에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동 현장에서 3D 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 C에서 마이크로미터 규모에서 박테리아 생물막의 국소 물리적 특성을 두 번 측정하는 것입니다. 이를 위해 자성 입자가 성장하는 생물막에 도입되어 생물막의 구조적 특성을 방해하지 않고 원격으로 작동할 수 있는 프로브 역할을 합니다. 그런 다음 전용 자기 핀셋을 사용하여 각 입자에 정의된 힘을 가합니다.

생물막 필름에 내장되어 있는 경우, 자기 당김에 의해 유도된 입자 변위는 비디오 현미경을 사용하여 모니터링되어 국소 점탄성 매개변수를 도출하고 생물막의 기계적 특성의 3D 공간 분포를 제공합니다. 대장균 생물막의 기계적 이질성을 보여주고 어떤 생물막 성분이 생물막 물리적 특성을 지원하는지에 대한 단서를 제공하는 결과가 얻어졌습니다. 따라서 현미경 검사, 양학 또는 전체 생물 식물과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 재료의 원래 구조를 방해하지 않고 현장에서 기계적 특성의 공간적 분포를 보고한다는 것입니다.

이 프로토콜에 대한 자성 입자를 준비하기 위해 Vortex의 2.8마이크로미터 입자 스톡 바이알을 사용하여 다시 부유시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 입자를 세척하려면 190마이크로리터의 최소 매체를 추가하고 튜브를 소용돌이치고 자기 샘플 랙에 놓고 펠릿이 형성될 때까지 기다렸다가 상층 용액을 흡인합니다.

이 세척 단계를 두 번 더 반복하고 최소 배지의 190마이크로리터에 비드를 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 세척된 비드 용액 50마이크로리터에 0.4%글루코스가 함유된 M 63 B 950마이크로리터를 첨가하여 입자 농도를 밀리리터당 약 500만 비드로 조정합니다. 채널을 준비하려면 다이아몬드 유리 절단기를 사용하여 10cm 길이의 2개의 정사각형 규산보 유리 모세관을 절단하여 8cm 길이의 조각 2개를 얻습니다.

유리 커터를 사용하여 유리 슬라이드를 반으로 자릅니다. 그런 다음 속효성 시아노아크릴레이트 접착제 또는 슈퍼 접착제를 사용하여 이 다이어그램과 같이 두 개의 모세관 조각을 두 개의 유리 슬라이드 조각에 부착합니다. 2cm 떨어져 있고 양쪽 끝에 1cm 돌출부가 있어 전체 설정과 필요한 튜빙을 오토클레이브합니다.

추가 채널 연결을 위해 lanar flow hood 아래에 다음 멸균 물질을 모으십시오. 장착된 채널 튜브 및 커넥터, 2개의 소아용 버블 필터 또는 트랩. 클램프 2개, M 63 B, 1.4% 포도당 및 폐병으로 채워진 30ml 주사기.

두 모세혈관을 같은 방법으로 연결합니다. 튜브 중 하나를 사용합니다. 쓰레기통을 한쪽 모세관 끝에 연결합니다.

그런 다음 루어 잠금 커넥터를 접합부로 사용하여 모세관의 다른 쪽 끝을 수제 버블 트랩에 연결하거나 하나를 트랩하고 하나를 트랩하여 두 개를 트랩합니다. 그런 다음 30 밀리리터 M 63 B 1 주사기를 트랩 2에 연결합니다. 다음으로 멸균 M 63 B로 설정을 채우고 0.4% 포도당으로 설정합니다.

주사기 펌프에 주사기를 설치하고 실험 속도보다 시간당 약 5밀리리터 높은 속도로 주사기 펌프를 켭니다. 필요한 경우 회로의 모든 기포를 주의 깊게 추적하고 제거하십시오. 이 절차를 시도하는 동안 회로를 분리했다가 다시 연결하십시오.

