Name: FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 학습하세요 FtsZ 중합 분석을 위한 침전법, 산란광법, GTP 가수분해 분석을 사용하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세균 세포 분열 연구와 항균제 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 실험실에서의 작업은 네덜란드 과학 연구 기구(DJS)의 VIDI 보조금으로 자금을 지원받습니다. 
투과 전자 현미경에 대한 접근을 제공하고 도움을 주신 Marc Stuart와 우리 대학의 전자 현미경 부서에 감사드립니다.

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+bacterial+cytokinesis%3A+cytoskeleton+and+force+generator+all+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
<li>Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+dependence+of+polymerization+and+bundling+by+the+essential+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ.</a> PLoS One. 6 (6), e19369(2011).</li>
<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
<li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ%3A+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li>
<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

우리는 FtsZ 활성과 다른 단백질과의 상호 작용을 빠르게 분석할 수 있는 일련의 방법을 설명합니다. 광산란, 침강 및 GTPase 분석과 전자 현미경은 FtsZ 중합을 연구하는 데 널리 사용되었습니다. 우리는 기존 프로토콜을 일부 개선했으며 FtsZ 조립에 대한 다양한 조건의 영향을 보여주었으며 FtsZ 연구에 포함되어야 하는 컨트롤을 제안합니다.
FtsZ와 FtsZ 중합체와 상호 작용하는 단백질 사이의 결합에 의해 형성된 큰 구조를 구별하기 위해 저속 원심분리를 도입합니다. 이 방법은 표준 침전 분석에 비해 두 가지 장점을 보여줍니다. 첫째, 펠릿 분획의 FtsZ 폴리머는 24,600 x g에서 회전되지 않기 때문에 배경이 형성되지 않습니다. 둘째, 상호 작용하는 단백질로 형성된 구조에 존재하는 FtsZ의 양은 겔로부터 계산될 수 있습니다. 이 방법의 두 가지 중요한 단계는 배양 시간과 GTP 농도입니다. 큰 단백질 구조가 완성되면 원심분리하는 것이 중요하지만 모든 GTP가 가수분해될 때 분해되기 전입니다. 이 연구를 위한 최선의 대조군은 FtsZ와 GDP의 중합입니다. 분석에는 한 가지 잠재적인 한계가 있습니다. FtsZ는 24,600 x g에서 쉽게 회전할 수 있는 SepF와 안정적인 복합체를 형성합니다. 다른 활성제 또는 FtsZ 중합체를 묶는 약물로 침전이 수행되는 경우 분석을 조정해야 할 수도 있습니다. 배양 시간을 변경하거나 원심분리 속도를 높여 수행할 수 있습니다.
시료의 적절한 준비는 광산란 실험에서 가장 중요합니다. 단백질은 방사에 의해 사전 제거되어야 하며 모든 완충액은 사용하기 전에 여과되어야 합니다. 샘플에 응집체가 존재하면 FtsZ 폴리머에서 얻은 안정적인 신호를 방해합니다. 전자 현미경으로 FtsZ 구조를 분석하려면 그리드 준비가 주요 단계입니다. 그리드에서 샘플을 배양하는 시간은 다소 압축된 폴리머를 생성하는 효과가 있습니다. FtsZB 묶음의 경우, 배양 시간은 높은 KCl 농도에서 FtsZEc 및 FtsZBs 보다 짧아야 합니다. 결과를 비교할 수 있도록 모든 샘플에 12μM의 농도를 사용했습니다. 그러나 50mM KCl의 FtsZBs 의 경우 12μM으로 인해 그리드가 완전히 포화되므로 더 낮은 FtsZ 농도를 사용해야 합니다. 이로 인해 폴리머가 매우 압축되어 감지하기 어렵습니다. 덜 압축된 폴리머는 EM에서 감지하는 것이 좋습니다.
GTPase 분석은 FtsZ의 구조가 아닌 활성을 연구하는 데 사용되는 유일한 실험입니다. Mg2+는 FtsZ 폴리머의 GTP 회전율에 필요합니다. 따라서 Mg2+가 없으면 FtsZ는 GTP를 가수분해하지 않습니다. 따라서 Mg2+가 없는 샘플이 이 분석에서 올바른 대조군이지만 Mg의 양이온은 FtsZ 저장 완충액에 존재합니다. 대조군 샘플에 1mM EDTA를 첨가하여 제거할 수 있습니다. 이 분석의 중요한 단계는 배양 시간입니다. 주어진 시간이 지나면 FtsZ 활동을 중지하는 것이 중요합니다. 이것은 FtsZ 샘플을 96웰 플레이트의 공작석 녹색 용액으로 옮겨 달성됩니다. 그러나 공작석 녹색의 개발은 지속적인 과정입니다. 따라서 모든 샘플에 대해 동시에 측정해야 합니다. 설정된 순서로 30초마다 측정하는 잘 계획된 GTP 추가 프로토콜을 사용하면 모든 시점에 대해 동일한 배양 및 샘플 처리 시간을 얻을 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 실험을 위한 단백질의 농도를 선택하는 것입니다. 실험에서 우리는 FtsZEc와 FtsZ Bs에 대해 두 가지 다른 농도를 사용했습니다. GTP 가수분해는 FtsZBs에 비해 FtsZEc의 경우 훨씬 빠릅니다. 선택된 조건 및 12μM에서 FtsZEc의 GTPase 활성은 최대 5분 동안만 선형이며 그 이후에는 가수분해 속도가 정체됩니다. 따라서 이러한 조건에서 수행될 때 실험 데이터를 해석하기가 어렵습니다. 이 경우 두 단백질의 활성을 비교할 수 있도록 FtsZEc를 FtsZBs보다 낮은 농도로 사용해야 합니다. 다양한 출처의 FtsZ의 GTPase 활성은 다를 수 있습니다. 따라서 올바른 농도를 선택해야 합니다. FtsZ 중합 농도는 임계 농도(일반적으로 2.5-10μM)보다 훨씬 높아야 합니다. FtsZ 조립 및 분해의 역학도 중요합니다. 일부 단백질은 50mM KCl에서 FtsZB에 대해 표시된 바와 같이 GTP 첨가 후 중합에서 상당한 지연을 나타냅니다. FtsZ 폴리머의 조립 및 분해 시간을 대략적으로 추정하기 위해 GTPase 분석 전에 광산란 분석을 수행하는 것이 유용합니다. 그 후, 배양 시간과 단백질 농도를 선택할 수 있습니다. FtsZ 중합을 위해 선택한 조건이 중요하기 때문에 각 방법에서 올바른 pH 및 KCl 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 이 작업에서 우리는 pH 범위가 6.5-7.5이고 KCl 농도가 0M에서 300mM인 9가지 완충액을 연구했습니다. 우리는 B. subtilis 및 E.coli의 FtsZ와 이들의 생물학적 활성을 분석하는 가장 좋은 조건은 높은 KCl 농도와 함께 생리학적 수준(7.5)에 가까운 pH임을 알아차렸습니다. 높은 KCl 농도에서 FtsZ는 더 높은 GTPase 활성을 가지며 전자 현미경으로 더 잘 검출할 수 있는 폴리머를 생성합니다. 우리는 또한 생리학적 pH와 높은 KCl 농도가 FtsZ 조립 연구에 주로 사용되는 다른 완충액보다 FtsZ와 조절 단백질 사이의 상호 작용 연구에 더 좋다는 것을 확인했습니다. FtsZBs는 높은 KCl 농도에서 연구할 때 FtsZEc와 유사한 활성을 나타냅니다. 또한, 염 농도가 낮을 때 pH의 영향은 염 농도가 높은 완충액보다 더 눈에 띕니다. FtsZ는 KCl이 없는 완충액을 사용할 때 때때로 침전되므로 염이 없는 완충액은 피해야 합니다. FtsZ 중합체의 침전은 KCl 농도가 높은 완충액을 사용할 때 낮습니다. 이는 FtsZ와 SepF 및 ZapA와 같은 FtsZ 필라멘트를 조립하는 단백질 간의 상호 작용을 연구할 때 이러한 고차 구조가 원심분리로 쉽게 검출될 수 있기 때문에 이점이 될 수 있습니다. 모든 실험에서 우리는 10mM 농도의 MgCl2를 사용했습니다. 상대적으로 높은 Mg2+ 농도는 FtsZ 중합체를 안정화시키고 FtsZ의 GTPase 활성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 표 2에는 다양한 연구의 결과가 요약되어 있으며, 그렇지 않으면 동일한 완충액 조건을 사용하여 상이한 Mg2+ 농도에서 FtsZ 중합 및 GTPase 활성을 설명합니다 27. 유리 세포질 Mg2+의 측정된 농도는 0.9mM3입니다. GTP는 동등한 양의 Mg2+를 킬레이트화한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 GTPase 실험을 위한 최적의 Mg2+ 농도는 약 2-2.5mM로 생리학적 수준3에 가깝습니다. 그러나 실험에서 우리는 쉽게 감지할 수 있는 광산란 신호를 얻고 침강 분석 중에 FtsZ 중합체를 안정화하기 위해 10mM 농도의 MgCl2를 사용했습니다.
모델 유기체 대 장균 및 B. subtilis의 FtsZ에 프로토콜을 적용했지만 다른 유기체의 FtsZ에 적응할 수 있습니다. 생리학적 pH, 1가 및 2가 양이온의 농도는 유기체마다 다르다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 FtsZ 중합을 위한 최적의 조건은 다를 수 있습니다. 서로 다른 박테리아의 배가 시간과 성장 조건의 차이로 인해 FtsZ의 조립 동역학과 최적의 실험 조건이 달라질 수 있습니다. 그러나 우리의 프로토콜은 다른 유기체의 FtsZ를 사용한 실험을 위한 좋은 출발점을 제공합니다. 프로토콜은 조절 단백질을 사용한 FtsZ 연구 또는 FtsZ에 대한 작은 화합물 및 약물의 효과 연구에 유용해야 합니다.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>근원</td>
			<td>중합 [침전된 FtsZ의 %)</td>
			<td>GTPase [파이/FtsZ/분]</td>
			<td>Mg2+ 농도 [mM]</td>
			<td>FtsZ 농도 [μM]</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZEC</td>
			<td>~ 28%</td>
			<td>~ 2.1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>이 작품</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 50%</td>
			<td>~ 2.4</td>
			<td>10</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 43%</td>
			<td>~ 3.5</td>
			<td>5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 27%</td>
			<td>~ 4.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 5.4</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZBs</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>~ 0.8</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>이 작품</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 52% (DEAE 덱스트란 포함)</td>
			<td>~ 0.5</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 2.25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2. FtsZ 중합 및 GTPase에 대한 Mg2+ 의 영향. 이 작업의 결과를 발표된 데이터와 비교한 결과. 모든 실험은 50mM MES/NaOH, pH=6.5, 50mM KCl에서 수행되었습니다.

