Name: 면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 배우세요 MUC1 표적 펩타이드 백신을 이용한 방광암 면역요법 모델 구축 방법을. MUC1 유전자 변형 마우스에서 세포독성 T 림프구 반응을 유도하고 면역 반응을 분석하는 기술입니다.

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저자는 쥐를 번식 UC 데이비스 마우스 생물학 프로그램에 감사드립니다. 이 연구는 머크, 독일에서 교부금에 의해 지원되었다.

모든 동물 연구와 실험은 캘리포니아 대학, 데이비스 기관 동물 관리 및 관리 자문위원회를 사용하여 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 1. MUC1.Tg 마우스 사육 및 번식 <ol><li> 이형 MUC1.Tg C57BL / 6 암컷 생쥐와 UC 데이비스 마우스 생물학 프로그램 (MBP)은 품종 야생 유형 C57BL / 6 수컷 생쥐 우리의 사육 식민지를 설정합니다. 필요에 따라 MUC1.Tg 자손이 연구에 전달됩니다. </li><li> MBP 담당자는 마우스 식별을 위해 정의 된 패턴 (99)의 자손의 발가락을 잘라, 그리고 해당되는 경우 클립 꼬리. 발가락이나 꼬리 조직은 표준 DNA 추출 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석을 이용하여 유전자형을 위해 처리됩니다. </li></ol> 2. 연구 설계 <ol><li> 그룹 할당을 연구 <ol><li> 균형에 별도로 각 마우스의 무게를 측정하고 각 마우스 그램의 무게를 기록한다. </li><li> INV 절차의이 부분연구의 방법론과 설계를 olves. 연구의 첫 번째 부분, OH-BBN과 함께 방광 암 유도를 시작하는 나이와 일치 MUC1.Tg와 야생형 생쥐을 지정합니다. 팔주 조직 학적으로 방광 종양의 존재를 확인하는 마지막 OH-BBN 투여 후 쥐를 안락사. </li><li> 연구의 두 번째 부분에 대한 치료 및 제어 그룹의 해당 번호로 남성 MUC1.Tg 쥐를 무작위. 이 생쥐 ~ 8 주 마지막 OH-BBN 투여 후 연구 종료시에는 유도하고 종양 개발하는 동안 혈청 사이토 카인 및 T 세포 면역 반응을 모니터링하고, 될 것입니다. </li></ol></li><li> 방광 암 유도 <ol><li> OH-BBN은 발암 물질과 독성이 높은 것입니다. 이 화학 물질을 취급 및 보관시 물질 안전 보건 자료의 지침을 읽고 따르십시오. </li><li> 평균 무게와 numbe를 기준으로 각 마우스에 100 μL의 볼륨에서 적절한 용량 (3 MG)를 제공하는 데 필요한 투여 용액의 농도를 계산각 연구 및 그룹의 생쥐의 연구. </li><li> 100 % 에탄올에 OH-BBN을 희석. 최종 농도 30 멸균 물 MG / ML을 가져옵니다. 최종 에탄올 : 물 농도 20:80 있어야한다, V / V </li><li> 팔주 세의 나이에 시작하는 치료 그룹 할당에 따라 스테인리스, 매일 20 G 투여 바늘 5 일 / 12 주 동안 일주일을 사용하여 OH-BBN 구두를 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol></li><li> 예방 접종 트리트먼트 <ol><li> 0.9 % 멸균 생리 식염수 600 μL에 철저하게 0.5 인치 27 G 바늘 배를 통해 솔루션을 그려 resuspend을 동결 건조 된 펩타이드 백신의 재구성 각각의 병. 원하는 용량을 100 μL의 볼륨 전달되도록 생리 식염수 사용하여 농도를 조정합니다. </li><li> OH-BBN의 마지막 투여 후 25 G 바늘 (주 번호가 마우스의 연령에 해당)를 사용하여 100 μL의 피하 주사로 8 주주기 매주 백신 관리, 주 20 년부터. </li></ol></li><li> 모니터링 및 시료 채취 <ol><li> 모든 마우스의 무게를 각각 일주일에 한 번 새로운 종양의 존재를 만져. 