FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

다음 실험의 전반적인 목표는 간단한 분석 및 장비를 사용하여 FTSZ, 중합 및 활성을 연구하기에 적합한 조건을 결정하는 것입니다. 이는 FDSZ가 중합되는 적절한 조건을 찾기 위해 다양한 조건에서 FDSC 폴리머 침강 분석을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, FDSZ 중합을 실시간으로 연구하기 위해 광 산란 분석을 수행합니다.

다음으로, FT SC의 중합 관련 g gtpa 활성을 결정하기 위해 GTP 가수분해 분석을 수행합니다. 침전, 광 산란 및 GTP 가수분해를 기반으로 특정 박테리아 소스의 FTSC 연구에 가장 적합한 조건을 보여주는 결과가 얻어집니다. 여기에 표시된 기술은 모든 실험실에서 쉽게 수행할 수 있으며 특정 FT a z의 중합 능력에 대한 빠른 아이디어를 제공합니다. 우리는 다른 단백질이 있는 상태에서 FTAZ로 작업할 때 올바른 완충액을 선택하는 것이 특히 중요하다는 것을 알게 되었습니다.

먼저 5마이크로리터의 100밀리몰 염화마그네슘과 12마이크로몰의 박테리아 단백질, FDSC 및/또는 SEP F를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 pH 값과 조성을 가진 선택한 중합 완충액 중 하나에 추가합니다. 다음으로, 튜브를 진탕 기능이 있는 인큐베이터에 넣고 섭씨 30도 및 300RPM에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 튜브가 완전히 혼합되면 100 밀리몰 스톡 용액에서 1 마이크로 리터의 GTP 또는 GDP 혼합물을 첨가하여 최종 농도가 2 밀리 몰이되도록하여 중합을 시작합니다.

그런 다음 샘플을 진탕 배양기에 다시 20분 동안 넣습니다. 그런 다음 TLA 55 로터를 사용하여 20, 000RPM에서 15분 동안 실온에서 튜브를 회전시키거나 다른 것을 사용하는 경우 이에 상응하는 24, 600G를 사용합니다. 원심분리기가 완료되면 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 나중을 위해 펠릿을 저장합니다.

20마이크로리터의 이송된 상등액을 20마이크로리터의 2배 농축 샘플 버퍼와 함께 별도의 튜브에 혼합합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 샘플을 섭씨 98도에서 10분 동안 끓입니다. 다음으로, 이전에 따로 보관했던 각 펠릿 분획에 2배 농축된 샘플 버퍼 50마이크로리터를 추가하고 섭씨 98도에서 10분 동안 샘플을 끓여 폴리머를 현탁시킵니다.

샘플이 끓는 것을 마치면 펠릿이 들어 있는 튜브에 50마이크로리터의 탈염수를 추가로 추가합니다. 다음으로 각 샘플의 상등액과 펠릿 10마이크로리터를 10%SDS 페이지 젤에 나란히 로드하고 150볼트에서 겔을 실행합니다. 젤이 완성되면 젤을 제거하고 kumasi brilliant blue G two 50으로 염색합니다.

그런 다음 겔을 이미지화하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 분석을 사용하여 단백질을 정량화합니다. 먼저 형광등 분광계를 켜고 l을 기다립니다.amp 열 변동을 피하기 위해 몇 분 동안 예열합니다. 또한 순환 수조를 켜고 수온을 섭씨 30도로 설정하여 수석실을 일정한 온도로 유지하십시오.

시스템이 예열되면 분광계의 작동 매개변수를 정의합니다. 검출기 고전압을 300볼트로, 방출 및 여기 파장을 350나노미터로 설정하고 슬릿 너비를 4나노미터로 설정합니다. 그런 다음 3, 600초 동안 지속되는 시간 기반 수집을 선택하여 데이터 수집 프로토콜을 프로그래밍합니다.

1cm 경로 길이의 200 마이크로 리터 형광 수병을 수조의 세척액에 5 분 동안 간음하여 조심스럽게 청소하십시오. 다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 9개의 중합 완충액 각각에 대해 294마이크로리터의 마스터 믹스를 준비하며, 각 버퍼에는 10밀리몰의 염화마그네슘과 12마이크로몰의 FDSE가 300마이크로리터에 대해 계산된 최종 농도로 사용됩니다. 그런 다음 혼합물을 잠시 와류로 가열하면 196 마이크로 리터의 첫 번째 중합 버퍼가 수의사에게 전달됩니다.

분광계에 넣고 2분 동안 배양하여 샘플의 온도를 섭씨 30도까지 끌어올립니다. 2분 후 데이터 수집을 시작하고 신호가 안정적인지 확인하기 위해 90초 동안 기다립니다. 그런 다음 100 밀리몰 GTP 또는 GDP의 4 마이크로 리터를 추가합니다.

샘플을 혼합하고 한 시간 동안 데이터 수집을 계속합니다. 나열된 각 버퍼에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 선택한 중합 버퍼에 1.5ml의 2밀리몰 GTP를 준비합니다.

또한 동일한 완충액에서 0 - 40 마이크로몰 범위의 인산염 표준 희석액을 준비합니다. 다음으로, bioassays kit에 설명된 대로 공작석 녹색 작업 시약을 준비합니다. 그런 다음 총 부피가 360마이크로리터인 4개의 마스터 믹스를 구성하고, 마스터 믹스 1개는 B subtilis에서 파생된 FDSZ를 포함하고 마스터 믹스 2개는 대장균에서 파생된 FDSE를 포함합니다.

