Name: 플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 배우세요 플랑크톤 및 생물막 세포의 항균제 내성을 96웰 마이크로타이터 플레이트로 비교하는 방법을. 최소 박혈 농도를 측정하여 생물막이 박테리아 저항성을 증가시키는 메커니즘을 밝힙니다.

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저자는 이 원고에 대한 편집 적 도움을 리 장, 시안 지 리, 아론 힌츠, 클레이튼 홀에게 감사드립니다. 이 분석은 처음에 조지 O'Toole의 실험실에서 개발되었다, 다트머스에서 의학의 가이젤 학교. Mah 박사의 실험실에 있는 연구는 캐나다와 낭포성 섬유증 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 보조금에 의해 지원됩니다.

1. MBC-B
<ol><li>
생물막 을 성장 (O'Toole9에서적응).
	<ol>
<li>37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.</li>
		<li>포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조). 이 매체는 보다 견고한 바이오필름의 형성을 자극합니다.</li>
		<li>96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 100 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.</li>
		<li>37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항생제의 농도 그라데이션에 미리 형성된 생물막을 노출
	<ol>
<li>7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 및 0.006 mg/ml 5-8이다. 25 mg/ml의 육수에서 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.06 mg/ml의 10배 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다(표 1참조).</li>
		<li>모든 우물에 90 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.</li>
		<li>원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.</li>
		<li>37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미디어를 새로 고침하고 살아있는 세포의 분리를 허용합니다.
	<ol>
<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다.</li>
		<li>모든 우물에 115 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
라이브 셀에 대한 분석.
	<ol>
<li>96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.</li>
		<li>100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.</li>
		<li>37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.</li>
		<li>항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한 컷오프(도1)를결정한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
세균균 제고
	<ol>
<li>37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.</li>
		<li>포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조).</li>
		<li>96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 90 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항생제의 농도 그라데이션에 판자 세포를 노출
	<ol>
<li>7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 및 0.0005 mg/ml이다. 25 mg/ml의 주식에서 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 및 0.005 mg/ml의 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.</li>
		<li>37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
라이브 셀에 대한 분석.
	<ol>
<li>96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.</li>
		<li>100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.</li>
		<li>37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.</li>
		<li>항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한차단(도 2)을결정한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

저자는 그녀가 경쟁 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

판자 세포내 항생 저항성은 세포의 영구적인변화(예를 들어 돌연변이)로 인한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)의 증가로 정의된다. 현재까지 확인된 생물막 특이적 저항 또는 내성의 메커니즘은 생물막 내의 야생 형 유전자의 발현의 결과입니다. 따라서, 저항의 고전적인 정의는 생물막에 적용되지 않습니다. 그러나, 정의의 또 다른 세트가 제시되었습니다: 저항 기계장치는 항생제가 그것의 표적에 접근하는 것을 방지하고, 내성 기계장치는 항생제의 표적을 종료하는 동안10. 생물막 특이적 항생 저항 메커니즘은 이러한 정의를 모두 포괄합니다. 용어 "저항"이 프로토콜 을 통해 사용되었습니다, 그러나 유전자가 저항 또는 내성에 기여하는지 결정하기 위하여 추가 실험이 수행되어야 합니다.
MBC-P와 MBC-B 의 소법은 생물막 형성 세균균균및 모든 살균항균제에 적응할 수 있다. 다른 박테리아 및 기타 항균제에 이 분석체를 적응시키기 위한 두 가지 중요한 기준은 바이...

