분석하는 것입니다. 이는 리간드 결합과 같은 단백질의 확인에 영향을 미치는 것으로 의심되는 다양한 조건에서 관심 단백질을 사전 배양함으로써 달성됩니다. 그런 다음 반응 혼합물을 중수소 산화물로 희석하고 다른 시간 간격으로 배양한 다음 액체 크로마토그래피 질량 분석법으로 분석하여 펩타이드 골격에 중수소가 혼입되는 정도를 측정합니다.

아미드 그룹은 보호 영역이 중수소의 통합을 감소시켰기 때문에 결합 파트너의 부재 및 존재 하에서 실험의 펩타이드 스펙트럼을 비교하면 양성자와 중수소의 무게 차이로 인한 스펙트럼의 OID의 이동을 알 수 있습니다. 결합 파트너를 추가한 후 두드러진 보호를 보이는 영역은 잠재적인 결합 부위입니다. 염기서열 범위와 중첩 펩타이드의 가용성에 따라 결합 부위는 몇 개의 아미노산으로 좁혀질 수 있습니다.

이 방법은 단백질이 어떻게 접히는지, 어떻게 풀리는지, 온도 상승이나 중금속과 같은 물리적, 화학적 영향에 어떻게 반응하는지와 같은 단백질 접힘 및 단백질 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 결합 및 단백질-단백질 상호 작용이 단백질 확인에 미치는 영향. 또한 단백질 약물 개발, 적절한 접힘 검증 및 일반적인 품질 관리에 매우 중요합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 몇 가지 어려움에 직면할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질이 펩신에 의해 잘 소화되지 않으면 염기서열 커버리지가 낮아집니다. 단백질이 응집되기 쉬운 경우 배양 중 또는 담금질 완충액을 추가한 후에 응집될 수 있으며 질량 분석기에서 낮은 신호 강도를 초래할 수 있습니다.

이 시연에서는 수소 교환 질량 분석기를 사용하여 효모 분자 chaperone, HP 90, HP 90의 Cos chaperone Sty one의 결합을 조사하고 HP 90에 결합하고 HB ninety의 ABA 활성을 억제하여 클라이언트 결합을 촉진합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 버퍼, 샘플 및 비드를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 아미드 수소 교환을 위해 컬럼을 준비하려면 가드 컬럼의 한쪽 나사를 풀고 필터를 단단히 제거합니다.

패킹 깔때기를 컬럼의 열린 끝에 나사로 고정합니다. 16인치 어댑터를 사용하여 빈 5ml 주사기를 컬럼의 하단 배출구에 부착합니다. 가드 컬럼에 가스로 단단히 고정하십시오.

깔때기 위에 슬러리 비드 재료를 몇 방울 떨어뜨립니다. 주사기의 플런저를 당겨 깔때기를 통해 가드 컬럼으로 슬러리를 흡인합니다. 깔때기에 슬러리 비드 재료를 더 바르고 가드 컬럼이 비드 재료로 완전히 채워질 때까지 절차를 계속합니다.

그런 다음 필터와 필터 링을 열린 끝 부분에 단단히 놓기 전에 깔때기를 제거하십시오. 컬럼 캡을 가드 컬럼에 나사로 고정하고 반대쪽에서 주사기를 제거합니다. 플러그로 가드 컬럼의 양쪽 끝을 닫습니다.

수소 교환 질량 분석법을 위한 시스템을 설정하기 위해 컬럼 물질이 건조되는 것을 방지합니다. 먼저 트랩 컬럼을 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 시스템에 연결합니다. 펌프 A의 유속을 0.1% 포름산을 용매로 사용하여 분당 0.4밀리리터로 설정하여 컬럼을 평형화합니다.

질량분석기를 보정한 후 HPLC의 배출구를 질량분석기 소스에 연결합니다. 펩틱 펩타이드를 먼저 측정하려면 Pepin 컬럼을 연결한 다음 분석 컬럼을 시스템에 연결합니다. 제어 소프트웨어에서 gradient type 및 mass spectrometry method를 선택하여 크로마토그래피 및 질량 분석법에 대한 파라미터를 설정합니다.

우수한 크로마토그래피 분리능을 보장하기 위해 긴 그래디언트를 선택하십시오. 질량 분석기에서 tandem mass spectra를 활성화합니다. 100-200 pomo의 열 충격 단백질 90 또는 HSP 90을 100 마이크로 리터의 H 2 L 완충액에 준비합니다.

100마이크로리터의 담금질 완충액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 200마이크로리터 샘플을 Hamilton 주사기를 사용하여 주입 밸브의 주입 포트에 주입합니다. 주입 밸브를 주입 위치로 전환하고 크로마토그래피 프로그램을 시작합니다.

다음으로, 생성된 펩타이드에 대한 데이터베이스를 검색하여 heat shock protein 90의 소화 펩타이드를 식별합니다. 얼음물을 추가하여 시스템 온도를 섭씨 0도로 낮춥니다. 탠덤 질량 분석기 없이 실제 수소 교환 실험에 사용될 그래디언트를 사용하여 이 단계를 반복합니다.

열 충격 단백질 90 및 STI 1의 경우, 90% 용매, 10% 용매 B에서 45% 용매, A 55% 용매 B에서 10분 구배를 사용하고, 사용된 그래디언트에서 식별된 펩틱 펩타이드의 머무름 시간을 결정하고, 펩타이드 서열, 펩타이드 전하, 상태 및 머무름 시간으로 구성된 목록을 만듭니다. 이것은 수소 교환 실험 후에 각 펩티드를 확인하기 위하여 이용될 것입니다. 단백질 단백질 상호 작용 계면을 식별하려면 먼저 그래디언트 및 질량 분석법을 설정하십시오.

