에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 바이오필름의 국소적 물리적 특성을 마이크로미터 규모에서 두 가지 방식으로 측정하는 것입니다. 이를 위해, 바이오필름의 구조적 특성을 방해하지 않으면서 원격으로 작동 가능한 프로브 역할을 수행할 수 있도록 성장 중인 바이오필름에 자성 입자를 도입합니다. 그런 다음 전용 자기 집게(magnetic tweezers)를 사용하여 각 입자에 정의된 힘을 가합니다.

바이오필름 내에 매립된 입자가 자기 인력에 의해 변위되는 과정을 비디오 현미경으로 모니터링하여 국소 점탄성 매개변수를 도출하고, 바이오필름 기계적 특성의 3D 공간 분포를 제공합니다. 이를 통해 E. coli 바이오필름의 기계적 불균질성을 보여주는 결과를 얻었으며, 어떤 바이오필름 구성 성분이 바이오필름의 물리적 특성을 지지하는지에 대한 단서를 제공합니다. 따라서 현미경 관찰, 콜로지(cology) 또는 전체 바이오 식생과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 재료의 원래 구조를 방해하지 않고 인 시투(in situ) 상태에서 기계적 특성의 공간적 분포를 보고한다는 점입니다.

본 프로토콜을 위한 자성 입자를 준비하려면, 2.8 µm 입자가 담긴 스톡 바이알을 볼텍싱하여 재현탁시킵니다. 그 다음 10 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 입자를 세척하기 위해 190 µL의 최소 배지를 추가하고 튜브를 회전시킨 후, 자성 샘플 랙에 올려놓고 펠릿이 형성될 때까지 기다렸다가 상층액을 흡입하여 제거합니다.

이 세척 단계를 두 번 더 반복하고, 비드를 190 µL의 최소 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, 세척된 비드 용액 50 µL에 0.4% glucose가 포함된 M 63 B one 950 µL를 첨가하여 입자 농도를 밀리리터당 약 500만 개의 비드로 조정합니다. 채널을 준비하려면, 다이아몬드 유리 절단기를 사용하여 10 cm 길이의 붕규산 유리 모세관 두 개를 잘라 8 cm 길이의 조각 두 개를 얻습니다.

유리 절단기를 사용하여 유리 슬라이드를 반으로 자릅니다. 그런 다음, 빠르게 경화되는 시아노아크릴레이트 접착제 또는 순간접착제를 사용하여 이 도식에 표시된 대로 두 개의 모세관 조각을 두 개의 유리 슬라이드 조각에 부착합니다. 두 조각 사이의 간격을 2 cm로 두고 양 끝에 1 cm씩 돌출되도록 배치한 후, 전체 장치와 필요한 튜빙을 오토클레이브로 멸균합니다.

추가적인 채널 연결을 위해, 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서 다음과 같은 멸균 재료를 준비하십시오. 장착된 채널 튜빙 및 커넥터, 2개의 소아용 버블 필터 또는 트랩, 2개의 클램프, M 63 B 및 1.4% glucose가 채워진 30 milliliter 주사기, 그리고 폐액병입니다.

두 모세관을 동일한 방식으로 연결합니다. 튜브 중 하나를 사용하여 폐액 병을 한쪽 모세관 끝에 연결하십시오.

그런 다음 루어 락 커넥터를 접합부로 사용하여 모세관의 반대쪽 끝을 수제 버블 트랩 또는 트랩 1에 연결하고, 트랩 1을 트랩 2에 연결합니다. 그다음 30 mL M 63 B one 주사기를 트랩 2에 연결합니다. 이어서 장치 내부를 0.4% glucose가 포함된 멸균 M 63 B one으로 채웁니다.

시린지를 시린지 펌프에 장착하고, 실험 속도보다 약 5 mL/h 더 빠른 속도로 시린지 펌프를 작동시킵니다. 필요한 경우 회로 내의 모든 기포를 주의 깊게 추적하여 제거하십시오. 이 과정에서 회로를 분리했다가 다시 연결하십시오.

