성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

이 절차의 전반적인 목표는 성게 접합자에 대한 고처리량 마이크로 주사를 수행하는 것입니다. 이를 위해 성게에서 산란이 유도되고 수컷과 암컷 배우자가 수집됩니다. 그런 다음 알은 산성 바닷물을 사용하여 페트리 접시에 일렬로 고정됩니다.

그런 다음 정자를 난자에 첨가하여 수정시키고 미세 주입 후 원하는 Mr.N.A 기능, 시약 또는 단백질 손실의 미세 주입을 수행합니다. 정자를 함유한 3개의 A T 물은 신선한 바닷물로 교환됩니다. 이러한 배아는 형태와 특정 RNA 및 단백질의 시간적, 공간적 발현을 검사할 수 있습니다.

electroporation, lip perfection, microparticle, bombardment 및 transduction과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 최소한의 시약을 사용하여 100% 효율로 모든 솔루션을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 실험당 수천 X의 단일 접시에 100-400배의 효율적이고 신뢰할 수 있는 미량 주입을 가능하게 하여 다운스트림 분석을 위한 높은 처리량 방법을 제공합니다. 이 실험을 수행하기 전에 필요한 모든 원액과 장비를 준비하십시오.

조리법은 함께 제공되는 문서를 참조하십시오. 계란을 부드럽게 다루기 위해서는 입 피펫이 필요합니다. 하나를 준비하려면 유리가 녹기 시작할 때 화염 위에 양손으로 유리 마이크로 피펫을 잡고 피펫이 두 반으로 분리될 때까지 피펫의 끝을 반대 방향으로 조심스럽게 당깁니다. 다음으로, 당겨진 피펫 하나를 50-70cm 길이의 플라스틱 튜브에 연결합니다.

파라폼을 적용하여 단단히 밀봉합니다. 멸균 P 20 또는 P 200 여과 된 팁을 튜브의 다른 쪽 끝에 삽입하여 마우스 피스가 마지막으로 유리 마이크로 피펫의 끝을 가위로 잘라 팁의 직경을 조정하면 최적의 직경은 약 80 마이크로 미터인 계란의 직경을 약간 초과합니다. 다음으로 프로타민 설페이트가 코팅된 접시를 준비합니다.

벤치 상단에 2060mm x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시를 놓고 접시 뚜껑을 제거합니다. 이들은 또한 접시로 사용되며, 이하 각 접시에 PS 용액이라고하는 1 % 프로타민 황산염 용액을 붓습니다. 표면을 덮을 만큼만 추가하고 배양 후 최소 2분 동안 배양합니다.

PS 솔루션을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 저장합니다. 남은 PS 용액은 섭씨 4도에서 보관할 경우 3개월 이내에 여러 번 재사용할 수 있습니다. PS 처리된 접시를 증류수를 채운 비커에 넣습니다.

그런 다음 비커를 흐르는 증류수 아래에 최소 10분 동안 놓습니다. PS 코팅 접시는 즉시 사용하거나 공기 건조하여 보관할 수 있습니다. 먼지가 쌓이지 않도록 덮으십시오.

최대 한 달 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 주입 모세관을 제작하려면 바늘 풀러를 사용하십시오. 바늘 풀러의 설정은 원고에 명시된 대로 경험적으로 결정되어야 합니다.

성게를 낳으려면 그물을 사용하여 수조에서 동물을 꺼내 종이 타월 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 동물을 들어 단단히 잡으십시오. 흔들어주세요.

또는 다음과 같이 emmic 주입을 수행합니다. 수조에서 동물을 꺼낸 후 한 손에 동물을 잡고 10ml 주사기에 연결된 20게이지 바늘을 사용하여 0.5몰 염화칼륨 1ml를 동물의 유일한 부드러운 부분인 주위막에 주입합니다. 1분에서 10분 후에 동물의 성별이 분명해집니다.

수컷은 흰색 정자를 방출하기 시작하고 암컷은 노란색 난자를 방출하기 시작합니다. 동물이 수컷인 경우 피펫을 사용하여 동물 표면에서 건조된 정자를 수집하여 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 건조한 정자는 생물학적 기능의 큰 손실 없이 일주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

동물이 암컷인 경우 바닷물이 가득 찬 비커에 gno 모공을 담그고 ga 고기를 수집합니다. gno 모공에서 방출된 난자는 중력에 의해 정착합니다. 산란 후에는 알이 들어있는 바닷물을 부어 동물의 가시와 같은 파편에서 알을 걸러냅니다.

80미크론 나일론 필터 메쉬를 통해 얼음 위의 깨끗한 비커에 넣습니다. 달걀을 없애기 위해 플라스틱 비커에 최대 1ml의 달걀을 100ml의 산성 바닷물에 옮기고 달걀을 부드럽게 소용돌이치게 한 다음 10분 동안 얼음 위에 가라앉힙니다. 처리 후 산성 바닷물을 조심스럽게 붓습니다.

그런 다음 신선한 바닷물을 넣고 계란을 얼음 위에 가라앉힙니다. 다시. De 젤리 난자는 수정에 영향을 주지 않고 최대 6시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다. 마이크로 주사를 수행하기 직전에 1 밀리몰 3-4 밀리리터, 3 TC 물을 각 PS 코팅 접시에 붓습니다.