제어 소프트웨어에서 90% 용매, 10% 용매 B에서 45% 용매까지 10분 선형 그래디언트를 사용합니다. 55%용매 B 짐은 300에서 1, 500의 질량 대 책임 비율 사이 탐지를 위해 낙관되는 질량 분광법 방법, 비록 펩티드의 대부분이 1000의 질량 대 책임 비율 이하에 있을 것이더라도. 주입 밸브를 부하 위치로 설정하고 6포트 밸브를 설정합니다.

적재 탈염 위치에서 적재 펌프의 유량을 분당 0.4밀리리터로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변경되지 않은 참조와 100% 대조군 샘플을 실행한 후 1 - 5마이크로리터 부피로 20-100피코몰의 열 충격 단백질 90을 준비합니다. 온도 조정 중수소 산화물 버퍼를 추가하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 정의된 정확한 기간 동안 샘플 부피를 최대 100마이크로리터 인큐베이트까지 가져옵니다.

교환의 동적 범위를 결정할 때 100 마이크로 리터의 얼음을 차갑게 넣고 완충액을 담금질하고 피펫을 위아래로 두 번 빠르게 200 마이크로 리터를 HPLC의 주입 밸브에 주입합니다. 주입 밸브를 주입 위치로 전환하고 즉시 크로마토그래피 프로그램을 시작합니다. 2분 후 6포트 밸브를 탈염 로딩 위치에서 용리 위치로 전환합니다.

상호 작용하는 단백질이 없을 때 각 펩티드에 대한 중수소 통합을 결정하기 위해 각 단백질에 대해 개별적으로 이 작업을 수행하여 상호 작용 표면 혼합 열 충격 단백질 90을 STI의 최소 2배 과잉과 결합하여 평형을 결합 상태로 이동시키고 복합체 형성이 평형 상태에 있을 때까지 원하는 온도를 배양했습니다. 배양 후 온도 조정 중수소 산화물 버퍼를 추가하여 샘플 부피를 최대 100마이크로리터까지 가져오고 정확히 정의된 기간 동안 배양합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 얼음 차가운 담금질 완충액을 추가하고 피펫을 위아래로 두 번 빠르게 단백질을 주입하고 이전과 같이 실행합니다.

적절한 소프트웨어로 획득한 데이터를 분석하고 결정된 머무름 시간을 사용하여 분석에서 각 펩타이드를 찾습니다. 변경되지 않은 단백질에 대한 동위원소 분포의 OID를 계산하고 수소 교환 실험의 경우 표적 단백질의 중수소 혼입 단독 및 과도한 결합 파트너와의 통합을 비교합니다. 이것은 상용 소프트웨어를 사용하여 자동으로 또는 스프레드시트 프로그램 M을 사용하여 수동으로 수행할 수 있으며, HS P 90과 STI 사이의 직접 단백질 상호 작용은 중수소 산화물 라벨링 후 HS P 90의 부재 및 존재 시 STI 1 펩타이드 스펙트럼을 비교하여 테스트되었습니다.

결과 차이 플롯은 TPR 2 A 및 TPR 2 B의 대부분의 펩타이드가 HS P 90의 존재 하에서 강력한 보호를 나타내며, 이는 이러한 영역이 HS P 90과 상호 작용함을 나타냅니다. TPR 2 A의 보호는 HS P 90 펩타이드와 복합체를 이루는 STY 1 TPR 2 A TPR 2 B의 결정 구조에서 쉽게 합리화 될 수 있으며, 이는 DEUTERO 통합으로부터 보호되는 아밀로이드 양성자의 수에 따라 착색됩니다. 단백질 단백질 상호 작용에서 이러한 명확한 보호가 항상 관찰되는 것은 아닙니다.

STI 1이 있는 경우 HSP 90의 보호는 STI 1만큼 뚜렷하지 않고 국지화되어 있지도 않습니다. 모든 펩타이드는 중수소 결합으로부터 약간 증가된 보호를 보여줍니다. 여기에 보이는 것은 효모 HS P 90의 만화 표현입니다 중수소 통합에서 보호되는 amli 양성자의 수에 따라 착색, STY 하나는 단백질의 어떤 영역도 그 존재에 더 많은 유연성을 보여주지 않기 때문에 HS P 90을 전 세계적으로 안정화합니다.

이러한 감소된 중수소 결합이 다래끼 1과의 직접적인 상호 작용에서 비롯된 것인지 아니면 알로스테릭 효과를 통해 발생하는지는 명확하지 않습니다. HSP 90 연속 라벨링, 수소 교환, 질량 분석법을 확인하여 서로 다른 단백질 영역의 역학을 연구했습니다. 여기에 도시된 것은 HSP 90의 뉴클레오티드 결합 도메인에서 나온 펩티드 43 내지 62의 스펙트럼입니다.

STI one의 존재 유무에서 펩타이드 스펙트럼은 배양 시간이 길어질수록 증가하는 중수소의 시간 의존적 통합을 보여줍니다. 보호 수준은 잠복기 전반에 걸쳐 변화하며, 잠복기가 짧을수록 더 큰 차이를 보이고 가장 긴 시간에서는 거의 유사한 환율을 보입니다. 이것은 더 낮은 수준의 안정화 또는 빈번한 해리 및 연관과 함께 동적 상호 작용의 영역을 암시합니다.

이 절차를 시도하는 동안 조건을 꼼꼼하게 일정하게 유지하고 교환 반응을 시작하기 전에 모든 것을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 방법을 사용하여 단백질 복합체에서 상호 작용 부위의 위치와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.