Stentor coeruleus에서 단세포 상처 치유 중 세포질 흐름 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 단일 세포에서 상처가 치유되는 동안 세포질의 흐름을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 살아있는 스텐트 또는 SEIU 세포를 수집하여 세포 상처에 대한 모델 시스템으로 사용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 세포를 절단하기 위한 유리 도구를 준비하는 것입니다.

다음으로, 저배율 수술과 고해상도 이미징을 동시에 수행할 수 있는 맞춤형 현미경 설정에서 스텐트 사리우스 세포를 절단합니다. 마지막 단계는 입자 이미지 속도 대칭 소프트웨어를 사용하여 세포질 흐름의 컴퓨터 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 세포질의 고해상도 이미징은 상처 치유 중 세포의 활성 반응을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 주변 배지로의 누출을 방지하기 위해 세포질이 절단 부위 주변에서 젤처럼 되는지 여부와 같은 세포 상처 치유에 대한 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 셀 핸들링, 도구 준비 및 절단 단계가 수동 손재주가 필요하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 치석에 기술된 천연 폰이나 상용 공급업체에서 스텐트 또는 시리우스 세포를 얻으려면 300ml의 변형된 스텐트 또는 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 치석 및 억제 레시피에서 조정된 배지를 추가합니다.

섭씨 20도의 어둠 속에서 배양하여 배양을 유지하십시오. 다음으로, 트리스 아세테이트 인산염 배지에서 chlamydomonas Rhine Hardy 조류의 배양을 성장시킵니다. 먹이를 주기 전에 표준 배양 방법을 사용하여 클라미도모나스 세포를 부드럽게 회전시켜 상층액을 제거하고 변형된 스텐트 또는 배지에 현탁시켜 세척합니다.

필요할 때 300ml의 스텐트 또는 사리우스 배양액에 약 3,000만 개의 chm 세포를 일주일에 2-3회 공급합니다. 수술을 위해 스텐트 또는 세포를 수집합니다. 먼저 세포가 분리되어 자유롭게 헤엄치기 시작할 때까지 피펫 팁을 통해 공기를 버블링하여 배양액을 부드럽게 교반합니다.

그런 다음 세포가 전단되는 것을 방지하기 위해 넓은 보어 팁이 장착된 1ml 피펫을 사용하여 헤엄치는 세포를 캡처합니다. 일단 수집되면 세포가 가라앉도록 합니다. 그런 다음 그 위에 있는 배지를 천천히 피펫으로 제거하고 새로 변형된 스텐트 또는 배지를 추가합니다.

스텐트 세포를 절단하는 데 사용되는 유리 바늘을 끝이 녹기 시작할 때까지 두 개의 유리 교반 막대를 넉넉하고 버너 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 용융 유리가 융합될 때까지 두 막대의 끝을 함께 만집니다. 융합이 끝나면 불에서 제거하고 1-2초 동안 식히십시오.

그런 다음 천천히 분리하여 깨끗하게 분리하십시오. 이상적으로는 길이가 약 1-2cm이고 끝에 미세한 점이 있는 바늘을 생산할 수 있습니다. 결과 바늘이 최적이 아닌 경우 팁을 유리 허리로 부수고 막대를 재사용하십시오.

다음으로, 바셀린으로 코팅된 사각형 고무 스탬프를 사용하여 유리 커버 슬립에 눌러 사각형 바셀린 벽 챔버를 준비합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 변형된 스텐트 또는 2% 메틸 셀룰로오스를 함유한 배지를 바셀린 사각형에 추가합니다. 준비된 커버 슬립을 플라스틱 어댑터에 넣은 다음 세척된 스텐트 세포를 커버 슬립에 추가합니다.

마지막으로, 메틸 셀룰로오스의 세포를 배열하여 균일한 간격이 되고 이미징 중에 초점이 맞춰질 수 있도록 커버 슬립 표면에 충분히 가깝게 밀려나도록 합니다. 시작하려면 슬라이드를 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경. 그런 다음 스탠드에서 해부 현미경 본체를 제거하고 위에서 저배율로 슬라이드를 시각화하기 위해 현미경을 배치해야 하는 대략적인 위치를 결정합니다.

