Name: 성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 배우세요 성게 수정란의 고처리량 미세주입 기술로 RNA와 단백질 발현을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 발달생물학 연구에서 유전자 기능을 효율적으로 연구할 수 있게 합니다.

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우리는 촬영 지원을위한 원고와 베티 Cowgill의 중요한 읽기 산티아고 레즈 감사합니다. 우리는 또한 자신의 중요한 의견을 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 델라웨어 대학의 연구 기금에 의해 지원됩니다.

1. 프로타민 황산염의 제조 (PS) 요리를 코팅 <ol><li> 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 탈 이온수, 증류수 (DDH 2 O) 50 ㎖에 PS 0.5 g을 첨가하여 프로타민 설페이트 (PS)의 1 % 용액을 제조 하였다. PS의 완전한 해체를 확인하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 벤치 통에 빠른 속도로 잘 흔들어. 이 솔루션은 (완전히 각 사용하기 전에 젤 같은 침전물을 분해해야합니다) 3 최소한 3 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 60mm X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시의 소매를 가지고 벤치에 모두 뚜껑과 바닥을 배치. </li><li> 최소 2 분 동안두고, 표면을 커버하기에 충분한 각 접시에 1 %의 PS 솔루션을 (모두 바닥과 뚜껑을 사용할 수 있습니다) 붓는다. 4 ℃에서 저장 될 때 나머지의 PS 솔루션을 3 개월 이내에 여러 번 재사용 할 수 있습니다 </li><li> 장소 증류수 DH (2 O)로 가득 비커에 요리를 PS 처리. 에 dH보다 2 O를 실행에서 비커를 남겨 이상10 분. </li><li> PS-코팅 된 요리는 저장을 위해 즉시 또는 건조한 공기 사용할 수 있습니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 그들을 커버. 그들은 1 달 3 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 성게 배우자를 얻고 미세 주입을위한 PS-코팅 접시에 계란을 무력화 <ol><li> 배우자 3 (그림 2)를 출시 평활근의 수축을 유도하는 동요 또는 0.5 %의 KCl 최대 1 ㎖의 intracoelomic 주사 알 성게. </li><li> 동물 수컷이라면, 백색 정자으로 나타낸 바와 같이, 1.5 ㎖의 튜브에 동물의 표면으로부터 정자 건조수록. 드라이 정자는 생물학적 기능의 큰 손실없이 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 동물 인해 노른자 내용으로 노란색으로 표시된 바와 같이 여성, 바다 물이 가득 비커에 gonopores 침지하여 배우자를 수집하는 경우. 계란 gonopores에서 발표 및 중력에 의해 아래로 정착 될 것입니다. &lt;/ 리&gt; <li> 이물질 등 80 μm의 나일론 필터 메쉬를 사용하여 동물의 등뼈로 계란을 필터링합니다. 계란이 산란 후 5-7 시간 내에서 사용하는 경우 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. </li><li> 계란을 Dejelly : <ol><li> 계란의 약 1 ㎖에 산성 바다 물 100 ㎖를 준비합니다. 5.1-5.2 pH가 8.0에서 해수의 pH를 조정하는 0.5 M 구연산을 사용합니다. 산도가 너무 낮은 수정을 감소하고 pH가 너무 높은 계란은 PS 코팅 된 플레이트에 부착 할 수 없습니다. </li><li> 산성 바다 물에 계란 (이하 1 ㎖)를 추가하고 계란은 10 분 동안 얼음에 정착 할 수 있습니다. 대안 적으로, 젤리 코트의 제거는 치료 중에 계란의 부드러운 소용돌이에 의해 촉진 될 수있다. 하나는 3 ~ 4 분에서 효과적으로 dejelly이 방법을 S.의 purpuratus 계란을 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게, 산성 바다 물을 부어 신선한 바다 물을 추가하고 계란이 다시 얼음에 정착 할 수 있습니다. Dejellied 계란 수정 문제없이 최대 6 시간 동안 얼음에 저장할 수 있습니다 </li></ol></리&gt; </ol> 3. 계란에게 행 <ol><li> DDH 2 O의 10 ㎖에 3-AT의 0.84 g을 용해하여 3 aminotriazole (3-AT, MW = 84.08)의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다 이 솔루션은 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> prechilled 바다의 물 50 ㎖에 1 M 주식 솔루션의 50 μl를 추가하여 3-AT의 1 ㎜ 작업 솔루션을 준비합니다. 얼음에 솔루션을 보관하십시오. </li><li> 계란의 부드러운 처리를 위해 입 피펫 (그림 3)를 준비 : <ol><li> 피펫 팁을 수동으로 유리 마이크로 피펫 (100 × 외경 1.09 mm)에서 당겨진다. 불꽃에 두 손으로 마이크로 피펫을 잡고. 