X는 3 개의 80 c 물에 장기간 노출되는 경우 입원 문제가 발생할 수 있습니다 또는 단백질 황산염과 같은 접착제는 X.So 노출 시간에 독성이 될 수 있습니다, 특히 수정 동물이 제거 된 경우. 입 피펫 끝을 이빨로 고정하고 소량의 바닷물을 흡입하십시오. 이렇게 하면 난자가 흡인될 때 난자에 대한 통제력이 향상됩니다.

다음으로, 마이크로 피펫 팁을 계란 근처에 놓고 수백 개의 계란을 부드럽게 흡인하여 유리 마이크로 피펫 안에 가둡니다. 다음으로, 팁을 직선으로 이동하면서 피펫에서 접시로 부드럽게 불어 넣어 줄을 만듭니다. 유리 피펫을 사용하여 도로 달걀 라인 근처의 접시를 긁습니다.

이 긁힌 자국은 나중에 주사 바늘을 부러뜨리는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로 주입 과정에서 필요에 따라 용액의 흐름을 조정합니다. 여기에서 마이크로 주입 스테이션을 켭니다.

펨토 제트 분사 시스템은 한 쌍의 집게를 사용하여 조심스럽게 사용됩니다. 바늘 로딩 홀더에 바늘 모세관을 장착합니다. 바늘 입구의 오염을 방지하기 위해 바늘 끝을 만지지 마십시오.

마이크로 로더 팁을 사용하여 0.5-1.0 마이크로 리터의 샘플 주입 용액을 로드합니다. 도로 달걀이 든 접시를 현미경 스테이지에 놓고 달걀이 수직으로 정렬되도록 접시를 배치합니다. 접안렌즈를 통해 볼 때, 알에 초점을 맞춥니다.

로드된 바늘을 마이크로 인젝터의 바늘 홀더에 조심스럽게 장착하고 바늘 위치가 조정되어 팁이 필드 중앙에서 완벽하게 초점이 맞춰지도록 합니다. 바늘을 청소하는 것 옆에서 버튼을 눌러 최대 압력을 가하십시오. 해결책은 바늘에서 배출되는 것처럼 보일 것입니다.

사출 압력의 약 1/3에서 보상 압력으로 주입을 위해 압력을 90에서 360 HP 범위로 조정합니다. 다음으로, 수정되지 않은 난자를 주입하여 주입 설정의 흐름을 검사합니다. 조이스틱 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 주사 바늘 끝을 수정되지 않은 난자에 대십시오.

바늘 진입을 용이하게 하려면 드라이버와 같은 단단한 물체로 스테이지를 부드럽게 두드려 약간의 떨림을 만듭니다. 풋 페달을 밟아 난자를 주입합니다. 주입 덩어리가 보이지 않으면 바늘을 긁힌 자국으로 가져갑니다.

바늘 끝을 긁힌 자국까지 부드럽게 두드려 주사 바늘 끝을 부러뜨립니다. 약간 더 넓은 팁 개구부는 용액 흐름을 더 쉽게 만들고 부러진 팁의 날카로운 모서리는 바늘 진입을 용이하게 합니다. 수정 외피가 보이게 된 직후 정자를 추가하여 난자를 수정하십시오.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 주입을 시작하십시오. 오른손으로 바늘 끝을 수정란에 대고 누르면 거의 동시에 약간의 움푹 들어간 곳이 생깁니다. 왼손으로 잡고 있는 드라이버로 현미경 스테이지를 부드럽게 두드립니다.

스테이지 컨트롤러를 사용하여 도로 접합자 라인을 따라 이동하고 가능한 한 많은 접합자를 주입합니다. 주사 볼루스는 접합자의 5분의 1을 초과해서는 안 됩니다. 10분에서 15분이 지나면 새로 수정란이 굳어지고 더 이상 주입할 수 없습니다.

무대에서 접시를 제거하고 플라스틱 파스타 피펫을 사용하여 정자가 들어있는 3 개의 A TC 물을 조심스럽게 흡입합니다. 접합자를 건조시키지 말고 신선하고 미리 식힌 바닷물을 빠르게 추가하십시오. 접시를 덮고 섭씨 15도에서 배양합니다.

주사 후. 실험에 적합한 배아의 표현형 또는 분자 변화를 모니터링하여 리포터 구조체의 주입이 발달에 영향을 미치는지 여부를 확인합니다. GFP 및 m cherry reporter 구조체는 in vitro 전사되고 새로 수정된 난자에 마이크로 주입되었습니다.

여기에 표시된 주입된 배아는 화살표로 표시된 주입된 배아와 주입되지 않은 배아를 명확하게 구별할 수 있습니다. 배아를 섭씨 15도에서 24시간 동안 배아기 단계까지 배양하고 여기에서 볼 수 있는 바와 같이 이미지화했습니다. 착색된 주입된 배아는 회색인 주입되지 않은 배아와 동일한 형태를 가지고 있습니다.

이는 리포터 구조체의 주입이 어떠한 발달 결함으로 이어지지 않음을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성게를 마이크로 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 접합자 미세주입은 유전학, 세포 및 발달 생물학 연구를 위한 유용한 도구입니다.

이 기술을 사용하여 성게 군집은 발달 생물학의 기초가 되는 황산염 사양, 유전자 조절, 유전자 발현 및 생화학적 경로와 같은 발달 경로에 대한 이해에 상당한 기여를 했습니다.