필수 박테리아 단백질 FtsZ는 세균 세포 분열 기계의 유용한 특성화 된 단백질이다. FtsZ는 튜 불린의 원핵 생물의 상동과 GTP 의존적으로 체외에서 중합. FtsZ 세균 1,2에 그것의 보존 특성과 고유성으로 인해 새로운 항생제에 대한 매우 매력적인 대상입니다. 세포 분열의 시작 부분에서, FtsZ 다른 세포 분열 단백질의 조립을위한 발판 역할을 midcell에서 cytokinetic 고리를 형성한다. Z-링의 형성은 분할면의 정확한 현지화에 대한 매우 중요합니다. FtsZ의 조립 역학은 이러한 밍크, SepF, 사파, UgtP, 에스라 2 (세균의 종류에 따라) 등 여러 가지 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 집중적으로 체외 똑바로 protofilaments, 곡선 protofilaments, 필라멘트의 시트, 필라멘트의 다발과 필라멘트의 튜브 등 다양한 구조에서 공부 한 데 있었다조립 버퍼, 뉴클레오티드 및 분석 3에 포함 된 추가적인 단백질에 의존 cribed. Caulobacter의 crescentus의 전자 cryotomography 실험은 Z-링이 넓은 4 동고하지 않고 비교적 짧은, 비 연속 단일 protofilaments에서 조립하는 것이 좋습니다 있지만, 생체 내에서 FtsZ의 protofilaments의 구조는 아직 완전히 이해되지 않습니다. 체외에서 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 FtsZ의 상호 작용에 반응 버퍼의 조성에 민감합니다. 예를 들어, 우리는 최근 FtsZ C-말단에 SepF의 상호 작용 사이트를 설명하고 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기가 더 이상 SepF 5에 바인딩 것을 보여 주었다. SepF-FtsZ 모텔의 상호 작용에 관한 이전의 연구에서 비슷한 FtsZ 모텔 Δ16는 여전히 SepF가 FtsZ에 보조 사이트에 바인딩 것을 제안 SepF와 cosedimented 절단 <suP&gt; 6. 이러한 연구의 차이는 pH가 6.5에서 cosedimentation 있었다 반면 FtsZ의 잘라 내기와 SepF의 더 cosedimentation가 없었다 반응 버퍼 - 산도 7.5의 구성이었다. Gündoğdu 등. SepF이 작동하지 않습니다와 pH를 6.5에서 관찰 cosedimentation가 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기와 SepF의 침전이 아닌 상호 작용에 의해 발생 될 가능성이 있음을 보여주는, 산도 6.5 7에 침전 지적했다. FtsZ의 중합에 pH와의 KCl 농도의 영향은 이미 검토되었다. E.의 중합체 pH가 6.5에서 대장균 FtsZ (FtsZ 값 Ec)는 더 길고 풍부한 중성 pH 8,9 형성보다 있습니다. Tadros 등. K는 + 바인딩이 FtsZ 적 능력 중합에 연결하고 FtsZ 활동 (10)에 대한 매우 중요합니다 지적 가의 양이온의 존재 FtsZ 값 Ec의 중합을 공부했습니다. pH는 더 critica입니다SepF의 앞의 예와 FtsZ 11 밍크의 억제 효과의 pH 의존성에 의해 같이 다른 단백질과 FtsZ의 상호 작용, 연구되고 난. pH와 염 농도가 모두 다른 단백질 FtsZ의 상호 작용에 영향을 미칠 수있다, 그것은 FtsZ 중합 연구를위한 적절한 조건 및 컨트롤을 선택하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 빛의 산란, 전자 현미경, 침강 및 GTPase의 분석 실험에 의해 FtsZ 중합 GTPase의 활성을 연구하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 직각 광 산란 실시간 12 FtsZ 중합을 연구하는 표준 방법입니다. 우리는 침강 및 GTPase의 분석에 몇 가지 개선 사항을 소개했다. 우리는 빛의 산란 및 전자 현미경을 위해 샘플을 준비하는 방법에 대해 자세히 제시한다. FtsZ 중합을 연구 문헌에서 사용되는 몇 가지 버퍼를 테스트하고 우리는 각 실험에 가장 적합한 조건을 설명했다. 우리는 또한 있어야한다을 제어하는​​ 표시가장 좋은 데이터를 얻기 위해 도입했다. 이러한 방법은 FtsZ 중합, 활동하고 간단한 방법과 대부분의 실험실에서 사용할 장비를 사용하는 다른 단백질과의 상호 작용의 빠른 연구를 할 수 있습니다. FtsZ 중합을 연구하는 더 정교한 방법이 존재하지만 종종 형광 라벨 8,13,14 더 전문 장비에 대한 액세스, 및 / 또는 FtsZ의 수정이 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 간단한 방법은 B.에서 FtsZ를 사용하여 도시된다 서브 틸리와 E. 콜리, 가장 일반적인 그램 + 및 그람 모델 생물. 프로토콜은 다른 FtsZ 단백질에 적용 할 수있다. 이 소설 FtsZs, 시간에 대한 약간의 변경, 버퍼 또는 배양 온도 예비 분석을 바탕으로 최적의 결과를해야 할 수도 있습니다. 여기에 설명 된 실험은 이러한 최적의 조건을 찾는 데 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td>Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>두꺼운 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Part 2</td></tr><tr><td>Optima MAX-XP 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td>Part 2, 3</td></tr><tr><td>스냅온 캡이 있는 폴리알로머 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>Part 3</td></tr><tr><td>AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL</td><td>Raytest 이소토펜메스거&auml; te GmbH</td><td></td><td>15000001 Part 4</td></tr><tr><td>발광 이미지 분석기 LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Part 4</td></tr><tr><td>Thermo Spectronic AMINCO-Bowman 발광 분광계</td><td>Spectronic Instruments</td><td></td><td>Part 5</td></tr><tr><td>형광 셀</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>Part 5</td></tr><tr><td>Square 400 Mesh, 구리, 100/바이알</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>G400-Cu</td><td>파트 6</td></tr><tr><td>120kV에서 작동하는 CM120 전자 현미경</td><td>Philips</td><td></td><td>Part 6</td></tr><tr><td>96 ml x 0.2 ml 플레이트</td><td>BIOplastics</td><td>B70501</td><td>Part 7</td></tr><tr><td>말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트</td><td>BioAssay System</td><td>POMG-25H</td><td>Part 7</td></tr><tr><td>PowerWave HT 마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>BioTek</td><td></td><td>Part 7</td></tr></tbody></table>