세포 입자 혼합물을 튜브에 주입하기 전과 주입하는 동안 기포를 완전히 제거하십시오. 모세관 위에 폐기물 수집 용기를 배치하면 바이오필름의 지속적인 성장에 도움이 됩니다. 배지가 시스템을 통해 10~15분 동안 흐르도록 둡니다. 그동안 마이크로 원심분리 튜브에서 흡광도 0.5의 박테리아 현탁액 1 mL와 앞서 준비한 세척된 비드 용액 1 mL를 혼합합니다.

흐름을 차단하고 튜빙을 다시 연결한 다음 클램프를 잠급니다. 다음으로, 1 mL 시린지에 박테리아 비드 혼합물을 채워 모세관에 주입합니다. 수제 버블 트랩 이후 단계에서, 장치를 현미경으로 옮깁니다.

모세관을 현미경 스테이지에 설치하고 폐액 컨테이너를 약간 더 높은 위치에 둡니다. 시린지 펌프를 현미경 옆 작업대에 놓습니다. 박테리아가 가라앉아 모세관 표면에 부착될 수 있도록 장치를 15분에서 20분 동안 그대로 둡니다.

박테리아가 모세관에 부착되면, 클램프를 열고 시린지 펌프의 유속을 조절한 후 흐름을 시작합니다. 24~48시간에 걸쳐 모세관 표면에 바이오필름이 형성되며, 모세관 바닥 평면에 초점을 맞추고 샘플 이미지의 타임랩스 기록을 시작합니다. 일반적으로 분당 2장의 이미지 획득 빈도면 바이오필름 성장을 충분히 보고할 수 있습니다.

이 영상은 세포-입자 혼합물을 주입한 직후의 바이오필름 초기 단계를 보여줍니다. 모세관 획득 시 빈도는 초당 한 장의 이미지이며, 영상은 초당 10프레임으로 재생됩니다. 4시간 동안의 성장 후, 입자들은 표면에서 점차 분리되어 바이오필름 부피 전체로 분포되었습니다.

파란색 화살표는 분리 이벤트를 표시합니다. 여기서 획득 빈도는 분당 2장의 이미지이며, 동영상은 초당 15프레임으로 재생됩니다. 20시간의 성장 후, 초점 평면에서 고르게 분포된 12개의 입자를 관찰할 수 있습니다.

이 영상은 모세관 바닥에서 20 µm 위에 위치한 중간 평면에서 촬영되었습니다. 분당 2장의 이미지가 획득되었습니다. 영상은 초당 15프레임으로 재생됩니다.

자기 입자가 접종된 바이오필름이 수동으로 성장하면, 자기 핀셋을 현미경 스테이지에 고정하십시오. 관찰 구역에 적절한 자기장 구배가 생성되도록, 빨간색으로 표시된 측정 영역이 Y축을 따라 핀셋의 좌우 폴 가장자리로부터 300 µm 떨어진 곳에 위치하도록 핀셋을 본 다이어그램과 같이 배치하십시오. 모세관의 바닥은 핀셋 바닥에서 200 µm 아래에 배치합니다.

이 단계를 수행하려면 현미경 스테이지의 XY 이동 제어 장치를 사용하여 왼쪽 자극의 가장자리와 모세관의 왼쪽 가장자리를 맞춥니다. 동일한 관찰 시야에서 핀셋의 왼쪽 마이크로 매니퓰레이터 x 다이얼을 사용하여 자극의 위치를 모세관 가장자리로부터 300 micrometers 떨어진 곳으로 조정합니다. 오른쪽 면에서도 동일한 작업을 수행합니다.

그런 다음 모세관 바닥을 기준으로 Z축을 따라 트위저의 위치를 조정합니다. 먼저 전극의 바닥을 모세관의 바닥에 맞춘 후, 전극을 200 micrometers 위로 이동시킵니다.

마이크로 매니퓰레이터의 Z 다이얼을 사용하여, 함수 발생기의 파라미터를 0 신호 24초 및 4A의 정전류 16초로 설정하십시오. 트리거를 사용하여 20초 후에 명시야 광 셔터로 전송하십시오.

신호 동기화를 위해 파워 앰프를 통해 트위저를 함수 발생기에 연결하십시오. 공간적으로 분포된 크리프 곡선을 얻으려면 극을 직렬로 적절하게 연결하는지 주의하십시오. 공간 원점을 잡고, Z축의 원점을 모세관 내부 바닥으로 설정하십시오.