세포 입자 혼합물을 튜브에 도입하기 전과 삽입 할 때 기포를 제거하도록주의하십시오., 모세 혈관 위에 쓰레기를 배치하는 데 도움이되며, 이는 생물막의 지속적인 성장에 도움이됩니다. 매체가 10-15분 동안 시스템을 통해 흐르도록 합니다. 그 동안, 마이크로 원심분리기 튜브에서 광학 밀도 0.5에서 1ml의 박테리아 현탁액을 이전에 준비한 세척된 비드 용액 1ml와 혼합합니다.

흐름을 끄고 튜브를 다시 부착한 다음 클램프를 닫습니다. 다음으로, 1ml 주사기에 박테리아 비드 혼합물을 채우고 모세혈관에 주입합니다. 수제 버블 트랩 후 장치를 현미경으로 옮깁니다.

현미경 스테이지에 모세관을 설치하고 쓰레기통을 약간 높은 높이에 놓습니다. 주사기 펌프를 현미경 옆 조리대에 놓습니다. 박테리아가 정착하여 모세관 표면에 부착될 수 있도록 장치를 15-20분 동안 그대로 두십시오.

박테리아가 모세관에 부착되면 클램프를 열고 주사기 펌프의 유속을 조정하고 흐름을 시작합니다. 24시간에서 48시간 동안 모세관 표면에 생물막이 형성되고 모세관 바닥면에 초점을 맞추고 샘플 이미지의 타임랩스 기록을 시작합니다. 일반적으로 분당 2개의 이미지인 획득 빈도는 생물막 성장을 적절하게 보고합니다.

이 동영상은 세포 입자 혼합물 주입 직후의 생물막의 초기 단계를 보여줍니다. 모세관 획득에서 주파수는 초당 하나의 이미지이고 동영상은 초당 10프레임으로 재생됩니다. 4시간의 성장 후, 입자는 표면에서 점진적으로 분리되어 생물막 부피로 분배되었습니다.

파란색 화살표는 분리 이벤트를 표시했습니다. 여기서, 획득 빈도는 분당 2개의 이미지이며, 영화는 초당 15프레임으로 재생됩니다. 20시간 동안 성장한 후 초점면에서 균일하게 분포된 12개의 입자를 모니터링할 수 있습니다.

이 동영상은 모세관 바닥에서 20마이크로미터 떨어진 중간 평면에서 촬영되었습니다. 분당 2개의 이미지가 획득되었습니다. 영화는 초당 15프레임으로 재생됩니다.

자성 입자가 파종된 생물막이 수동으로 성장하면 자기 핀셋을 현미경 스테이지에 나사로 고정합니다. 관찰 영역에서 적절한 자기장 구배가 생성되도록 하려면 핀셋이 빨간색으로 표시된 측정 영역이 Y축을 따라 핀셋의 왼쪽 오른쪽 극 가장자리에서 300마이크로미터 떨어진 이 다이어그램과 같이 배치되었는지 확인합니다. 모세관의 바닥은 핀셋 바닥에서 200마이크로미터 아래에 위치합니다.

이 단계를 달성하려면 현미경 스테이지의 XY 이동 제어를 사용하여 왼쪽 자극의 가장자리와 모세관의 왼쪽 가장자리를 가져옵니다. 동일한 관찰 필드에서 핀셋의 왼쪽 미크론 매니퓰레이터의 x 다이얼을 사용하여 모세관 가장자리에서 300마이크로미터에서 폴의 위치를 조정합니다. 오른쪽에서도 동일한 작업을 수행합니다.

그런 다음 모세관 아래쪽을 기준으로 Z축을 따라 핀셋 위치를 조정합니다. 먼저 극의 바닥을 모세관의 바닥에 정렬하고 극을 이동합니다. 200마이크로미터 높이.

마이크로 매니퓰레이터의 Z 다이얼을 사용하여 함수 발생기의 매개변수를 24초의 제로 신호와 16초의 4암페어로 설정합니다. 방아쇠가 있는 직류. 20초 후에 명시야 조명 셔터로 보냅니다.

신호 동기화를 위해 전력 증폭기를 통해 핀셋을 함수 발생기에 연결합니다. 공간적으로 분포된 크리프 곡선을 얻기 위해 극을 직렬로 적절하게 연결하는 데 주의하십시오. 공간적 원점을 취하고 모세관의 내부 바닥에 있는 Z축의 원점을 취합니다.