항생 저항 분석은 처음에 박테리아의 판자 (자유 수영) 문화의 저항을 분석하기 위하여 개발되었습니다. 많은 세균성 감염은 생물막 (표면 부착 된 세포)를 포함하기 때문에, 우리는 생물막 특정 항생제 내성을 분석하는 방법을 개발하는 데 관심이 있었다. 그러나, 대부분의 항생 저항 분석은 생물막의 저항을 측정하기 위해 제대로 적합합니다. 예를 들어, 최소한의 억제 농도(MIC)를 결정하는 것은 판자 세균 배양1의항생제 내성을 결정하기 위한 금본위제이다. 이 분석은 희석 된 판자 문화를 항생제의 희석 시리즈와 혼합하는 것을 수반합니다.  판자 세포의 눈에 보이는 성장을 억제하는 항생제의 농도는 MIC입니다. 이 분석법은 성장 억제에 의존하기 때문에, 정의에 의해, 그것은 미리 자란 생물막에서 세포의 항생제 감도를 검사해야 하는 생물막 배양과 함께 작동할 수 없습니다. 여기에 설명된 MBC-B 분석법은 성장 억제를 측정하는 대신 생물막에 이미 존재하는 세포를 죽이는 항생제의 농도를 결정합니다. 따라서, 이러한 분석법은 확립된 생물막 감염의 항생제 치료를 모방하고 생체 내에서세균성 항생제 내성의 보다 관련성이 있는 관점을 제공하는 것을 목표로 한다.
생물막은 일반적으로 판자 배양보다 항생제 내성이 2-4이기 때문에, 생물막의 항생제 내성을 직접 적으로 플랑크토닉 배양의 항생제 내성을 포함하는 방법을 고안할 필요가 있었다. 따라서 이 방법의 또 다른 목표는 판자 세포와 생물막 세포 사이의 항생 저항 수준을 직접 비교할 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 MBC-P와 MBC-B 의 소는 세포가 비슷한 조건에서 배양되기 때문에 이를 가능하게 합니다. 우리는 생물막 특이적 항생제 저항 5-8에 중요한 몇몇 유전자를 연구하기 위하여 이 방법을 이용했습니다.

<table><tbody><tr><td> 1x&nbsp; M63 </td><td></td><td></td><td> 5x로 준비&nbsp; M63 스톡은 물 1L에 15g KH2P<O>sub4, 35g K2HPO4 및 10g(NH4)2SO><sub4를 용해합니다. 이 재고는 고압 멸균할 필요가 없으며 실온에서 보관할 수 있습니다.&nbsp; 5배 희석&nbsp; 재고 1 : 5, 오토 클레이브, 냉각 한 다음 원하는 구성 요소를 추가합니다 . </td></tr><tr><td> KH < > 2 PO 4 </td><td>Fisher</td> <td>P285-500 </td><td> </tr><tr><td> > K 2 HPO 4 </td><td>피셔</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td> </td></tr><tr><td> 황산마그네슘 </td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td> 1mM 최종 농도에 추가합니다. 물과 오토클레이브에 1M 스톡으로 준비합니다. </td></tr><tr><td> Tobramycin </td><td>Sigma</td><td> <</td><td>p>50 mg/m&nbsp를 준비하십시오. 주식. -20&deg;C. </td></tr><tr><td> 아르기닌 </td><td>시그마</td><td>A5131</td><td> 0.4% 최종 농도에 추가합니다.&nbsp; 20% 스톡으로 물과 필터 살균으로 준비합니다. 이 대체 탄소/에너지원은 포도당 및 카사미노산을 대체할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 96-웰 마이크로타이터 플레이트 </td><td>Corning</td><td>3595</td><td> 멸균, 평평한 바닥, 낮은 증발 </td></tr><tr><td> Tranferpette(다중 채널 피펫) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8-channel, 20-200 &뮤; l </td></tr><tr><td> Multiprong 장치 </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 프롱이 96웰 마이크로타이터 플레이트의 &frac12;에 맞습니다 </td></tr></tbody></table>

플랑크토닉 세포(mbc-p) 및 생물막세포(mbc-b)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

이 프로토콜은 시험관 내에서생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉과 생물막 저항을 직접 비교할 수 있게 한다. 박테리아는 96 웰 마이크로티터 플레이트의 우물에 접종됩니다. 판자 분석의 경우, 선택의 항균제의 직렬 희석이 세균 현탁액에 첨가된다. 생물막 분석에서, 한 번 접종, 박테리아는 시간의 설정 된 기간 동안 생물 막을 형성하기 위해 남아있다. 부착되지 않은 세포는 우물에서 제거되고, 미디어는 보충되고 선택의 항균제의 직렬 희석이 첨가된다. 항균제에 노출된 후, 판자 세포는 성장을 위해 분석된다. 생물막 분석의 경우, 매체는 항균제가 결여된 신선한 매체로 리프레시되고 생물막 세포는 회복상태로 남겨집니다. 생물막 세포 생존가능성은 회복 기간 이후에 분석된다. 항균제에 대한 MBC-P는 판자 배양에서 세포를 죽이는 약물의 가장 낮은 농도로 정의된다.  반면, MBC-B는 24시간 동안 항균제의 농도를 높이기 위해 미리 형성된 생물막을 노출시킴으로써 결정된다. MBC-B는 생물막내세포를 죽이는 항균제의 가장 낮은 농도로 정의된다.