ftsz 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

세균 세포 분열 동안, 필수적인 단백질 FtsZ는 소위 Z-고리를 형성하는 셀의 중앙에 모인다. FtsZ는 체외에서 GTP의 존재에 긴 필라멘트로 중합, 중합은 여러 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 광범위하게 빛을 산란, 침강, GTP 가수 분해 분석 및 전자 현미경 등의 기본적인 방법을 사용하여 체외에서 연구되고있다. 버퍼 조건의 영향을 모두 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 상호 작용하는 FtsZ의 능력. 여기, 우리는 FtsZ 중합 연구를위한 프로토콜을 설명하고 모델 단백질로 대장균과 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) FtsZ를 사용 조건 및 컨트롤을 확인합니다. 저속 침강 분석법 FtsZ 중합체 동고 또는 관 모양 단백질 FtsZ의 상호 작용의 연구를 허용하는 도입된다. 개선 GTPase의 분석 프로토콜 테스트에게 허용하는에게 설명인산 검출 반응에서 발색 편차 폐지 표준화 인큐베이션 시간으로 96 - 웰 플레이트 셋업에서 여러 가지 조건을 사용하여 시간이 지남에 GTP 가수 분해. 광산란 연구 및 전자 현미경을위한 시료의 준비를 설명한다. 여러 버퍼가 FtsZ 중합 연구에 적합한 버퍼 pH와 염 농도를 설정하는 데 사용됩니다. 의 KCl의 높은 농도는 실험의 대부분을위한 최고입니다. 우리의 방법은 E.에서뿐만 FtsZ의 시험 관내 특성화를위한 시작점을 제공 대장균 및 B. 서브 틸리하지만 다른 박테리아에서. 이와 같이, 방법은 규제 단백질이나 FtsZ 중합에 영향을 미칠 수있는 약물의 항균 시험 FtsZ와의 상호 작용의 연구를 위해 사용될 수있다.