만져서 알 수있는 종양, 소변에 혈액, 및 / 또는 요폐가있는 경우 또는 체중 ≥ 20 %를 잃은 모든 쥐를 안락사. </li><li> 다음 첫 번째 OH-BBN 투여하기 전에 4 주 간격으로 그 이후, 턱밑 출혈을 통해 전체 혈액을 수집합니다. 혈청 응고 튜브 (BD Microtainer)에서 혈액을 수집하고, 응고 혈액 30 분을 허용합니다. </li><li> 10 분 3,500 XG에서의 microcentrifuge에서 혈액 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 피펫을 사용하여 캡 cryotubes을 망칠 혈청을 전송합니다. </li><li> -80에서 액체 질소와 저장소에 플래시 동결 ° C 다중으로 추가 분석까지. </li><li> 팔주 OH-BBN의 마지막 투여 후, CO 2 질식하여 모든 쥐를 안락사. </li><li> 해부 보드에 각 마우스를 놓고 사지 모두에 의해 아래로 핀. </li><li> 엄마는 집게와 가위를 사용하여애 상단 복부에 수평 절개. 표피 층과 복벽 사이의 절개로 가위를 넣고 부드럽게 포셉의 도움으로 기본 조직으로부터 피부를 분리합니다. </li><li> 마우스의 앞쪽 끝 부분의 중앙 축을 따라 수평 절개에서 수직으로 절개를합니다. 흉곽으로부터 피부를 분리하고 1 ML의 주사기와 22 G 바늘 구멍을 뚫거나 마음과 원활하고 안정적​​인 무승부로 혈액을 수집를 사용하여. </li><li> 혈청 분리 및 저장을위한 2.4.3 및 2.4.4 단계를 참조하십시오. </li><li> 집게와 가위, 절단 다시 껍질 표피 층의 나머지 부분을 사용. 복벽과 복막의 실수로 무균 면역 (IHC)과 서양 얼룩에 대한 방광 종양을 제거합니다. </li><li> 세포 생존 능력 분석 (뮤즈)와 ELISPOT에 대한 비장를 수집합니다. IHC 장소 방광 종양 조직 카세트의 시편 실온에서 식힌 포르말린 하룻밤에 고정합니다. </lI&gt; <li> 다음 날, 70 % 에탄올로 포르말린을 대체합니다. </li><li> 종양의 서양 얼룩 분석, 종양을 균질화 단백질 추출 버퍼 플러스 정지 프로테아제 억제제를 추가하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 30 ~ 60 초 동안 소용돌이 5 분 동안 얼음십시오. 플래시가 주위의 물에 액체 질소와 해동에서 냉동. , 소용돌이로 동결 번 해동의 과정을 반복합니다. </li><li> 4 10 분 ° C 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리하고 새 레이블 튜브에 세포 추출물을 전송합니다. </li><li> 단백질 측정을위한 Bicinchoninic 산성 단백질 분석 (BCA)를 수행하여 농도를 정량화. 매장 샘플 서양 얼룩 분석 -80 ° C까지 준비. </li></ol></li></ol> 3. 분자 생물학 / 양식 다음 절차는 표준 서쪽 오점 프로토콜을 사용하여 마우스 방광 종양 조직에서 MUC1의 발현을 확인 하였다 (자료는 표시되지N). <ol><li> semidry 장치를 이용하여 PVDF 막에 전송 한 후 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 단백질 추출물을 분리합니다. </li><li> 0.1 %에서 5 % 탈지 우유 단백질 전송 멤브레인을 차단 인산염의 트윈-20은 상온에서 궤도 셰이커에 1 시간 동안 식염수 (PBS-T) 산도 7.4 버퍼. </li><li> 0.1 % PBS-T의 반대로 MUC1 또는 반대로 β-액틴 항체 통에 실온에서 1 시간 동안 막 품어. </li><li> 솔루션을 이동시키기 0.1 % PBS-T를 추가하여 막 씻으십시오. 5 분간 가만히 따르다에 대한 통에 소용돌이 막. 