현미경 Z축 제어 위치를 기록하십시오. 그런 다음 모세관의 가장자리와 폴피스의 가장자리에 의해 각각 정의되는 x축과 Y축의 교차점을 찾으십시오. 이곳이 분석의 원점이 됩니다.

좌표를 기록하십시오. 이후의 모든 좌표는 이 원점을 기준으로 측정됩니다. 바이오필름이 성장하면, 미동 초점 조절 노브를 사용하여 모세관의 수직 위치를 조정함으로써 첫 번째 평면이 모세관 바닥에서 4~7 µm 위에 위치하도록 합니다.

이 슬라이스는 공간 기준점의 원점이 왼쪽 상단 모서리에 위치한 바이오필름 슬라이스에 해당합니다. 그런 다음 전류 발생기를 켜고 이미지 획득 시퀀스를 수동으로 트리거하십시오. 42번째 이벤트 시퀀스를 시작하면, 여기서 획득한 이미지 스트림은 특정 평면 및 XY 필드에 해당하게 됩니다.

시퀀스 캡처가 완료되면, 모세관을 이동하여 새로운 영역의 비디오를 캡처하십시오. 데이터 분석에 필요한 모든 비디오를 얻을 때까지 이 과정을 계속 반복하십시오. 모든 입자에서 획득한 모든 스택에 대해 ImageJ 또는 이에 상응하는 입자 추적 소프트웨어에서 이미지를 여십시오.

입자 변위를 추적하여 이미지를 텍스트 파일로 변환합니다. 다음으로, 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 변위 곡선을 그리고, 이 변위 곡선을 컴플라이언스 곡선으로 변환하여 여기에 표시된 컴플라이언스 공식에 따라 재료의 총 컴플라이언스 JFT를 시간의 함수로 계산합니다. 이 공식은 이전에 established 및 동료들이 정립한 바와 같이, 점탄성 및 비압축성 매질에 내장된 기준 입자에 대해 가해진 응력과 재료 변형 사이의 관계를 설명합니다. 점탄성 재료에 대한 일반적인 Burgers 모델에 크리프 컴플라이언스 곡선을 피팅하여, 바이오필름의 점탄성 특성에 대한 공간적 분포를 제공하는 점탄성 파라미터 J zero J one at the zero at the one prime을 도출합니다. 크리프 곡선은 약 200 by 200 by 40 cubic micrometers의 바이오필름 미세 부피 내 서로 다른 깊이에서 수집되었습니다. 전형적인 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

탄성 컴플라이언스인 J zero 값은 깊이 방향인 Z축과 바이오필름의 가로 방향인 y축의 함수로 나타내었습니다. 각 점은 크리프 곡선 분석을 통해 J zero 값이 도출된 비드를 나타냅니다. 이 데이터는 국부적 컴플라이언스가 바이오필름의 깊이에 따라 거의 3배수(orders of magnitude) 범위 내에서 다양하게 변한다는 것을 보여줍니다.

또한, 모든 바이오필름 높이에서 강한 측면 불균질성이 나타났습니다. 데이터는 또한 광범위하고 비대칭적인 형태를 보이는 컴플라이언스 값의 분포를 제공합니다. 이러한 결과를 이전에 다른 생물학적 폴리머에서 얻은 결과와 비교해 보면, 바이오필름의 기계적 특성이 고도로 가교된 폴리머 겔에 의해 지지됨을 시사합니다.

C에서는 여기서 볼 수 있듯이 낮은 유속과 같은 서로 다른 환경 조건 하에서 바이오필름의 국소 특성에 대한 두 가지 측정이 수행되었습니다. 0.1 mL/h에서 성장한 바이오필름의 컴플라이언스 값은 여전히 매우 불균일한 기계적 프로파일을 보입니다. 하지만 1 mL/h에서 성장한 바이오필름에서 관찰되었던 바이오필름 강성의 뚜렷한 Z 깊이 의존성은 사라졌습니다.

이러한 결과는 외부 조건이 바이오필름 조직화에 미치는 상당한 영향을 입증합니다. 영상을 시청함으로써 완전히 제어된 성장 조건 하에서 바이오필름 연구소의 점성 특성을 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.