다양한 박테리아 유래 FtsZ의 정제 방법이 문헌에 기술되어 있으며, 그 내용은 표 1에 요약되어 있습니다.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주세요.</td>
			<td>방법</td>
			<td>수정</td>
			<td>획득 수율 [배양액 L당 mg]&gt;</td>
			<td>참고 문헌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis</td>
			<td>1) 황산암모늄 침전/이온 교환 크로마토그래피</td>
			<td>아니요</td>
			<td>40</td>
			<td>본 연구, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) 친화성 크로마토그래피</td>
			<td>His-태그</td>
			<td>검출되지 않음</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>1) 황산암모늄 침전/이온 교환 크로마토그래피</td>
			<td>아니요</td>
			<td>35</td>
			<td>본 연구, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) 칼슘 침전, 이온 교환 크로마토그래피</td>
			<td>아니요</td>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanococcus jannaschii</td>
			<td>1) 변성 조건하의 친화성 크로마토그래피/재폴딩/황산암모늄 침전/겔 여과</td>
			<td>His-태그</td>
			<td>1.3</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) 친화성 크로마토그래피/ 겔 여과법</td>
			<td>His-태그</td>
			<td>검출되지 않음</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima</td>
			<td>이온 교환 크로마토그래피/젤 여과법</td>
			<td>아니요</td>
			<td>6.7</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>친화성 크로마토그래피/겔 여과법</td>
			<td>Strep-tag, His-tag</td>
			<td>검출되지 않음</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>결핵균(Mycobacterium tuberculosis)</td>
			<td>1) 친화성/이온 교환 크로마토그래피</td>
			<td>아니요</td>
			<td>검출되지 않음</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) 친화성 크로마토그래피/겔 여과법</td>
			<td>아니요</td>
			<td>30</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquifex aeolicus</td>
			<td>친화성 크로마토그래피/겔 여과법</td>
			<td>His-tag, C-말단 절단 (331-367)</td>
			<td>검출되지 않음</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caulobacter crescentus</td>
			<td>이온 교환 크로마토그래피/황산암모늄 침전/겔 여과</td>
			<td>아니요</td>
			<td>ND</td>
			<td>25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1. 설명된 FtsZ 정제 프로토콜. ND: 결정되지 않음.
FtsZ 폴리머의 침전
처음에는 FtsZ 폴리머를 침전시키기 위해 두 가지 서로 다른 원심분리 속도를 사용하였습니다. 우리는 350,000 x g의 속도에서만 FtsZEc의 단일 폴리머가 침전되는 것을 확인한 반면(Figure 1), 190,000 x g에서는 FtsZBs의 번들만이 펠렛 분획에 존재함을 확인하였습니다(데이터 미제시). 따라서 이후 실험에서는 350,000 x g를 사용하였습니다. 광산란 실험에서는 FtsZBs의 산란 신호가 훨씬 높게 나타났음에도 불구하고, 50 mM KCl에서 중합된 FtsZEc와 FtsZBs의 비율은 비슷했습니다. 이는 FtsZBs에 의해 형성된 번들이 FtsZEc의 단일 폴리머보다 더 많은 빛을 산란시키기 때문입니다. 300 mM KCl을 사용한 실험에서는 FtsZEc와 FtsZBs 모두 펠렛 분획에서 다량의 FtsZ 폴리머를 얻는 것이 불가능했습니다(Figure 1). 우리는 이를 FtsZ 구조의 빠른 해체와 필라멘트 번들 형성의 감소가 결합되어 나타난 결과로 보고 있습니다.
FtsZ-SepF 튜불의 침전
FtsZ와 특정 활성제 간의 상호작용을 분석하기 위해 낮은 원심분리 속도에서 침전 분석을 수행할 수 있습니다. 이 속도에서는 SepF 링과 FtsZBs 필라멘트에 의해 형성된 거대 튜불 예: 또는 FtsZ와 ZapA에 의해 형성된 번들과 같이 FtsZ의 거대 구조물만 펠릿화될 수 있습니다5. 우리는 FtsZ와 SepF에 의해 형성된 튜불에 대해 이 접근 방식의 타당성을 입증하기 위해 더 낮은 원심분리(24,600 x g)를 사용하였습니다. SepF와 GTP가 모두 샘플에 존재할 때만 FtsZ가 배경 수준 이상으로 펠릿에서 회수되었으며(그림 2), SepF의 존재는 FtsZ GTPase 활성에 영향을 미치지 않아7 SepF 존재 하에서 FtsZ가 완전히 활성화되어 있음을 보여주었습니다. SepF와 FtsZ의 특이적 침전량은 (GDP를 첨가했을 때 침전되는 물질과 비교하여) 전체 SepF의 약 45% 및 전체 FtsZ의 15%입니다. 이는 SepF-FtsZ 튜불에 FtsZ보다 SepF가 더 많이 포함되어 있음을 나타냅니다. 이는 많은 SepF 링이 FtsZ-SepF 튜불을 조직하기 때문일 수 있습니다5,7. 이러한 튜불 내 SepF-FtsZ의 정확한 화학 양론은 알려져 있지 않으나, 본 결과는 FtsZ보다 SepF가 더 많이 존재함을 시사합니다.
FtsZEc 및 FtsZBs의 중합 및 번들링 특성
FtsZ의 중합 효율을 특성화하기 위해Bs 및 FtsZEc 서로 다른 완충액에서 두 단백질 모두를 다음의 방법으로 분석하였습니다. 90° 각도 광산란. 50 mM KCl 조건에서, FtsZBs FtsZ보다 20~40배 더 높은 광산란 신호를 나타냅니다.Ec 완충액 pH에 따라 (그림 3A 및 B) Buske의 결과 확인 외 등.26 완충액 내 KCl 농도를 높여도 FtsZ의 광산란 신호에는 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.Ec (그림 3D) 하지만 FtsZ의 신호는Bs 300 mM KCl 조건에서 pH 7.5일 때 약 80배, pH 6.8일 때 약 30배, pH 6.5일 때 약 45배 감소하였다 (그림 3C) 50 mM KCl가 포함된 완충액과 비교했을 때 (그림 3A). 두 단백질 모두 KCl 농도가 높을수록 FtsZ 중합체의 분해 속도가 더 빠릅니다 (그림 3C 그리고 D). Pacheco-Gómez의 연구들 외 등~임을 보여주십시오 대장균(E. coli) FtsZ의 중합 및 다발 형성은 pH에 의존적입니다. 연구자들은 50mM KCl이 포함된 완충액에서 pH 6.0일 때가 pH 7.0일 때보다 FtsZ 중합의 광산란 신호가 더 높았으며, FtsZ의 해체에 더 오랜 시간이 걸린다는 것을 발견했습니다. 8이러한 결과는 FtsZ 중합에 관한 당사의 데이터와 일치하지 않습니다.Ec 50 mM KCl에서 (그림 3B), 하지만 Pacheco-Gómez 등이 사용한 것과 달리 본 연구에서는 세 가지 서로 다른 완충액(HEPES, MES, PIPES)을 사용했다는 점에 유의해야 합니다. 외 등. MES만 사용하였습니다. 따라서 50mM KCl 조건에서는 pH뿐만 아니라 완충액 조성(이온 강도) 또한 FtsZ 중합체의 역학에 영향을 미칩니다. 그러나 300mM KCl 조건에서는 완충액 조성과 pH 모두 FtsZ에 영향을 주지 않았습니다.Ec 검출 가능한 방식으로 조립.