유리가 녹기 시작으로, 조심스럽게 반대 방향으로 피펫의 끝을 당겨. </li><li> 하나는 파라 필름으로 단단히 밀봉 플라스틱 튜브 (ID 1.14 mm)에 피펫을 뽑아 연결합니다. 튜브의 길이는 약 50~70센티미터해야한다. </li><li> 행 유리관에 튜브의 대향 단부에서 멸균 여과 P20 또는 P200 팁을 삽입마우스 피스로 사용할 수. </li><li> 팁의 직경을 조절하기 위해 가위로 유리 마이크로 피펫의 끝을 클립. 최적의 직경은 약간 달걀 (80 μM)의 직경을 초과한다. </li></ol></li><li> 각 PS-코팅 접시 (바닥 또는 뚜껑)에 1 mM의 3-AT 바다 물 4 ㎖를 붓는다. </li><li> 입 피펫을 입에 P20/P200 팁을 넣어 이빨로 고정. 계란 대기음하려면 먼저 해수 소량 대기음. 종래 계란로드에 액체의 열을 구비함으로써, 하나의 입 피펫 팅 기법을 통해 최대 제어 할 것이다. </li><li> 계란 근처에 마이크로 피펫 팁을 배치하고 부드럽게 피펫에 계란 수백에서 대기음. 유리 마이크로 피펫에서 계란을 제한 할 것. </li><li> 행 직선의 끝을 이동하는 동안 부드럽게 입 피펫 그들을 불어 접시에 직선으로 계란을 dejellied. 수정 문제로 인해 P 발생할 수 있기 때문에, 바로 주사하기 전에 계란을 행3-AT 바다 물 3에 대한 노출을 rolonged. 또한, PS와 같은 양이온 성 접착제는 계란에 독성이있을 수 있고, 수정 봉투가 제거 된 경우에는 특히 오랜 기간 동안 이러한 시약으로 배아를 노출하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 저었다 계란의 라인 근처 접시에 스크래치를 확인합니다. 이러한 스크래치는 필요에 따라 용액의 유량을 조정하는 주사 바늘을 중단하는 것이 중요 할 것이다. 또한, 스크래치가 접시에 3-AT 바다 물을 붓는 전에 할 수있다. </li></ol> 4. 성게의 수정란 미세 주입 <ol><li> 미세 주입 스테이션의 전원을 켭니다. 여기에서 우리는 FemtoJet 분사 시스템의 사용을 설명한다. </li><li> 바늘 풀러를 사용하여 주입 모세 혈관을 당깁니다. 좋은 바늘의 일례가도 4에 도시된다. 참고 : RNA 주입은, 주입 모세 혈관 RNAase 오염 (31)를 방지하기 위해 전처리되어야한다 : <ol><li> 50 ML 원뿔에 주입 모세 혈관을 놓고튜브 및 여과 메탄올 / 염산 (9:1)로 50 ㎖를 추가합니다. 잘 흔들어 10 시간 이상 더 이상 하룻밤 둡니다. </li><li> 메탄올 / 염산을 붓고 모세 혈관 같은 튜브에 여과 메탄올로 2 배 린스. </li><li> 극력 메탄올 흘려 메탄올 완전한 제거를 보장하기 위해 밤새 모세관을 냉동 건조. </li></ol></li><li> 조심스럽게 바늘로드 홀더에 바늘 모세관을 탑재하고 microloader 팁을 사용하여 시료 용액의 &lt;0.5 μL로로드합니다. 샘플 용액은 보통 주입 재료 (3)에 따라 20 %의 글리세롤을 포함한다. </li><li> 현미경 단계 (접안 렌즈를 통해 볼 때 계란은 수직으로 정렬되어야한다)에 저었다 계란 요리를 놓고 계란에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 정중 마이크로 인젝션 니들 홀더 상에 적재 니들 마운트 필드의 중앙에 집중된 완벽 팁을 갖도록 바늘의 위치를​​ 조정한다. </li><li> 최대 압력 FO을 적용 버튼을 우울R 바늘 청소. 해결 방법은 바늘에서 나오는 것이다. 필요할 경우 압력을 조절 : 사출 압력은 약 1 / 3의 사출 압력 보정 압력, 90-360 고전력 증폭기의 범위에 있어야한다. </li><li> 미 수정 난자에 주입하여 솔루션의 흐름을 조절합니다. 조이스틱 미세 조작기를 사용하여 난자에 주사 바늘의 선단을 연출. 바늘 항목을 촉진 이러한 스크류 드라이버와 같은 단단한 물체와 무대의 부드러운 도청에 의해 약간의 떨림을 만들 수 있습니다. 계란 내부에 형성 주입 러스 (그림 5)을 볼 수 있어야합니다. </li><li> 사출 알약이 표시되지 않는 경우, 약간, 계란 위의 바늘의 끝을 제기 접시에 스크래치를 찾아 필드의 중간에 위치하도록 조정합니다. 부드럽게 주사 바늘의 끝을 깰 수있는 스크래치 마크에 바늘 끝을 누릅니다. 사출 알약은 t 1 / 5을 초과하지 않도록하기 위해 주입 및 보상 압력을 조절계란 (1-2시)의 그 직경. </li><li> 사출 알약이 교정되면, 희석 정자 (1:1,000) 또는 정자의 1-2 μl를 추가하여 계란을 비옥. 계란의 행을 쫓아 내기 방지하기 위해주의 깊게 잘 섞는다. </li><li> 수정 봉투 (그림 5)으로 표시되기 직후 주사를 시작합니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 저어 달걀의 선을 따라 이동하고 조이스틱 micromanipulator에 의해 제어되는 바늘을 파고하여 가능한 많은 수정란을 주입. </li><li> 10-15 분 후, 새롭게 수정란 경화 될 것이며, 더 이상 분사 될 수 없다. 무대에서 접시를 제거하고 조심스럽게 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3-AT 바다 물에 정자를 대기음. </li><li> 접합자가 건조하게하지 마십시오. 빨리 요리를 충당하기 위해 신선한 prechilled 바다 물을 추가합니다. 15 ° C에서 배아를 품어 </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 그 밖의 충돌 선언하지 않습니다.

