면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

다음 실험의 전반적인 목표는 방광암에서 종양 관련 항원을 표적으로 하는 세포독성 T 림프구 반응을 효과적으로 유도하는 것입니다. 이는 인간 종양 관련 항원 마하 1을 발현하는 마우스에서 방광암을 유발함으로써 달성됩니다. 다음으로, 펩타이드 백신을 마우스에 주입하고 마하 1 특정 세포독성 T 림프구 반응을 생성합니다.

그런 다음 혈청 종양과 비장을 분리하고 조직을 분석하여 각각 사이토카인, 항원 및 면역 반응을 확인합니다. 웨스턴 블롯 멀티플렉스, 플루오로 메트릭 마이크로비드, 면역분석 면역조직화학 및 라이브 스팟 분석을 활용하여 방광암에 대한 펩타이드 백신의 효능을 테스트할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아주 새크라멘토에 있는 캘리포니아 대학교 데이비스 보건 시스템의 연구 과학자인 그레고리 웨츠 박사입니다.

이종이식편과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 이종이식편에는 면역이 저하된 숙주가 필요한 반면, 당사 모델은 펩타이드 백신의 표적인 인간 종양 관련 항원을 발현하는 면역 온전한 형질전환 마우스를 사용한다는 것입니다. 저와 함께 이 기술을 시연할 사람은 모두 동료 연구 과학자인 Daniel V와 Dr. Chaga와 Audrey Gutierrez, 그리고 Dr. Michael de Gregorio의 실험실과 UC Davis Health System입니다. 방광암을 유발하기 위해 N 부틸, N 4 히드록시, 부틸 니트로사민 또는 O-H-B-B-N의 첫 번째 용량을 투여하기 전에 각 마우스에 대해 턱밑 출혈을 수행하여 전혈 및 혈액 응고 튜브를 채취하고 혈액이 응고될 때까지 30분 동안 기다립니다.

스테인리스 스틸 20게이지 간침을 사용하여 8주부터 시작하여 12주 동안 주 5일 동안 O-H-V-B-N을 경구 투여합니다. 20주차에 0.9% 멸균 식염수 600마이크로리터를 사용하여 동결건조 펩타이드 백신의 각 바이알을 재구성하고 식염수를 사용하여 0.5인치 27게이지 바늘을 통해 용액을 6회 당겨 완전히 재현탁합니다. O-H-B-B-N의 마지막 투여 후 100마이크로리터의 부피로 원하는 용량이 전달되도록 농도를 조정하고 O-H-B-B-N의 마지막 투여 후 8주 후에 25게이지 바늘을 사용하여 100마이크로리터의 백신을 주입하여 8주 주기로 매주 백신을 투여합니다.

이산화탄소 질식으로 모든 쥐를 안락사시킨 후 각 쥐를 해부 보드에 놓고 네 팔다리를 모두 고정합니다. 그런 다음 집게와 가위를 사용하여 상복부 부위를 수평 절개합니다. 표피층과 복벽 사이의 절개 부위에 가위를 삽입하고 집게를 사용하여 아래 조직에서 피부를 부드럽게 분리합니다.

수평 절개에서 중간 축을 따라 마우스의 앞쪽 끝을 향해 수직 절개를 만듭니다. 그런 다음 흉곽에서 피부를 분리하고 1밀리리터 주사기와 22게이지 바늘을 사용하여 심장에 구멍을 뚫고 집게와 가위를 사용하여 부드럽고 꾸준한 채혈로 혈액을 채취합니다. 생물 안전 캐비닛 내부의 나머지 표피층을 잘라내고 벗겨냅니다.

복벽과 복막을 뚫고 무균으로 절단합니다. 면역조직화학을 위해 방광 종양을 제거하거나 IHC를 위해 IHC 및 웨스턴 블롯을 제거합니다. 방광 종양 표본을 조직 카세트에 넣고 식힌 포민으로 밤새 고정합니다.

실온에서 세포 생존율 분석을 위해 비장을 채취하고 다중 형광 메트릭 미생물 면역분석을 수행하기 위한 거짓말 지점을 수집합니다. 200마이크로리터의 분석 버퍼를 사용하여 사전 습윤합니다. 96웰 필터 바닥판으로 필터가 완전히 스며들 수 있습니다.

그런 다음 96웰 플레이트 진공 장치를 사용하여 필터를 부드럽게 배수하고 종이 타월을 사용하여 플레이트 바닥을 건조시킵니다.멀티채널 피펫 25마이크로리터의 혈청 매트릭스를 블랭크 및 표준물질에 할당된 웰에 넣고 25마이크로리터의 분석 버퍼를 대조군 및 미지 물질에 할당된 웰에 피펫으로 넣습니다. 다음 피펫 25 마이크로 리터의 빈 표준, 제어 및 미지수를 각각 할당 된 우물에 넣습니다. 비드 혼합물을 20초 동안 소용돌이치고 비드를 저장소로 옮깁니다.

그런 다음 25 마이크로 리터의 비드를 피펫으로 혼합합니다. 접시를 빛으로부터 보호하기 위해 접시를 잘 덮고 실온에서 2시간 동안 500RPM으로 셰이커로 접시를 흔든 다음 접시를 배수하고 200마이크로리터의 PBST를 사용하여 두 번 씻은 후 배수하고 건조시킵니다. 검출 항체 용액을 준비하려면 필요한 양의 0.1%PBST와 검출 항체를 15ml 튜브에 넣고 10초 동안 와류로 가열합니다.

