플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

이 절차는 생물막을 형성할 수 있는 박테리아 균주에 대한 플랑크톤과 생물막 내성을 직접 비교합니다. 먼저, 생물막을 확립하고, 배지를 보충하고, 선택한 항균제를 연속 희석합니다. 그런 다음 세포가 신선한 매체에서 회복되도록 합니다.

이제 LB 오거에 도금하여 세포의 생존력을 분석합니다. 궁극적으로 플랑크톤 및 생물막 세포의 최소 살균 농도를 결정하는 것은 생물막의 성장으로 인한 내성 증가를 보여주는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 인접한 우물을 오염시키거나 여러 갈래로 된 장치의 갈래를 충분히 식혀서 박테리아를 죽이지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

섭씨 37도의 풍부한 배지에서 16시간 동안 박테리아의 야생형 및 돌연변이 균주인 배양은 밤새 포화된 배양물을 마그네슘, 황산염 및 아르기닌이 보충된 M 63, 최소 배지와 같은 새로운 배지로 희석합니다. 그리고 엘로쿠아. 웰 당 100 마이크로 리터.

각 균주에 대해 24개의 웰을 할당하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 7개의 웰에 대한 희석 계열의 항생제 10 x 스톡 용액을 준비하고 얼음에 보관합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 플랑크톤 세포가 포함된 사용한 상등액을 제거합니다.

그런 다음 90마이크로리터의 M 63을 모든 웰에 추가하고 10마이크로리터의 적절한 항생제 원액을 무항생제 대조군에 추가합니다. 음, 각 복제 및 변형에 대해 10마이크로리터의 물을 추가합니다. 마이크로 역가 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 플랑크톤 세포가 포함된 사용한 상층액을 제거합니다. 모든 웰에 115마이크로리터의 M 63을 추가하고 24시간 동안 배양물을 계속 성장시킵니다. 섭씨 37도에서.

1/2 96당 1lb 오거 플레이트에 라벨을 붙입니다. 글쎄요, 마이크로 타이터 플레이트는 여러 갈래로 된 장치를 살균하고 100% 에탄올에 담그고 분젠 버너의 화염을 가로질러 갈래를 통과시킵니다. 갈래를 약간 식히십시오.

갈래의 끝을 사용합니다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에서 LB 오거 플레이트의 표면으로 플랑크톤 배양을 옮깁니다. LB 오거 플레이트를 섭씨 37도에서 16시간 동안 놓습니다.

그런 다음 섭씨 37도의 풍부한 배지에서 16시간 동안 항생제 배양액, 야생형 및 돌연변이 균주의 최소 살균 농도를 측정하고, 포화된 하룻밤 배양액을 1에서 100까지 항생제 내성 분석을 위한 새로운 배지로 96웰 마이크로타이터 접시의 각 웰에 희석하여 박테리아 성장에 대한 차단을 시각적으로 결정합니다. 박테리아 희석액 90마이크로리터를 추가합니다. 이제 플랑크톤 세포를 항생제의 농도 구배에 노출시킵니다.

토브라마이신 마이신(tobramycin mycin)과 같은 항생제의 희석 계열의 10 x 원액으로 시작하십시오. 실험 설계에 따라 10마이크로리터의 항생제 줄기를 추가합니다. 그런 다음 각 복제 및 균주에 대해 항생제가 없는 통제 웰에 10마이크로리터의 물을 추가합니다.

마이크로타이터 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 살아있는 세포를 분석합니다. 먼저 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 절반에 대해 하나의 LB 오거 플레이트에 레이블을 지정합니다. 100% 에탄올로 불을 피워 다각적인 장치를 살균합니다.

한 번 반복합니다. 그런 다음 다중 갈래 장치를 사용하여 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에서 LB 오거 플레이트의 표면으로 약 3마이크로리터의 플랑크톤 배양을 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다.

그런 다음 박테리아 성장에 대한 차단을 눈으로 식별하여 항생제의 최소 살균 농도를 결정합니다. 이 실험에서는 두 가지 다른 최소 BACTERICIDAL 농도 분석을 사용하여 PA 14 야생형의 민감도와 항생제 내성이 없는 돌연변이 균주를 비교했습니다. 유전자 NDVB.

여기서, 항생제 토브라마이신의 최소 살균 농도는 생물막에 대해 측정되었습니다. PA 14의 MBCB는 밀리리터당 100마이크로그램인데 비해 돌연변이의 경우 밀리리터당 12.5마이크로그램입니다. 대조적으로, 플랑크톤 세포에 대한 토브라마이신의 최소 살균 농도는 PA 14 야생형 및 돌연변이 모두에 대해 밀리리터당 8마이크로그램이었습니다.

일단 마스터하면 NBCB는 5일에 걸쳐 약 한 시간 만에 완료할 수 있습니다.