미세 주입은 DNA, mRNA의, 재조합 단백질, 기능의 손실, 계란, 배아, 다양한 생물 1-7의 세포로 기능 시약, 염료 및 그 조합의 이득 등의 다양한 트리트먼트를 제공하는 강력한 기술이다. 미세 주입 실험을 설계 할 경우에는 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다. 그것은 전달 처리 및 주입량의 용해성을 고려하는 것이 중요하다. 미세 주입 용액은 심지어 약간 침전물을 형성하는 경향이있는 경우, 마이크로 인젝션 용 바늘이 막히는 것. 일반적으로는 어떤 침전물 솔루션 3에서 제거되었는지 확인하기 위해 바늘에로드하기 전에 이상 15 분의 솔루션을 원심 분리하는 것이 좋습니다. 다른 방법은 밀리 포아 스핀 컬럼을 통해 솔루션을 전달하는 것입니다. 이 막힘을 회피 할 수없는 경우라면 다시 팁을 깨는 완만 의해 바늘 뚫어진 가능할 수도그러나 첨단이 너무 넓 으면 용액의 흐름을 제어하기 어렵게되어 있습니다. 주입 된 용액의 많은 양의 태아...

효율적이고 재생 가능한 치료 배달 연구원의 주요 방법론적인 문제 중 하나입니다. 여러 가지 방법이 일시적으로 계란, 배아 세포로 치료 솔루션을 제공하기 위해 설립되었습니다. 이러한 방법은 1, 2, 리포 펙 (막 치료 함유 리포좀의 융합을 통해 배달) 1, 미세 충격 1 (DNA가 마이크론에 침전 (짧은 전기 펄스를 사용하여 막에서 생성 과도 모공 기준) 일렉트로 포함 크기의 금속 후 고속으로 세포에 침투하는 데 사용되는 입자) 및 전달 (바이러스가 도입 유전자의 전달 수단으로 사용된다.) 이때, 마이크로 인젝션 시약은 최소한 100 %의 효율로 임의의 솔루션을 제공하는 장점을 보유하는 유일한 방법이다. 또한, 단일 주입 용액 처리의 복잡한 칵테일로 구성 될 수있다. 이 방법은 성공적으로 사용되어왔다LY는 성게 3,4, 얼룩말 물고기 5, 마우스, 6, 7, 개구리, 소 8뿐만 아니라 조직 배양 9 단일 세포와 같은 많은 종에서 계란과 배아를 microinject. 나중에 발달 단계에서 단일 할구 주사는 10-12를 실시하고 있습니다. microinjections의 현재의 방법은 처음 Hiramoto 10에 의해 설명 된 감압 주입법에 기반하지만, 실력이 프로세스의 최적화를 향해 제되었다. 우수한 미세 주입 기술은 다른 11에 설명되어 있고, 여기에 우리가 현재 성게 (Strongylocentrotus의 purpuratus) 새로 수정 된 알을 microinject하는 데 사용되는 특정 방법 중 하나를 설명합니다. 세기 이상, 성게 가치있는 실험 모델 (15, 16)하고있다. 성게는 진화 적으로 밀접하게 (우리 포함) 척색 동물과 분석에 관련된자신의 게놈은 인간의 17과 같은 모든 주요 유전자 가족을 포함하는 것으로 나타났습니다. 그들은 기적으로 쉽게 조작 할 수있는 투명 배아 개발의 다수 생산. 모델 생물로 성게를 사용하여, 성게 사회는 우리의 수정 과정의 이해 18-21, 세포 생물학적 과정 22 ~ 24, 및 유전자 조절 네트워크 (GRNs) 25 ~ 28에 기여하고있다. 성게의 수정란에 미세 주입 몇 가지 단계가 필요합니다. 첫째, 계란은 사전 (아래에 설명) 주사에 고정 될 필요가있다. 미세 주입 요리는 음으로 대전 된 계란 3을 준수 할 수있는 양으로 대전 된 표면을 생성 프로타민 황산 (PS)로 코팅되어있다. 계란은 천연 해수 또는 인공 해수 (산도 8.0)의 두 세척 한 다음, 10 분 동안 산성 바닷물에서 배양 (산도 5.15)에 의해 dejellied됩니다. dejellied 계란은 신중하게 직선으로 저어됩니다시비 (29)의 결과로 계란의 피질에서 과립 분비 ovoperoxidase의 활성을 억제하는 데 필요한 1 내지 3mm aminotriazole-(3-AT)의 존재하에 PS 코팅 접시의 중앙. 