에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법
2014년 2월 4일
예쁜 꼬마 선충에서 항 정신병 약물 (APDS)의 효과를 테스트하기위한 접근 방법을 설명합니다. 분석법 개발과 생존에와 인두 펌핑 속도에 약물 효과를 테스트하기 위해 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 APDS 이외의 다른 약 종류와 약물 유전 학적 실험에 적용 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 바다 엘간의 발달 및 인두 펌핑에 대한 항정신병 약물 효과를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 선충의 개체군을 늘리고 그로부터 동기화된 동물 개체군을 생성함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 동기화된 난자 또는 성체를 약물 레이스 분석 플레이트로 옮기는 것입니다.
마지막 단계는 기생충에 대한 약물의 효과를 관찰하고 점수를 매기는 것입니다. 궁극적으로, 이 결과는 항정신병 약물이 약물에 노출된 동물의 발달을 지연시키고 인두 펌핑을 억제한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 항정신병 약물의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 다른 작은 분자 및 지질과 같은 큰 분자를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
먼저 12웰 플레이트에 웰당 중간 크기의 NGM 2밀리리터를 로드합니다. 접시를 실온에서 굳히도록 따로 보관하십시오. 다음으로, OP 50 박테리아 군집을 선택하여 50ml 용량의 LB 배양액 병으로 옮깁니다.
박테리아는 섭씨 37도에서 밤새 220RPM으로 흔들어 다음날 준비된 플레이트의 각 웰로 넣습니다. 박테리아 배양 20마이크로리터에서 플레이트를 다음 날 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하도록 설정합니다. 작업 농도에서 80마이크로리터의 관심 약물을 각 좌석에 잘 적재합니다.
이 경우, 약물은 C 클로자핀입니다. 부분 표본을 복용하기 전에 용액을 와류로 처리하십시오. 용액을 소용돌이쳐 웰에 고르게 분포시키고 플레이트 뚜껑을 연 상태에서 실온에서 흡수되도록 합니다.
그런 다음 분석을 진행하거나 플레이트를 밤새 섭씨 20도에서 보관하고 다음날 분석을 시작합니다. 관심 있는 유전자형에서 난자를 수집하는 것으로 시작합니다. GR 성인이 많은 벌레 개체군으로 시작하십시오.
M nine 버퍼를 사용하여 3.5cm 접시에 기생충을 씻어냅니다. 그런 다음 15mm 튜브에서 2000RPM으로 1분 동안 스핀다운합니다. 흡인을 통해 상층액을 제거하고 5ml의 표백제로 교체하십시오.
그런 다음 튜브를 뒤집어 성인을 부드럽게 방해하고 동물이 계속 용해되기 시작할 때까지 기다립니다. 스코프 아래에서 용해되는 벌레를 관찰하십시오. 벌레의 절반 정도가 녹았을 때.
약 5분 후 튜브를 돌려 난자를 채취하고 상층액을 흡인한 다음 M nine buffer로 빠르게 교체합니다. 그런 다음 이전과 같이 튜브를 다시 회전시키고 약 100마이크로리터의 M nine 상층액을 제외한 모든 것을 제거합니다. 난자를 매달아 놓으려면 튜브를 소용돌이치십시오.
그런 다음 2마이크로리터의 현탁액을 NGM 플레이트로 옮기고 옮겨진 난자의 수를 계산합니다. 그런 다음 약물 처리 플레이트에 웰당 30-35개의 알을 넣고 플레이트를 섭씨 20도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간이 지나면 부화한 알의 수를 점수로 매깁니다.
25 개 이상의 벌레가 존재하면 여분의 벌레를 잘 제거하십시오. 접시에 있는 벌레를 인큐베이터로 되돌려 놓고 매일 24시간 간격으로 나중에 관찰하고 벌레의 크기와 외음부의 모양에 따라 우물에 있는 벌레의 발달 단계에 점수를 매깁니다. 강력한 효과는 일반적으로 3일과 4일째에 나타납니다.