KCl가 없는 완충액에서는 단백질 침전이 발생하여 FtsZBs의 광산란 실험이 불가능했습니다. FtsZBs의 농도를 3 µM로 낮추었을 때는 침전이 일어나지 않았습니다. 하지만 3 µM은 세포 내 FtsZ의 생리적 농도가 아닙니다. 플라스틱 큐벳의 경우, pH 7.5에서 12 µM의 FtsZBs는 침전되지 않았으나, KCl이 없는 상태의 pH 6.8 및 6.5에서는 FtsZ가 여전히 침전되었습니다.
E. coli 및 B. subtilis 유래 FtsZ 구조의 형태학
FtsZ에 의해 형성된 구조를 TEM으로 관찰하였다. 저염 상태의 모든 버퍼에서 FtsZBs는 그리드 전체를 덮는 밀집된 중합체를 형성하였다(그림 4A-C). 저염 상태의 모든 버퍼에서 FtsZEc는 긴 필라멘트, 케이블 및 번들을 형성하였다(그림 4D-F). 그러나 FtsZEc에 의해 형성된 관찰 가능한 중합체의 양은 FtsZBs에 의해 형성된 양보다 적었다. 고염 버퍼에서 FtsZBs는 번들로 결합되지 않는 더 긴 단일 가닥의 원섬유(protofilaments)를 형성하였다(그림 4G-I). FtsZBs 원섬유는 염 농도가 높아짐에 따라 구조가 변한 반면, FtsZEc는 저염 버퍼의 구조와 구별되지 않는 구조를 형성하였다(그림 4J-L). FtsZEc의 중합에는 관찰 가능한 pH 영향이 없었으나, FtsZBs는 pH 6.5에서 더 많은 번들을 형성하며 이는 밀집된 중합체 및 시트 형태로 관찰되었다(그림 4B). 이러한 결과는 본 연구의 광산란 실험 및 이전에 발표된 TEM 연구 결과8,11,26와 일치한다.
고농도 및 저농도 KCl 조건에서 FtsZ의 GTPase 활성
FtsZ의 GTP 가수분해 활성을 유리 인산에 대한比色법(colorimetric assay)을 사용하여 서로 다른 조건에서 측정하였습니다. 이전에 보고된 바와 같이15 FtsZ의 GTPase 활성은 KCl 농도가 증가함에 따라 증가하였습니다. 사용된 완충액에 따라 300 mM KCl에서 FtsZBs는 50 mM KCl 대비 3-7배, FtsZEc는 1.5-2.5배의 GTPase 활성 증가를 보였습니다. 50 mM KCl에서 GTPase 활성이 감소한 것은 FtsZBs 필라멘트의 번들링(bundling) 때문입니다. 50 mM KCl에서 FtsZEc는 FtsZEc 폴리머의 더 빠른 해체 덕분에 FtsZBs보다 3-6배 높은 GTPase 활성을 나타냈습니다. FtsZBs와 FtsZEc 사이의 GTP 가수분해 활성 차이는 300 mM KCl에서 감소하였으며, 이는 아마도 FtsZBs 필라멘트의 번들링이 감소했기 때문일 것입니다(그림 5).
<img alt="FtsZ 중합, % 펠렛 분석, 막대 그래프, 젤 전기영동, GTP/GDP 효과 비교." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. 침전법을 통한 FtsZ 중합의 정량 분석.(A) 12 µM FtsZ를 2 mM GTP 또는 GDP 존재 하에 pH 7.5(검은색 막대), 6.8(회색 막대) 또는 6.5(흰색 막대)에서 중합시켰다. 침전된 단백질의 양은 Coomassie 염색 젤의 밀도 분석으로 결정하였다. GDP는 특이적 침전에 대한 대조군으로 사용되었으며, GTP와 함께 침전된 FtsZ의 백분율에서 GDP와 함께 침전된 FtsZ의 백분율을 빼서 그래프에 표시된 값을 얻었다. 왼쪽: 50 mM KCl에서 침전된 FtsZ, 오른쪽: 300 mM KCl에서 침전된 FtsZ. (B) Coomassie 염색 젤의 대표적인 결과. 50 mM KCl에서 FtsZBs (위쪽 젤) 및 FtsZEc (아래쪽 젤)의 중합. (S) 상층액, (P) 실험의 펠렛 분획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기</a>.
<img alt="FtsZ와 SepF 상호작용 그래프 및 GTP/GDP가 단백질 펠렛 비율에 미치는 영향을 보여주는 겔." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. 저속에서의 SepF/FtsZ 튜블의 침전. (A) 12 µM FtsZBs를 2 mM GDP (흰색 막대) 또는 GTP (검은색 막대)와 함께 중합시켰다. 펠렛으로 침전된 단백질의 양은 Coomassie 염색 겔의 농도 분석(densitometric analysis)을 통해 결정하였다. x축 아래의 + 및 - 기호는 반응액 내 FtsZ와 SepF의 존재 또는 부재를 나타낸다. (B) Coomassie 염색 겔의 대표 결과. SepF 존재 및 부재 하에서의 FtsZBs 중합. 대조군으로 FtsZ가 없는 SepF를 사용하였다. 중합은 GTP 및 GDP를 사용하여 수행되었다. (S)는 상층액, (P)는 실험의 펠렛 분획을 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">크게 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.
<img alt="KCl 농도에 따른 FtsZ의 광산란 그래프; pH 6.5, 6.8, 7.5의 영향 제시" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 3"> 
그림 3. 12 μM FtsZEc 및 12 μM FtsZBs의 광산란. FtsZ들은 2 mM GTP 존재 하에 조립되었으며, 중합 과정은 90° 각도 광산란으로 모니터링되었다. pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5의 50 mM KCl 조건에서 FtsZBs (A)와 FtsZEc (B)의 중합. pH 7.5, pH 6.8 및 pH 6.5의 300 mM KCl 조건에서 FtsZBs (C)와 FtsZEc (D)의 중합. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지 보려면 여기를 클릭하세요</a>.
<img alt="다양한 pH 및 KCl 농도에서의 FtsZ 중합체 전자 현미경 사진; 구조 분석." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 4"> 
그림 4. 전자 현미경으로 시각화한 FtsZBs 및 FtsZEc 중합체의 구조. (A-L) 2 mM GTP로 중합된 12 µM FtsZBs (A-C 및 G-I) 및 FtsZEc (D-F) 및 (J-L)의 이미지. (A-C) 각각 50 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZBs. (D-F) 각각 50 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZEc. (G-I) 각각 300 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZBs. (J-L) 각각 300 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZEc. 스케일 바: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.
<img alt="GTPase 활성 그래프; pH 7.5, 6.8, 6.5 변동에 따른 50mM 대 300mM KCl에서의 FtsZ 막대 그래프." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 5"> 
그림 5. 6가지 서로 다른 버퍼에서의 FtsZ 중합 중 GTP 가수분해. 모든 실험에 2 mM GTP가 사용되었습니다. MgCl2가 없는 샘플을 대조군으로 사용하였습니다. MgCl2가 없는 FtsZ의 활성을 MgCl2 존재 하에서의 FtsZ 활성에서 차감하였습니다. 왼쪽: 50 mM KCl에서의 FtsZ GTPase 활성, 오른쪽: 300 mM KCl에서의 FtsZ GTPase 활성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">여기에서 더 큰 이미지 보기</a>.