이 단계는 시비 포락선의 경화를 방지하고, 마이크로 인젝션 니들 진입을 용이하게하기 위해 중요하다. 1 mM의 3-AT에 대한 대안으로, 10 mM의 paraminobenzoic 산 (PABA)이 사용될 수있다. 주사액 전문 마이크로 로딩 피펫 팁을 사용하는 마이크로 인젝션 용 바늘에로드 micromanipulator에 압력 부에 부착 된 홀더 (도 1)에 장착된다. 각각의 바늘은 별도의 일에 대한 여러 실험에서 각각의 접합자를 microinject하는 데 사용할 수 있습니다. 접합자가 강화 될 때까지 미세 주입은 15 분 동안 수행 할 수 있습니다. 접합자는 다음 15 ℃에서 바다 물을 배양 세척 배아 blastula 단계 부화에 도달하면, 그들은 그다지의 구성 요소를 소화 부화 효소를 해제tilization 봉투 (30)과 그들을 자연스럽게 PS-코팅 접시에서 분리 할 수 있습니다. 필요한 경우, 배아 부드럽게 부드럽게 배아에 해수를 불어 입 피펫 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시로부터 분리 될 수있다. 설명 된 방법은 다운 스트림 분석을위한 높은 처리량을 제공하는 방법, 하나의 접시 100-400 새롭게 수정란의 효율적이고 신뢰성있는 미세 주입을 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp; 공리(酒州) 40 &deg; C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>주입 현미경</td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>하중 주입 솔루션</td></tr><tr><td>나일론 필터 메시 80&nbsp; &뮤; m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>파편을 제거하기위한 필터 달걀</td></tr><tr><td>P20 또는 P200 에어로졸 장벽 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02707432 또는 02707430</td><td>구강 피펫의 일부</td></tr><tr><td>Parafilm Fisher</td><td>Scientific</td><td>13 374 12</td><td>구강 피펫의 일부</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>구강 피펫의 일부</td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>주사 접시에 젤리 제거 알을 부착</td></tr>하십시오 <tr><td>성게 S. purpuratus</td><td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>바다 물</td><td>모든 애완 동물 가게</td><td>인스턴트 오션</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 60mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>주입 접시</td></tr><tr><td>3축 거친 포지셔닝 미세 조작기 MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>주입 바늘 조작</td></tr><tr><td>3축 조이스틱 유형 오일 유압 미세 미세 조작기 MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>주입 바늘</td></tr><tr><td>조작 이송 피</td><td>펫 Fisher Scientific</td><td>오전 13시 711분 9시</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>수직&nbsp; 바늘 끌어당기는 사람&nbsp;</td><td>나리시게</td><td>PC-10</td><td>풀 주사 바늘</td></tr></tbody></table>