다음으로, 도립 현미경의 접안렌즈와 해부 스코프 사이에 원하는 간격의 판지 상자를 추가하여 이층 현미경을 구성합니다. 실험이 완료되면 쉽게 제거할 수 있도록 실험실 테이프를 사용하여 상자를 제자리에 테이프로 고정합니다.해부 범위를 이동할 필요 없이 샘플이 시야에 있고 초점이 맞는지 확인합니다.부착된 후 해부 내시경을 상자에 대고 실험실 테이프를 사용하여 상자에 테이프로 붙입니다. 다음으로, 20 x air objective를 제자리에 배치하여 DIC 광학 장치를 사용하여 도립 현미경을 설정합니다.

또한 위에서 미세 수술을 수행할 수 있는 충분한 공간을 제공하기 위해 긴 작동 거리 DIC 콘덴서를 사용해야 합니다. 그런 다음 도립 현미경으로 모든 것이 준비되고 양쪽에서 초점이 맞춰진 상태에서 세포에 초점을 맞춥니다. 5대의 12 x 5개의 12 CCD 카메라를 사용하여 초당 2개의 이미지 프레임 속도로 이미지를 획득하기 시작합니다.

그런 다음 유리 바늘을 사용하여 세포를 자릅니다. 초기 세포질 흐름 패턴을 포착하고 상처 및 상처 치유 과정의 모든 단계를 관찰합니다. 세포가 정상적인 모습을 되찾거나 다시 한 번 활성 운동을 시작하면 수집을 종료합니다.

시작하려면 PIV lab, 입자 이미지 속도 대칭을 사용하여 세포질 흐름을 측정하는 MATLAB 패키지를 다운로드하십시오. 다음으로, 각 비디오 시퀀스에 대한 TIFF 이미지 스택을 MATLAB 매뉴얼 내에서 입자 이미지 속도 대칭 프로그램에 로드합니다. 각 이미지 스택에 대한 마스크를 수동으로 생성하여 스텐트 본체 외부의 원시 데이터 영역을 마스킹합니다.

그런 다음 빠른 푸리에 변환 설정과 64 x 64 픽셀의 빈 크기를 사용하도록 PIV lab을 설정하면 각 프레임의 픽셀이 더 큰 정사각형 픽셀로 빈됩니다. 다음으로 PIV lab을 실행하여 각 프레임의 픽셀과 인접 픽셀 간의 교차 상관 관계를 계산합니다. 다음 프레임에서는 각 굽힘 픽셀을 중심으로 하는 시간 종속 흐름 벡터가 생성되며, 이 벡터는 원시 데이터와 동일한 시간 해상도를 갖습니다.

그런 다음 절단 전과 상처 치유 중에 스텐트와 함께 수집된 데이터를 비교하기 위해 결과로 생성되는 벡터장 출력의 시간 평균을 계산합니다. 또한 유속 히스토그램을 계산하여 유동 변동을 연구하기 위해 시간 경과에 따른 주어진 픽셀에서의 유동 강도 및 속도 변화를 연구합니다. 스텐트 또는 세포가 반으로 절단된 상태에서 염기서열을 이미징할 때, 평균 유속에 세포외 세포질 기포 기저부의 단면적을 곱하여 세포질로 다시 적절한 세포질로 돌아가는 총 플럭스를 계산합니다.

여기에 표시된 것은 스텐트 또는 세포가 유리 바늘로 절단되고 파괴될 때의 실시간 영상입니다. 절단 후 상당한 양의 세포질이 주 세포체에서 빠져나갔지만 빠르게 세포 내부로 다시 흘러 들어갔습니다. 이 절차에 따라 스텐트 또는 상처 치유 중 세포질 운동에 기여할 수 있는 세포골격 성분과 같은 추가 질문에 답하기 위해 화학적 억제제를 추가할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 세포에 스텐트를 절단하기 위한 도구를 준비하는 방법과 단일 거대 세포 내에서 절단 및 상처 치유 과정에서 세포질 흐름을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.