MBC-P와 MBC-B 는 PA14 와일드 타입의 감성을 PA14 ∆ndvB와비교하며 진행되었다. 토브라마이신은 항생제로 사용되었다. 단계 1.4.4(도 1)및 단계 2.3.4(도 2)에해당하는 결과가 제시된다. MBC-P와 MBC-B 의 한 미수구는 '∆'에 접종을 했다. MBC-B 프로토콜의 1.0-1.4 단계와 MBC-P 프로토콜의 2.0-2.3 단계를 완료한 후 실행 가능한 세포는 LB 한천판에 도금되었습니다. 토브라마이신의농도(μg/ml)는 세포의 왼쪽에 표시된다. PA14의 MBC-B는 100 μ g/ml,∆NDvB의 MBC-B는 12.5 μ g/ml이다. <span style="font-size: 14px; ...

이 프로토콜은 96웰 마이크로티터 플레이트를 사용하여 체외에서 생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉 과 생물막 내성을 직접 비교할 수 있게 한다. 플랑크토닉 또는 생물막 박테리아는 선택의 항균제의 직렬 희석에 노출된다. 생존력은 한천 판의 성장에 의해 분석됩니다.

플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

이 절차는 생물막을 형성할 수 있는 박테리아 균주에 대한 플랑크톤과 생물막 내성을 직접 비교합니다. 먼저, 생물막을 확립하고, 배지를 보충하고, 선택한 항균제를 연속 희석합니다. 그런 다음 세포가 신선한 매체에서 회복되도록 합니다.이제 LB 오거에 도금하여 세포의 생존력을 분석합니다. 궁극적으로 플랑크톤 및 생물막 세포의 최소 살균 농도를 결정하는 것은 생물막의 성장으로 인한 내성 증가를 보여주는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 인접한 우물을 오염시키거나 여러 갈래로 된 장치의 갈래를 충분히 식혀서 박테리아를 죽이지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.섭씨 37도의 풍부한 배지에서 16시간 동안 박테리아의 야생형 및 돌연변이 균주인 배양은 밤새 포화된 배양물을 마그네슘, 황산염 및 아르기닌이 보충된 M 63, 최소 배지와 같은 새로운 배지로 희석합니다. 그리고 엘로쿠아. 웰 당 100 마이크로 리터.각 균주에 대해 24개의 웰을 할당하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, 7개의 웰에 대한 희석 계열의 항생제 10 x 스톡 용액을 준비하고 얼음에 보관합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 플랑크톤 세포가 포함된 사용한 상등액을 제거합니다.그런 다음 90마이크로리터의 M 63을 모든 웰에 추가하고 10마이크로리터의 적절한 항생제 원액을 무항생제 대조군에 추가합니다. 음, 각 복제 및 변형에 대해 10마이크로리터의 물을 추가합니다. 마이크로 역가 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 플랑크톤 세포가 포함된 사용한 상층액을 제거합니다. 모든 웰에 115마이크로리터의 M 63을 추가하고 24시간 동안 배양물을 계속 성장시킵니다. 섭씨 37도에서.1/2 96당 1lb 오거 플레이트에 라벨을 붙입니다. 글쎄요, 마이크로 타이터 플레이트는 여러 갈래로 된 장치를 살균하고 100% 에탄올에 담그고 분젠 버너의 화염을 가로질러 갈래를 통과시킵니다. 갈래를 약간 식히십시오.갈래의 끝을 사용합니다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에서 LB 오거 플레이트의 표면으로 플랑크톤 배양을 옮깁니다. LB 오거 플레이트를 섭씨 37도에서 16시간 동안 놓습니다.그런 다음 섭씨 37도의 풍부한 배지에서 16시간 동안 항생제 배양액, 야생형 및 돌연변이 균주의 최소 살균 농도를 측정하고, 포화된 하룻밤 배양액을 1에서 100까지 항생제 내성 분석을 위한 새로운 배지로 96웰 마이크로타이터 접시의 각 웰에 희석하여 박테리아 성장에 대한 차단을 시각적으로 결정합니다. 박테리아 희석액 90마이크로리터를 추가합니다. 이제 플랑크톤 세포를 항생제의 농도 구배에 노출시킵니다.토브라마이신 마이신(tobramycin mycin)과 같은 항생제의 희석 계열의 10 x 원액으로 시작하십시오. 실험 설계에 따라 10마이크로리터의 항생제 줄기를 추가합니다. 그런 다음 각 복제 및 균주에 대해 항생제가 없는 통제 웰에 10마이크로리터의 물을 추가합니다.마이크로타이터 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 살아있는 세포를 분석합니다. 먼저 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 절반에 대해 하나의 LB 오거 플레이트에 레이블을 지정합니다. 100% 에탄올로 불을 피워 다각적인 장치를 살균합니다.한 번 반복합니다. 그런 다음 다중 갈래 장치를 사용하여 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에서 LB 오거 플레이트의 표면으로 약 3마이크로리터의 플랑크톤 배양을 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다.그런 다음 박테리아 성장에 대한 차단을 눈으로 식별하여 항생제의 최소 살균 농도를 결정합니다. 이 실험에서는 두 가지 다른 최소 BACTERICIDAL 농도 분석을 사용하여 PA 14 야생형의 민감도와 항생제 내성이 없는 돌연변이 균주를 비교했습니다. 유전자 NDVB.여기서, 항생제 토브라마이신의 최소 살균 농도는 생물막에 대해 측정되었습니다. PA 14의 MBCB는 밀리리터당 100마이크로그램인데 비해 돌연변이의 경우 밀리리터당 12.5마이크로그램입니다. 대조적으로, 플랑크톤 세포에 대한 토브라마이신의 최소 살균 농도는 PA 14 야생형 및 돌연변이 모두에 대해 밀리리터당 8마이크로그램이었습니다.일단 마스터하면 NBCB는 5일에 걸쳐 약 한 시간 만에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