성게 접합자의 높은 처리량 microinjections

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

세포 및 배아로 마이크로 인젝션은 생물학적 과정의 광범위한 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. 이 방법에서는 처리 액의 소량의 개별 물리적 고정화 세포 또는 배아를 주입하는 데 사용되는 마이크로 인젝션 니들에로드된다. 높은 처리량 전달을 위해이 절차를 수행하려면 초기 교육의 필요성에도 불구하고, 미세 주입은 최대의 효율성과 세포, 계란 또는 태아에 (샘플의 복잡한 혼합물을 포함한다) 치료 솔루션의 다양한 재현 배달을 제공합니다. microinjections에 응용 프로그램은 DNA의 구조, mRNA를, 재조합 단백질, 기능의 증가, 기능 시약의 손실 전달 있습니다. 형광 또는 비색 염료 인스턴트 효율적인 전달 시각화뿐만 아니라 전달되는 용액의 양의 신뢰성 정상화하기위한 도구를 사용하는 주입 용액에 첨가된다. 한 방법은 100 ~ 400 성게 Z의 미세 주입을 가능하게10 ~ 15 분 이내 ygotes.

GFP 및 mCherry 기자의 구조는 전사 새로 수정란에 미세 주입 체외에 있었다. 배아는 (blastula 단계까지) 24 시간 동안 15 ° C에서 배양 및 혈구 관찰자 Z1 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 기자 구조의 주입은 발달 결함으로 (그림 6)를지도하지 않았다. 형광 신호의 정량화를 들어, 이미지 수집은 최대한 형광 픽셀 (그림 6D-F)를 캡처하는 낮은 배율 (100X)에서 수행 하였다. 형광 신호는 AxioVision의 4.8.2.0을 사용하여 정량 하였다. 100-200 blastulae의 모집단 내의 형광 신호의 강도에 대한 표준 오차 (데이터 미도시) 1.5 %를 초과하지 않았다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50841/5084...