실험은 약 일주일 동안 지속되어야 합니다. 이 프로토콜의 경우 전날 이전에 설명한 대로 약물 테스트 플레이트를 준비하고 분석을 시작합니다. 실험에서 각 유전자형에 대해 50L의 4단계 동물을 선택합니다.
NGM 플레이트로 옮기고 섭씨 20도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음날, 15분에서 20분마다 한 그룹이 30분 동안 약물에 노출된 후 10마리의 동물과 함께 테스트를 잘 로드합니다. 해부 현미경으로 아기의 인두 펌프를 관찰하기 시작합니다.
먼저 벌레를 찾은 다음 20초 동안 인두 펌프를 세십시오. 득점이 나오면 접시에서 벌레를 집어냅니다. 같은 방법으로 우물에 있는 모든 벌레에 점수를 매깁니다.
실험 지연을 수행한 예상 결과입니다. 야생형 대조군을 사용한 치사율 분석은 무덤까지의 일반적인 성장률과 달리 성체 단계, c 클로자핀에 노출된 동물이 아직 어린 애벌레 단계에 있거나 다른 클로자핀 농도에서 돌연변이를 테스트한 결과 음소거 1과 같은 억제 돌연변이와 MU 2와 같은 인핸서 돌연변이가 밝혀졌다는 것을 보여주어야 합니다. 보편적으로 벙어리 1의 치사율은 야생형보다 낮았으며, MU 2의 치사율은 벙어리 1 생존 동물이 더 발달할 수 있는 대조군에 비해 예상대로 높았던 반면, 벙어리 2 생존자는 더 지연되었다.
추가 검사에서 클로자핀 노출은 농도 의존적 방식으로 인두 펌핑 속도를 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 음소거 1의 감소율은 야생형보다 낮았고, 음소거 2의 감소율은 야생형보다 컸다. 이 비디오를 시청한 후에는 소규모로 항정신병 약물 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
또한 이 메시지를 확장하여 대규모 유전자 스크리닝을 수행할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 Caenorhabditis elegans에서 항정신병 약물(APDs)의 효과를 테스트하기 위한 접근법을 보여줍니다. 해당 방법에는 발달, 생존력 및 인두 펌핑 속도에 미치는 약물 효과를 평가하기 위한 분석법이 포함됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 약리학
- 발생생물학
배경
- Caenorhabditis elegans는 약물 효과를 연구하는 데 사용되는 모델 생물입니다.
- 항정신병 약물은 발달 과정에 영향을 줄 수 있습니다.
- 인두 펌핑은 약물 영향을 평가하는 데 중요한 행동입니다.
- 이러한 방법을 통해 약물유전학 실험을 수행할 수 있습니다.
연구 목적
- 항정신병 약물이 선충의 발달에 미치는 영향을 조사합니다.
- 이러한 약물들이 인두 펌핑 속도에 미치는 영향을 평가합니다.
- 항정신병 약물(APD)의 작용 기전에 대한 통찰을 제공합니다.
사용된 방법
- 성체 Caenorhabditis elegans 개체군을 배양합니다.
- 성체 선충으로부터 동기화된 개체군을 생성합니다.
- 동기화된 알 또는 성체를 약물이 처리된 분석 플레이트로 옮깁니다.
- 약물이 발달 및 행동에 미치는 영향을 관찰하고 점수를 매깁니다.
주요 결과
- 항정신병 약물은 노출된 선충의 발달을 지연시킵니다.
- 약물 처리된 동물에서는 인두 펌핑이 억제됩니다.
- 결과는 약물 기전에 대한 이해에 도움을 줄 수 있습니다.
- 해당 방법은 다른 저분자 및 고분자 화합물에도 적용 가능합니다.
결론
- 본 연구는 C. elegans에서 약물 효과를 테스트하기 위한 프레임워크를 제공합니다.
- 이를 통해 얻은 인사이트는 다양한 약리학적 연구로 확장될 수 있습니다.