이 동영상은 박테리아에 대한 테스트 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 보여줍니다. 시험용 항생제의 연속 희석액이 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 세균성 병원균 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 현탁액과 박테리아에 의한 피오멜라닌 생성 억제제를 첨가한 후, 웰의 광학 밀도를 측정하여 항생제의 최소 억제 농도와 피오멜라닌 생산 억제제의 영향이 박테리아의 항생제 감수성에 미치는 영향을 계산합니다.

항생제의 최소 억제 농도를 평가하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법

박테리아 피오멜라닌 생성은 산화 스트레스와 독성에 대한 저항력을 증가시킵니다. 우리는 pyomelanin 생성의 억제를 결정하고 박테리아의 산화 스트레스에 대한 민감도의 증가를 분석하며 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 데 사용할 수 있는 기술에 대해 보고합니다.

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

이 프로토콜은 고처리량 96웰 고정 뚜껑 정적 생물막 스크리닝을 위해 자체 조립된 딥 웰 PCR 플레이트 장치를 사용하여 생물막 성장 및 바이오매스 측정을 수행하는 방법론을 제시합니다.

PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.

정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

이 프로토콜은 펠리클 바이오필름을 개발하기 위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 배양 용량으로 확장 가능하여 다양한 실험 목표에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 설계는 여러 마이코박테리아 종의 생물막 형성 가능성에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 가능하게 합니다.

항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

이 프로토콜은 박테리아 활성 모델링과 조합적 상호작용 분석법을 사용하여 식물화학물질이 전통적 살균제의 살균 효과를 어떻게 증진할 수 있는지 체계적으로 평가하는 틀을 제공하며, 이는 미생물 방제를 개선하고 전체 살균제 사용을 줄이는 시너지 혼합물을 식별하는 것을 목표로 합니다.

시험관 내 식물유래 분자가 기존 살생물에 미치는 증강 효과 평가

배우세요 플랑크톤 및 생물막 세포의 항균제 내성을 96웰 마이크로타이터 플레이트로 비교하는 방법을. 최소 박혈 농도를 측정하여 생물막이 박테리아 저항성을 증가시키는 메커니즘을 밝힙니다.

플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

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