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

이 절차의 전반적인 목표는 성게 접합자에 대한 고처리량 마이크로 주사를 수행하는 것입니다. 이를 위해 성게에서 산란이 유도되고 수컷과 암컷 배우자가 수집됩니다. 그런 다음 알은 산성 바닷물을 사용하여 페트리 접시에 일렬로 고정됩니다.그런 다음 정자를 난자에 첨가하여 수정시키고 미세 주입 후 원하는 Mr.N.A 기능, 시약 또는 단백질 손실의 미세 주입을 수행합니다. 정자를 함유한 3개의 A T 물은 신선한 바닷물로 교환됩니다. 이러한 배아는 형태와 특정 RNA 및 단백질의 시간적, 공간적 발현을 검사할 수 있습니다.electroporation, lip perfection, microparticle, bombardment 및 transduction과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 최소한의 시약을 사용하여 100% 효율로 모든 솔루션을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 실험당 수천 X의 단일 접시에 100-400배의 효율적이고 신뢰할 수 있는 미량 주입을 가능하게 하여 다운스트림 분석을 위한 높은 처리량 방법을 제공합니다. 이 실험을 수행하기 전에 필요한 모든 원액과 장비를 준비하십시오.조리법은 함께 제공되는 문서를 참조하십시오. 계란을 부드럽게 다루기 위해서는 입 피펫이 필요합니다. 하나를 준비하려면 유리가 녹기 시작할 때 화염 위에 양손으로 유리 마이크로 피펫을 잡고 피펫이 두 반으로 분리될 때까지 피펫의 끝을 반대 방향으로 조심스럽게 당깁니다. 다음으로, 당겨진 피펫 하나를 50-70cm 길이의 플라스틱 튜브에 연결합니다.파라폼을 적용하여 단단히 밀봉합니다. 멸균 P 20 또는 P 200 여과 된 팁을 튜브의 다른 쪽 끝에 삽입하여 마우스 피스가 마지막으로 유리 마이크로 피펫의 끝을 가위로 잘라 팁의 직경을 조정하면 최적의 직경은 약 80 마이크로 미터인 계란의 직경을 약간 초과합니다. 다음으로 프로타민 설페이트가 코팅된 접시를 준비합니다.벤치 상단에 2060mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시를 놓고 접시 뚜껑을 제거합니다. 이들은 또한 접시로 사용되며, 이하 각 접시에 PS 용액이라고하는 1 % 프로타민 황산염 용액을 붓습니다. 표면을 덮을 만큼만 추가하고 배양 후 최소 2분 동안 배양합니다.PS 솔루션을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 저장합니다. 남은 PS 용액은 섭씨 4도에서 보관할 경우 3개월 이내에 여러 번 재사용할 수 있습니다. PS 처리된 접시를 증류수를 채운 비커에 넣습니다.그런 다음 비커를 흐르는 증류수 아래에 최소 10분 동안 놓습니다. PS 코팅 접시는 즉시 사용하거나 공기 건조하여 보관할 수 있습니다. 먼지가 쌓이지 않도록 덮으십시오.최대 한 달 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 주입 모세관을 제작하려면 바늘 풀러를 사용하십시오. 바늘 풀러의 설정은 원고에 명시된 대로 경험적으로 결정되어야 합니다.성게를 낳으려면 그물을 사용하여 수조에서 동물을 꺼내 종이 타월 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 동물을 들어 단단히 잡으십시오. 흔들어주세요.또는 다음과 같이 emmic 주입을 수행합니다. 수조에서 동물을 꺼낸 후 한 손에 동물을 잡고 10ml 주사기에 연결된 20게이지 바늘을 사용하여 0.5몰 염화칼륨 1ml를 동물의 유일한 부드러운 부분인 주위막에 주입합니다. 1분에서 10분 후에 동물의 성별이 분명해집니다.수컷은 흰색 정자를 방출하기 시작하고 암컷은 노란색 난자를 방출하기 시작합니다. 동물이 수컷인 경우 피펫을 사용하여 동물 표면에서 건조된 정자를 수집하여 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 건조한 정자는 생물학적 기능의 큰 손실 없이 일주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.