현미경 Z 제어 위치를 기록해 둡니다. 그런 다음 x축과 Y축의 교차점을 찾는데, 이는 각각 모세관의 가장자리와 극 조각의 가장자리로 정의됩니다. 이것이 분석의 원점입니다.

좌표를 기록해 둡니다. 모든 좌표는 다음에서 이 원점을 기준으로 합니다. 생물막이 성장하면 미세 초점 제어 손잡이를 사용하여 첫 번째 평면이 모세관 바닥에서 4-7마이크로미터 위에 위치하도록 모세관의 수직 위치를 조정합니다.

이 slice는 spatial referential의 원점이 왼쪽 상단 모서리에 위치한 biofilm slice에 해당합니다. 그런 다음 전류 발생기를 켜고 이미지 획득 시퀀스를 수동으로 트리거합니다. 이벤트의 42번째 시퀀스를 시작하기 위해, 여기에서 획득된 이미지 스트림은 주어진 평면 및 XY 필드에 해당합니다.

염기서열을 캡처한 후 캐필러리를 이동하여 새 필드의 비디오를 캡처합니다. 이 프로세스를 계속 반복하여 데이터를 분석하는 데 필요한 모든 비디오를 얻습니다. 이미지 J의 이미지를 열거나 모든 입자에서 획득한 모든 스택에 대해 동등한 입자 추적 소프트웨어를 엽니다.

입자 변위를 추적하여 이미지를 텍스트 파일로 변환합니다. 다음으로, 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 변위 곡선을 그리고 변위 곡선을 여기에 표시된 규정 준수 공식에 따라 재료 JFT의 총 준수가 시간 함수로 계산되는 규정 준수 곡선으로 변환하고, 이 공식은 과거 빨간색 입자에 대한 적용된 응력과 재료 변형률 사이의 관계를 설명합니다. 또는 이전에 확립된 바와 같이 점탄성 및 비압축성 매체에 매립되고, 그의 동료들은 점탄성 재료에 대한 크리프 준수 곡선의 조정에서 일반 버거 모델에 이르기까지 점탄성 매개변수 J0 J 1 at 0 at the one prime 점탄성의 공간 분포를 제공하기 위해 바이오필름 크리프 곡선의 점탄성 특성의 공간 분포를 약 200의 바이오필름 마이크로 부피에서 상이한 깊이에서 수집하였다 200 x 40입방 마이크로미터. 일반적인 결과는 다음과 같습니다.

J 0의 값, 탄성 순응도는 깊이를 따라 Z축과 생물막의 측면 치수를 따라 Y축의 함수로 제공됩니다. 각 점은 크리프 곡선 해석을 통해 J 0 값을 제공하는 비드에 해당합니다. 이 데이터는 지역 순응도가 거의 3 자릿수에 걸쳐 생물막의 깊이에 따라 다양하다는 것을 보여줍니다.

또한, 강한 측면 이질성은 모든 생물막 높이에서 발생했습니다. 이 데이터는 또한 광범위하고 비대칭적인 모양을 나타내는 규정 준수 값의 분포를 제공합니다. 이러한 결과를 이전에 다른 생물학적 고분자에서 얻은 결과와 비교하면 생물막의 기계적 특성이 고도로 가교 결합된 고분자 겔에 의해 뒷받침된다는 것을 알 수 있습니다.

C에서 생물막의 두 가지 측정에서, 국소 특성은 여기에서 볼 수 있듯이 더 낮은 유속과 같은 다른 환경 조건에서도 수행되었습니다. 시간당 0.1밀리리터로 성장한 생물막의 규정 준수 값은 여전히 매우 이질적인 기계적 프로파일을 나타냅니다. 그러나 시간당 1밀리리터로 성장한 생물막에서 관찰된 생물막 강성의 명확한 Z 깊이 의존성은 사라졌습니다.

이러한 결과는 외부 조건이 생물막 조직에 미치는 상당한 영향을 보여줍니다. 완전히 제어된 성장 조건에서 Biofilm Institute의 Visco 특성을 매핑하는 방법을 잘 이해해야 합니다.