그런 다음 각각 25 마이크로 리터를 피펫으로 넣으십시오. 실온에서 1시간 동안 500RPM으로 플레이트를 잘 흔듭니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 0.1 % PBST로 플레이트를 두 번 배수하고 닦아 낸 후 건조 피펫 25 마이크로 리터를 갓 준비한 연쇄상 구균, AVID 및 FICO 에린 또는 SAPE를 각각 닦아내고 플레이트 셰이커에 플레이트를 잘 놓고 500 RPM의 실온에서 30 분 동안 배양합니다.

물기를 빼고 PBST로 두 번 세척하십시오. 비드를 매달아 놓으려면 각 웰에 0.1%PBST의 100마이크로리터를 넣고 500RPM으로 최소 2분 동안 흔듭니다. Luminex LX 200 기계를 사용하여 생물 안전 작업대의 플레이트를 판독하고 분석합니다.

100마이크로미터 나일론 조직 체를 통해 마우스의 비장을 멸균 페트리 접시에 담긴 5ml의 멸균 PBS로 가공합니다. PLE aytes를 멸균 15ml 튜브에 있는 3ml의 림프구 분리 배지에 층을 이룹니다. 600GS에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다.

적혈구에서 림프구를 분리하려면 구배 위의 층상 림프구를 1.5ml 스크류 캡 원심분리기 튜브에 있는 새로운 멸균 15ml 튜브로 옮깁니다. countin 생존 시약을 사용하여 림프구를 연속 희석합니다. 그런 다음 뮤즈를 분석합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 플레이트를 준비하고 100마이크로리터의 중간 펩타이드 또는 스크램블 펩타이드를 각각에 피펫으로 주입하여 동맹 스폿 플레이트에 대한 샘플 및 조건의 플레이트 맵을 준비합니다. 글쎄, 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 추가하고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. ALI 스폿 분석에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르고 해부 현미경을 사용하여 개발된 Aly 스폿 플레이트를 분석합니다.

각 웰의 각 분석물에 해당하는 착색된 점의 수를 계산하여 결과를 정량화합니다. 반점은 화학적 발암 물질로 형질전환 마우스 모델 유도에서 각 웰에 있는 반점 형성 세포의 수에 해당합니다. O-H-B-B-N은 이 그림에서 볼 수 있듯이 인간의 방광암과 유사한 일부 편평세포암(SCC)과 함께 주로 이행성 세포암(TCC)의 방광암 발생

O-H-B-B-N 유도 방광암 발생률 8주 후, 마하 1 형질전환 또는 TG 및 야생형 마우스의 방광암 발병률은 67%였으며, 헤마틴과 에오신 염색을 통해 TCC와 SCC의 존재가 확인되었으며, TCC는 2:1의 비율로 우세했습니다. 이 중에서 비침습성 종양과 비침습성 종양이 낮은 등급과 높은 등급의 종양에 이르기까지 다양한 범위를 관찰했습니다. 모든 마하 1 방광암 검체는 IHC에 의한 마하 1 발현에 대해 양성이었습니다.

모델 개발 과정에서 염증성 사이토카인의 혈청 수치를 8주에서 28주 사이에 연속적으로 모니터링했습니다. 우리는 염증성 사이토카인 수치가 유도부터 연구가 끝날 때까지 시간이 지남에 따라 증가하는 것을 관찰했습니다. 이 사이토카인 패턴은 이전에 폐암 모델에서 관찰한 것과 매우 유사하며, 이는 염증성 사이토카인 수치 증가가 종양 발생과 상관관계가 있을 수 있음을 강력하게 시사합니다.

펩타이드 백신에 대한 혈청 사이토카인 반응을 평가하기 위해 백신을 접종한 15마리와 위약 처리된 마하 1 TG 마우스 14마리를 안락사시키고 연구가 끝날 때 혈액을 채취했습니다.마지막 백신 치료 후 24시간. 멀티플렉스 분석에 따르면 백신군에서 TNF, 알파 인터페론, 감마 IL 2, IL 12, IL 17의 혈청 사이토카인 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.

위약군과 비교했을 때, TNF 알파, 인터페론, 감마, IL 17의 수치는 백신을 투여한 마우스에서 유의하게 높았다. 이러한 결과는 펩타이드 백신에 대한 TH 1, TH 2 면역 반응을 평가하기 위해 펩타이드 백신에 대한 TH 1 편광 사이토카인 반응을 시사합니다. SP cyte는 인터페론 감마 IL 4개의 ALI 스폿에 의해 평가되었으며, 여기에 나타난 것은 생존 가능한 림프구가 ALI 스폿 플레이트를 파종한 후 분리된 림프구의 생존율을 평가한 것으로, 본 실험의 결과는 펩타이드에 대한 명확하고 특이적인 인터페론 감마 반응을 보였으며, 이는 펩타이드 백신에 대한 TH one 면역 반응을 확인한 후 개발 후 확인할 수 있다.

이 기술은 암 면역학 분야의 연구자들이 진행성 방광암의 전임상 모델을 활용하여 새로운 면역 요법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.