동물이 암컷인 경우 바닷물이 가득 찬 비커에 gno 모공을 담그고 ga 고기를 수집합니다. gno 모공에서 방출된 난자는 중력에 의해 정착합니다. 산란 후에는 알이 들어있는 바닷물을 부어 동물의 가시와 같은 파편에서 알을 걸러냅니다.80미크론 나일론 필터 메쉬를 통해 얼음 위의 깨끗한 비커에 넣습니다. 달걀을 없애기 위해 플라스틱 비커에 최대 1ml의 달걀을 100ml의 산성 바닷물에 옮기고 달걀을 부드럽게 소용돌이치게 한 다음 10분 동안 얼음 위에 가라앉힙니다. 처리 후 산성 바닷물을 조심스럽게 붓습니다.그런 다음 신선한 바닷물을 넣고 계란을 얼음 위에 가라앉힙니다. 다시. De 젤리 난자는 수정에 영향을 주지 않고 최대 6시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다. 마이크로 주사를 수행하기 직전에 1 밀리몰 3-4 밀리리터, 3 TC 물을 각 PS 코팅 접시에 붓습니다.X는 3 개의 80 c 물에 장기간 노출되는 경우 입원 문제가 발생할 수 있습니다 또는 단백질 황산염과 같은 접착제는 X.So 노출 시간에 독성이 될 수 있습니다, 특히 수정 동물이 제거 된 경우. 입 피펫 끝을 이빨로 고정하고 소량의 바닷물을 흡입하십시오. 이렇게 하면 난자가 흡인될 때 난자에 대한 통제력이 향상됩니다.다음으로, 마이크로 피펫 팁을 계란 근처에 놓고 수백 개의 계란을 부드럽게 흡인하여 유리 마이크로 피펫 안에 가둡니다. 다음으로, 팁을 직선으로 이동하면서 피펫에서 접시로 부드럽게 불어 넣어 줄을 만듭니다. 유리 피펫을 사용하여 도로 달걀 라인 근처의 접시를 긁습니다.이 긁힌 자국은 나중에 주사 바늘을 부러뜨리는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로 주입 과정에서 필요에 따라 용액의 흐름을 조정합니다. 여기에서 마이크로 주입 스테이션을 켭니다.펨토 제트 분사 시스템은 한 쌍의 집게를 사용하여 조심스럽게 사용됩니다. 바늘 로딩 홀더에 바늘 모세관을 장착합니다. 바늘 입구의 오염을 방지하기 위해 바늘 끝을 만지지 마십시오.마이크로 로더 팁을 사용하여 0.5-1.0 마이크로 리터의 샘플 주입 용액을 로드합니다. 도로 달걀이 든 접시를 현미경 스테이지에 놓고 달걀이 수직으로 정렬되도록 접시를 배치합니다. 접안렌즈를 통해 볼 때, 알에 초점을 맞춥니다.로드된 바늘을 마이크로 인젝터의 바늘 홀더에 조심스럽게 장착하고 바늘 위치가 조정되어 팁이 필드 중앙에서 완벽하게 초점이 맞춰지도록 합니다. 바늘을 청소하는 것 옆에서 버튼을 눌러 최대 압력을 가하십시오. 해결책은 바늘에서 배출되는 것처럼 보일 것입니다.사출 압력의 약 1/3에서 보상 압력으로 주입을 위해 압력을 90에서 360 HP 범위로 조정합니다. 다음으로, 수정되지 않은 난자를 주입하여 주입 설정의 흐름을 검사합니다. 조이스틱 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 주사 바늘 끝을 수정되지 않은 난자에 대십시오.바늘 진입을 용이하게 하려면 드라이버와 같은 단단한 물체로 스테이지를 부드럽게 두드려 약간의 떨림을 만듭니다. 풋 페달을 밟아 난자를 주입합니다. 주입 덩어리가 보이지 않으면 바늘을 긁힌 자국으로 가져갑니다.바늘 끝을 긁힌 자국까지 부드럽게 두드려 주사 바늘 끝을 부러뜨립니다. 약간 더 넓은 팁 개구부는 용액 흐름을 더 쉽게 만들고 부러진 팁의 날카로운 모서리는 바늘 진입을 용이하게 합니다. 수정 외피가 보이게 된 직후 정자를 추가하여 난자를 수정하십시오.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 주입을 시작하십시오. 오른손으로 바늘 끝을 수정란에 대고 누르면 거의 동시에 약간의 움푹 들어간 곳이 생깁니다. 왼손으로 잡고 있는 드라이버로 현미경 스테이지를 부드럽게 두드립니다.스테이지 컨트롤러를 사용하여 도로 접합자 라인을 따라 이동하고 가능한 한 많은 접합자를 주입합니다. 