FtsZ의 중합은 박테리아 세포 분열에 필수적입니다. 이 보고서에서는 FtsZ 중합 활성을 모니터링하기 위한 간단한 프로토콜에 대해 자세히 설명하고 버퍼 조성의 영향에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 FtsZ 중합에 영향을 미치는 조절 단백질 또는 항균 약물과 FtsZ의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

다음 실험의 전반적인 목표는 간단한 분석 및 장비를 사용하여 FTSZ, 중합 및 활성을 연구하기에 적합한 조건을 결정하는 것입니다. 이는 FDSZ가 중합되는 적절한 조건을 찾기 위해 다양한 조건에서 FDSC 폴리머 침강 분석을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, FDSZ 중합을 실시간으로 연구하기 위해 광 산란 분석을 수행합니다.다음으로, FT SC의 중합 관련 g gtpa 활성을 결정하기 위해 GTP 가수분해 분석을 수행합니다. 침전, 광 산란 및 GTP 가수분해를 기반으로 특정 박테리아 소스의 FTSC 연구에 가장 적합한 조건을 보여주는 결과가 얻어집니다. 여기에 표시된 기술은 모든 실험실에서 쉽게 수행할 수 있으며 특정 FT a z의 중합 능력에 대한 빠른 아이디어를 제공합니다. 우리는 다른 단백질이 있는 상태에서 FTAZ로 작업할 때 올바른 완충액을 선택하는 것이 특히 중요하다는 것을 알게 되었습니다.먼저 5마이크로리터의 100밀리몰 염화마그네슘과 12마이크로몰의 박테리아 단백질, FDSC 및/또는 SEP F를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 pH 값과 조성을 가진 선택한 중합 완충액 중 하나에 추가합니다. 다음으로, 튜브를 진탕 기능이 있는 인큐베이터에 넣고 섭씨 30도 및 300RPM에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브가 완전히 혼합되면 100 밀리몰 스톡 용액에서 1 마이크로 리터의 GTP 또는 GDP 혼합물을 첨가하여 최종 농도가 2 밀리 몰이되도록하여 중합을 시작합니다.그런 다음 샘플을 진탕 배양기에 다시 20분 동안 넣습니다. 그런 다음 TLA 55 로터를 사용하여 20, 000RPM에서 15분 동안 실온에서 튜브를 회전시키거나 다른 것을 사용하는 경우 이에 상응하는 24, 600G를 사용합니다. 원심분리기가 완료되면 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 나중을 위해 펠릿을 저장합니다.20마이크로리터의 이송된 상등액을 20마이크로리터의 2배 농축 샘플 버퍼와 함께 별도의 튜브에 혼합합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 샘플을 섭씨 98도에서 10분 동안 끓입니다. 다음으로, 이전에 따로 보관했던 각 펠릿 분획에 2배 농축된 샘플 버퍼 50마이크로리터를 추가하고 섭씨 98도에서 10분 동안 샘플을 끓여 폴리머를 현탁시킵니다.샘플이 끓는 것을 마치면 펠릿이 들어 있는 튜브에 50마이크로리터의 탈염수를 추가로 추가합니다. 다음으로 각 샘플의 상등액과 펠릿 10마이크로리터를 10%SDS 페이지 젤에 나란히 로드하고 150볼트에서 겔을 실행합니다. 젤이 완성되면 젤을 제거하고 kumasi brilliant blue G two 50으로 염색합니다.그런 다음 겔을 이미지화하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 분석을 사용하여 단백질을 정량화합니다. 먼저 형광등 분광계를 켜고 l을 기다립니다.amp 열 변동을 피하기 위해 몇 분 동안 예열합니다. 또한 순환 수조를 켜고 수온을 섭씨 30도로 설정하여 수석실을 일정한 온도로 유지하십시오.시스템이 예열되면 분광계의 작동 매개변수를 정의합니다. 검출기 고전압을 300볼트로, 방출 및 여기 파장을 350나노미터로 설정하고 슬릿 너비를 4나노미터로 설정합니다. 그런 다음 3, 600초 동안 지속되는 시간 기반 수집을 선택하여 데이터 수집 프로토콜을 프로그래밍합니다.1cm 경로 길이의 200 마이크로 리터 형광 수병을 수조의 세척액에 5 분 동안 간음하여 조심스럽게 청소하십시오. 다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 9개의 중합 완충액 각각에 대해 294마이크로리터의 마스터 믹스를 준비하며, 각 버퍼에는 10밀리몰의 염화마그네슘과 12마이크로몰의 FDSE가 300마이크로리터에 대해 계산된 최종 농도로 사용됩니다. 그런 다음 혼합물을 잠시 와류로 가열하면 196 마이크로 리터의 첫 번째 중합 버퍼가 수의사에게 전달됩니다.분광계에 넣고 2분 동안 배양하여 샘플의 온도를 섭씨 30도까지 끌어올립니다. 2분 후 데이터 수집을 시작하고 신호가 안정적인지 확인하기 위해 90초 동안 기다립니다. 그런 다음 100 밀리몰 GTP 또는 GDP의 4 마이크로 리터를 추가합니다.샘플을 혼합하고 한 시간 동안 데이터 수집을 계속합니다. 나열된 각 버퍼에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 선택한 중합 버퍼에 1.5ml의 2밀리몰 GTP를 준비합니다.또한 동일한 완충액에서 0 - 40 마이크로몰 범위의 인산염 표준 희석액을 준비합니다. 다음으로, bioassays kit에 설명된 대로 공작석 녹색 작업 시약을 준비합니다. 