- 이 방법들은 APD 이외의 더 광범위한 응용 분야에 맞게 조정될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 개요
C. elegans를 이용한 항정신병 약물 기전 연구는 표현형 결과와 신경 분자 경로를 연결함으로써 초기 단계의 타겟 위험 제거(de-risking)를 가능하게 합니다. 발달 및 인두 펌핑 분석은 신약 발굴 생물학에서 작용 기전을 조사하기 위한 정량적이고 확장 가능한 판독값을 제공합니다. 이는 신경정신과적 적응증에 대한 타겟 검증 및 포트폴리오 우선순위 선정의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 항정신병 약물 노출을 발달 지연 및 인두 억제 표현형과 연결함으로써 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: 약물 반응의 조절 인자를 식별하는 유전적 억제제 및 강화제 스크리닝을 통해 기능적 표적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 보존된 신경근 출력에 미치는 농도 의존적 영향을 밝힘으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 동기화된 배아 및 단계별 성체 준비 워크플로우를 통해 하위 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 운영적 가치: 일일 발달 점수 측정 및 20초간의 인두 펌프 횟수 측정 프로토콜을 통해 분석 표준화를 해결합니다.
- 확장성 가치: 항정신병 약물 이외의 저분자 및 고분자 화합물 테스트를 위한 스크리닝 준비도와 플랫폼 재사용성을 강조합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 가치: C. elegans 게놈 내의 보존된 신경전달물질 합성 및 시냅스 기능 유전자를 통해 질환과의 관련성을 논의합니다.
- 전임상 연속성: 전신 유기체 질환 관련 시스템에서의 표현형 검증을 통해 발견부터 검증까지의 연속성을 설명합니다.
- 위험 조정 추진: 발달 치사율 및 펌핑 속도 억제를 효능 바이오마커로 사용하여 기전 기반의 진행/중단(go/no-go) 결정을 다룹니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 조기 발견 단계부터 리드 물질 확인 단계까지 항정신병 기전 연구를 배치하여, 신경약리학의 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 발견 생물학: 발달 단계 설정 및 인두 펌핑 정량화를 통해 이 방법이 어떻게 가설 검정을 지원하는지 설명합니다.
- 스크리닝: 약물이 포함된 플레이트로의 동기화된 알 전이와 매일 수행되는 표현형 점수화를 통해 분석 준비 과정을 기술합니다.
- 분석: 조건 간 비교를 위한 발달 단계 점수 및 단위 시간당 인두 펌핑 횟수를 포함한 정량적 결과물을 강조합니다.
- 중개 연구: 약물 기전을 예측하는 보존된 신경근 표현형을 통해 이 방법과 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 유전적 및 화학적 스크리닝을 이용하여 다양한 치료 영역에서 작용 기전 연구에 재사용 가능한 역량으로 이 방법을 정의합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 항정신병 효과를 신경근 기능에 표현형적으로 연결함으로써 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 높임.
- 운영적 가치: 동기화된 집단과 발달 및 행동에 대한 정의된 점수 산정 간격을 통해 표준화 및 재현성을 확보함.
- 전략적 가치: 초기 항정신병제 스크리닝의 기전적 모호성을 줄여 더 나은 go/no-go 결정을 내릴 수 있음.
- 포트폴리오 영향: 발달 지연과 인두 억제를 전이 가능한 바이오마커 엔드포인트로 사용하여 위험 조정 우선순위를 설정함.
구현 시 고려 사항
- 선충 배양, 동기화 및 해부 현미경 하에서의 표현형 점수 측정에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 필요 장비로는 인큐베이터, 현미경, 12-웰 플레이트 분석용 약물 분주 시스템이 포함됩니다.
- 팀 간 표준화를 위해 난자 준비, 약물 플레이팅 및 발달 단계 기준에 대한 공통 프로토콜이 필요합니다.
- 모델 시스템 간의 적응 고려 사항으로는 신경전달물질 표적의 보존 및 고처리량 포맷을 위한 분석 규모 조정이 포함됩니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 약 1주일의 분석 기간과 선충의 건강에 영향을 미치는 박테리아 론(lawn) 품질에 대한 민감도가 있습니다.