주사 볼루스는 접합자의 5분의 1을 초과해서는 안 됩니다. 10분에서 15분이 지나면 새로 수정란이 굳어지고 더 이상 주입할 수 없습니다.무대에서 접시를 제거하고 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여 정자가 들어있는 3 개의 A TC 물을 조심스럽게 흡입합니다. 접합자를 건조시키지 말고 신선하고 미리 식힌 바닷물을 빠르게 추가하십시오. 접시를 덮고 섭씨 15도에서 배양합니다.주사 후. 실험에 적합한 배아의 표현형 또는 분자 변화를 모니터링하여 리포터 구조체의 주입이 발달에 영향을 미치는지 여부를 확인합니다. GFP 및 m cherry reporter 구조체는 in vitro 전사되고 새로 수정된 난자에 마이크로 주입되었습니다.여기에 표시된 주입된 배아는 화살표로 표시된 주입된 배아와 주입되지 않은 배아를 명확하게 구별할 수 있습니다. 배아를 섭씨 15도에서 24시간 동안 배아기 단계까지 배양하고 여기에서 볼 수 있는 바와 같이 이미지화했습니다. 착색된 주입된 배아는 회색인 주입되지 않은 배아와 동일한 형태를 가지고 있습니다.이는 리포터 구조체의 주입이 어떠한 발달 결함으로 이어지지 않음을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성게를 마이크로 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 접합자 미세주입은 유전학, 세포 및 발달 생물학 연구를 위한 유용한 도구입니다.이 기술을 사용하여 성게 군집은 발달 생물학의 기초가 되는 황산염 사양, 유전자 조절, 유전자 발현 및 생화학적 경로와 같은 발달 경로에 대한 이해에 상당한 기여를 했습니다.

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

우리는 발달 규제 유전자의 잠재적인 확장기 요소를 찾아서 모자이크 zebrafish의 transgenesis 통해 기능을 평가하기 위해 방법을 보여줍니다.

향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

이 비디오는 제브라피시 난황낭에 화합물을 전달하는 배아 미세주입 기술에 대해 설명합니다.

배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

출처: Shi, J. 외, 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제 물질의 스크리닝 및 식별. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 아 세 토시린곤으로 병원성 유전자 발현을 유도한 후 세척과 재현탁을 통해 항생제를 제거하여 식물 조직에 유전자 전달을 위한 형질전환 준비 현탁액을 생성하는 과정을 시연합니다.

제브라피시 배아의 꼬리정맥에 박테리아를 미세주입하는 방법

morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.

의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

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Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

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여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

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유전적으로 감수성이 있는 유기체에서 염증 신호가 신경 발달에 미치는 영향을 모델링하기 위해, 우리는 제브라피시 유충의 Cuvier관(공중정맥)에 IL-6를 미세주입하는 프로토콜을 제시하여, 결절성 경화증 복합체(TSC) 맥락에서 염증을 통제된 유도하고 발달 영향을 평가할 수 있게 합니다.

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