그런 다음 총 부피가 360마이크로리터인 4개의 마스터 믹스를 구성하고, 마스터 믹스 1개는 B subtilis에서 파생된 FDSZ를 포함하고 마스터 믹스 2개는 대장균에서 파생된 FDSE를 포함합니다.마스터 믹스 3과 4는 대조군으로 사용되며 염화마그네슘 대신 EDTA를 함유합니다. 다음 피펫: 마스터 믹스 및 인산염 표준물질의 20마이크로리터 분취액. A-Q-P-C-R 96 웰 플레이트에서 각 마스터 믹스에 대해 16개의 웰과 여기에 표시된 대로 배열된 인산염 표준이 있도록 합니다.180 마이크로 리터의 2 밀리 몰 GTP 스톡을 플레이트의 마지막 레인에 피펫팅합니다. 그런 다음 플레이트를 PCR 기계에 넣습니다. 단일 사이클을 섭씨 30도로 설정하여 40분 동안 프로그램을 실행합니다.두 번째 96 웰 플레이트 피펫에서, 말라카이트 녹색 작업 시약의 20 마이크로리터 분취액을 웰 내로, A 1에서 H 10까지. 그런 다음 실험에서 중합 완충액의 60 마이크로 리터에서 A 1에서 H 8을 청구하고, 다음으로 2 밀리 몰 GTP 용액의 20 마이크로 리터에서 플레이트의 각 레인의 웰에 도달합니다. 하나는 다양한 시점에서의 반응을 조사하기 위해 여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 간격으로 수행합니다.플레이트 1의 1 레인에서 시작하여 30 분 후에 혼합물을 위아래로 파이프하여 혼합하고 플레이트 1의 1 레인에서 플레이트 2의 1 레인으로 20 마이크로 리터를 옮기고 피펫을 위아래로 옮겨 혼합합니다. 이것은 30 분 30 분 후에 반응을 위한 공작석 녹색 발달의 시작점이고, 판 1의 2 차선에서 판 2의 2 차로 20 마이크로리터를 옮기고 섞습니다. 이것은 20분 반응을 위한 공작석 녹색 발색의 시작점입니다.GTP 20마이크로리터에서 33분 33초 후 32번째 간격으로 나머지 3번 레인에서 7번 레인에 대해 이 단계를 반복하여 플레이트 1의 8번 레인으로 만들고 믹싱합니다. 그런 다음 20마이크로리터를 두 번째 플레이트의 레인 8로 옮기고 혼합합니다. 이것은 0분 반응을 나타내며 공작석 녹색 발병의 시작 시점입니다.34분 후, 인산염 표준물질을 포함하는 플레이트 1의 9번째 레인에서 플레이트 2의 9번째 레인에 80마이크로리터를 추가하고 34분 30초 후에 혼합하고, 첫 번째 플레이트의 10번 레인에 있는 두 번째 인산염 표준물질에서 80마이크로리터를 플레이트 2의 10번 레인으로 옮기고 혼합합니다. 그런 다음 샘플에서 모든 기포를 제거하고 플레이트를 실온에서 25분 30초 더 배양합니다. 배양 후.실험 시작 후 60분부터 96웰 플레이트 리더에 플레이트를 놓습니다. 10개의 타임 포인트를 취하도록 5분 동안 30초마다 630나노미터로 플레이트를 측정합니다. 첫 번째 플레이트 측정은 1번 레인과 일치하고 두 번째 라인은 2번 레인과 일치하므로 각 레인은 공작석 녹색이 발생하는 데 정확히 동일한 시간을 갖습니다.다음으로, 인산염 표준 검량선을 사용하여 모든 샘플의 유리 인산염을 계산하고 시간 경과에 따른 인산염 방출로 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 곡선의 선형 범위에서 F-D-S-Z-G-T-P 가수분해 활성을 계산합니다. 여기에 표시된 것은 샘플의 펠릿에서 SEP, F 및 FDSZ의 백분율입니다.FDSZ는 SEP F와 GTP가 모두 샘플에 존재하는 경우에만 배경 수준 이상의 펠릿에서 회수되었습니다. 이 세뇨관에서 SEPPE 및 FDSZ의 정확한 화학량론은 알려져 있지 않지만, 이러한 결과는 FDSZ보다 더 많은 SEPE가 존재한다는 것을 시사합니다. B subtilis 및 e coli에서 FDSZ의 광 산란은 50 millimolar 염화칼륨 완충액에 2 밀리몰 GTP가 존재하는 상태에서 조립된 것입니다.F-D-S-E-B-S는 완충기 PH에 따라서 FDSC EC 보다는 20에서 40배 더 높은 광 산란 신호를 줍니다. 흥미롭게도, 완충액 내 염화칼륨 농도 증가는 F-D-S-Z-E-C의 광 산란 신호에 큰 영향을 미치지 않았지만, F-T-S-Z-B-S의 신호는 50 밀리몰 염화칼륨을 가진 완충액과 비교하여 pH 7.5에서 약 80배, pH 6.8에서 30배, pH 6.5에서 pH 6.5에서 45배 감소했습니다. FDSZ의 GTP 가수분해 활성은 유리 인산염에 대한 비색 분석을 사용하여 다양한 완충 조건에서 측정되었습니다.FT SZ의 GTPS 활성은 서로 다른 pH 조건 각각에서 염화칼륨 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 50 밀리몰 염화칼륨에서, 50 밀리몰에서 F-D-S-Z-B-S 필라멘트의 번들링으로 인해 gtpa 활성이 감소하였다. 염화칼륨 FDSZ EEC는 FDSC EEC 폴리머의 빠른 분해로 인해 F-D-S-Z-B-S보다 3-6배 더 높은 GTPS 활성을 가졌습니다.마지막으로, F-D-S-Z-B-S와 F-D-S-Z-E-C 사이의 GTP 가수분해 활성의 차이는 300밀리몰 염화칼륨에서 감소했는데, 이는 F-D-S-Z-B-S 필라멘트의 번들링이 감소했기 때문일 수 있습니다. 이 절차에 따라 시료 내 fts 폴리머의 구조와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 전기 현미경과 같은 다른 금속을 수행할 수 있습니다.