마스터 믹스 3과 4는 대조군으로 사용되며 염화마그네슘 대신 EDTA를 함유합니다. 다음 피펫: 마스터 믹스 및 인산염 표준물질의 20마이크로리터 분취액. A-Q-P-C-R 96 웰 플레이트에서 각 마스터 믹스에 대해 16개의 웰과 여기에 표시된 대로 배열된 인산염 표준이

180 마이크로 리터의 2 밀리 몰 GTP 스톡을 플레이트의 마지막 레인에 피펫팅합니다. 그런 다음 플레이트를 PCR 기계에 넣습니다. 단일 사이클을 섭씨 30도로 설정하여 40분 동안 프로그램을 실행합니다.

두 번째 96 웰 플레이트 피펫에서, 말라카이트 녹색 작업 시약의 20 마이크로리터 분취액을 웰 내로, A 1에서 H 10까지. 그런 다음 실험에서 중합 완충액의 60 마이크로 리터에서 A 1에서 H 8을 청구하고, 다음으로 2 밀리 몰 GTP 용액의 20 마이크로 리터에서 플레이트의 각 레인의 웰에 도달합니다. 하나는 다양한 시점에서의 반응을 조사하기 위해 여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 간격으로 수행합니다.

플레이트 1의 1 레인에서 시작하여 30 분 후에 혼합물을 위아래로 파이프하여 혼합하고 플레이트 1의 1 레인에서 플레이트 2의 1 레인으로 20 마이크로 리터를 옮기고 피펫을 위아래로 옮겨 혼합합니다. 이것은 30 분 30 분 후에 반응을 위한 공작석 녹색 발달의 시작점이고, 판 1의 2 차선에서 판 2의 2 차로 20 마이크로리터를 옮기고 섞습니다. 이것은 20분 반응을 위한 공작석 녹색 발색의 시작점입니다.

GTP 20마이크로리터에서 33분 33초 후 32번째 간격으로 나머지 3번 레인에서 7번 레인에 대해 이 단계를 반복하여 플레이트 1의 8번 레인으로 만들고 믹싱합니다. 그런 다음 20마이크로리터를 두 번째 플레이트의 레인 8로 옮기고 혼합합니다. 이것은 0분 반응을 나타내며 공작석 녹색 발병의 시작 시점입니다.

34분 후, 인산염 표준물질을 포함하는 플레이트 1의 9번째 레인에서 플레이트 2의 9번째 레인에 80마이크로리터를 추가하고 34분 30초 후에 혼합하고, 첫 번째 플레이트의 10번 레인에 있는 두 번째 인산염 표준물질에서 80마이크로리터를 플레이트 2의 10번 레인으로 옮기고 혼합합니다. 그런 다음 샘플에서 모든 기포를 제거하고 플레이트를 실온에서 25분 30초 더 배양합니다. 배양 후.

실험 시작 후 60분부터 96웰 플레이트 리더에 플레이트를 놓습니다. 10개의 타임 포인트를 취하도록 5분 동안 30초마다 630나노미터로 플레이트를 측정합니다. 첫 번째 플레이트 측정은 1번 레인과 일치하고 두 번째 라인은 2번 레인과 일치하므로 각 레인은 공작석 녹색이 발생하는 데 정확히 동일한 시간을 갖습니다.

다음으로, 인산염 표준 검량선을 사용하여 모든 샘플의 유리 인산염을 계산하고 시간 경과에 따른 인산염 방출로 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 곡선의 선형 범위에서 F-D-S-Z-G-T-P 가수분해 활성을 계산합니다. 여기에 표시된 것은 샘플의 펠릿에서 SEP, F 및 FDSZ의 백분율입니다.

FDSZ는 SEP F와 GTP가 모두 샘플에 존재하는 경우에만 배경 수준 이상의 펠릿에서 회수되었습니다. 이 세뇨관에서 SEPPE 및 FDSZ의 정확한 화학량론은 알려져 있지 않지만, 이러한 결과는 FDSZ보다 더 많은 SEPE가 존재한다는 것을 시사합니다. B subtilis 및 e coli에서 FDSZ의 광 산란은 50 millimolar 염화칼륨 완충액에 2 밀리몰 GTP가 존재하는 상태에서 조립된 것입니다.

F-D-S-E-B-S는 완충기 PH에 따라서 FDSC EC 보다는 20에서 40배 더 높은 광 산란 신호를 줍니다. 흥미롭게도, 완충액 내 염화칼륨 농도 증가는 F-D-S-Z-E-C의 광 산란 신호에 큰 영향을 미치지 않았지만, F-T-S-Z-B-S의 신호는 50 밀리몰 염화칼륨을 가진 완충액과 비교하여 pH 7.5에서 약 80배, pH 6.8에서 30배, pH 6.5에서 pH 6.5에서 45배 감소했습니다. FDSZ의 GTP 가수분해 활성은 유리 인산염에 대한 비색 분석을 사용하여 다양한 완충 조건에서 측정되었습니다.

FT SZ의 GTPS 활성은 서로 다른 pH 조건 각각에서 염화칼륨 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 50 밀리몰 염화칼륨에서, 50 밀리몰에서 F-D-S-Z-B-S 필라멘트의 번들링으로 인해 gtpa 활성이 감소하였다. 염화칼륨 FDSZ EEC는 FDSC EEC 폴리머의 빠른 분해로 인해 F-D-S-Z-B-S보다 3-6배 더 높은 GTPS 활성을 가졌습니다.

마지막으로, F-D-S-Z-B-S와 F-D-S-Z-E-C 사이의 GTP 가수분해 활성의 차이는 300밀리몰 염화칼륨에서 감소했는데, 이는 F-D-S-Z-B-S 필라멘트의 번들링이 감소했기 때문일 수 있습니다. 이 절차에 따라 시료 내 fts 폴리머의 구조와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 전기 현미경과 같은 다른 금속을 수행할 수 있습니다.