ftsz-polymerization-assays-simple-protocols-and-considerations

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

PCR은 많은 분자 생물학 연구소의 일반적인 기법으로 부상하고있다. 여러 기존의 PCR 프로토콜에 대한 안내서가 여기에 제공됩니다. 각 반응은 독특한 실험, 제품이 다양 생성하는 데 필요한 최적의 조건이기 때문에. 반응의 변수를 이해하는 것은 크게함으로써 원하는 결과를 얻을 수있는 기회를 증가 문제 해결 효율성을 향상시킬 것입니다.

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

연약한 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 정확하고 견고한 중합효소 연쇄 반응 기반 분석은 깨지기 쉬운 X 증후군 및 연약한 X 증후군및 연약한 X 관련의 분자 진단 및 스크리닝을 용이하게 합니다. 턴라운드 시간이 짧고 장비에 대한 투자가 부족합니다.

깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트는 필수 생물학적 경로에서 유비쿼터스 성분이며 생명 공학 응용에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에서, 우리는 표준 자동화 합성 기술에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트의 일상적인 합성 및 정제를 위한 기술을 기술한다.

올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

학습하세요 FtsZ 중합 분석을 위한 침전법, 산란광법, GTP 가수분해 분석을 사용하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세균 세포 분열 연구와 항균제 개발에 활용됩니다.

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

더 많은 동영상 탐색