이 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 말 무 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 복합 이차 항체로 실온에서 1 시간 동안 막 품어. </li><li> 배를 (3.4 단계를 참조하십시오) 씻으십시오. </li><li> fluorography을 활성화하고 읽을 수있는 확장 Chemiluminesence (ECL) 키트에 대한 프로토콜을 따르십시오. </li></ol> 4. 다중 형광 마이크로 비드의 면역 &lt;OL&gt; <li> 설치 및 계산 <ol><li> 96 - 웰 플레이트지도를 사용하여, 우물 공백, 표준, 컨트롤, 미지수를 지정합니다. 수와 분석의 볼륨을 계산 항체를 캡처하고 스트렙 타비 딘 - 가하고 (SA-PE)는 분석에 필요한. </li><li> 모든 버퍼 희석제가 실내 온도에 평형 수 있습니다. 빈 96 - 웰 플레이트를 사용하여 표준 시료 희석을 준비합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜과 96 - 웰 플레이트에 적절한 희석제와 표준 1시 5분 시리얼 희석을 따라 혈청 매트릭스와 동결 건조 된 표준 재구성. 빈 우물은 해당 희석제를 사용합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 나머지 부분에서 적절한 희석제의 모든 컨트롤과 미지 시료 1:2 희석. </li><li> 비드 혼합의 경우, 15 ML 튜브에 적절한 희석제의 필요한 볼륨을 피펫. 20 초 피펫 15 ML 튜브에 각 분석의 필요한 볼륨의 소용돌이 각 비드 병을. </lI&gt; <li> 항상 photobleaching에 방지하기 위해 빛의 구슬을 보호합니다. 위킹을 통해 시료의 손실을 방지하기 위해 흡수제 96 - 웰 플레이트를 올려 놓지 마십시오. </li></ol></li><li> 분석 프로토콜 <ol><li> 분석 버퍼 200 μL와 96 - 웰 필터 바닥 판을 Prewet 및 필터의 완전한 몸을 담글 수 있도록. 조심스럽게 96 - 웰 플레이트 진공 장치를 이용하여 배수 및 종이 타월로 접시의 바닥을 건조 얼룩. </li><li> 멀티 채널 피펫, 공백 및 표준 컨트롤과 미지에 할당 된 우물 분석 버퍼의 피펫 25 μL에 할당 된 우물에 혈청 행렬의 피펫 25 μl를 사용. </li><li> 피펫 25 빈 μL, 표준, 컨트롤 및 해당 할당 우물에 미지수. 소용돌이는 구슬을 20 초 동안 혼합 및 저수지에 구슬을 전송합니다. </li><li> 각 우물에 구슬 믹스의 피펫 25 μL. 알루미늄 호일이나 빛으로부터 보호하기 위해 불투명 플레이트 뚜껑 접시를 커버. </li><l난&gt; 접시 흔드는에 상온에서 2 시간 동안 500 rpm에서 판을 흔들어. 배수와 0.1 %의 200 μL 인산염의 트윈 20과 함께 접시를 씻어 두 번 (PBS-T) 염분 버퍼. 배수하고 건조 얼룩. </li><li> 캡처 항체 솔루션을 준비합니다. 0.1 % PBS-T의 필요한 양을 피펫 10 초 동안 15 ML 튜브와 소용돌이에 항체를 캡처합니다. 각 우물에 저수지와 피펫 25 μL로 캡처 항체 믹스를 전송합니다. </li><li> 접시 통에 상온에서 한 시간 동안 500 rpm에서 판을 흔들어. 두 번 배수 0.1 % PBS-T 200 μL와 접시를 씻으십시오. 배수하고 건조 얼룩. </li><li> SA-PE 솔루션을 준비합니다. 15 ML 튜브 10 초 동안 소용돌이로 0.1 % PBS-T와 SA-PE의 필요한 볼륨을 피펫. 각 우물에 저수지와 피펫 25 μL에 대한 해결책을 전송합니다. </li><li> 접시 통에 실온에서 30 분 동안 500 rpm에서 판을 흔들어. 두 번 배수 0.1 % PBS-T 200 μL와 접시를 씻으십시오. 배수와 b많이 건조. </li><li> 피펫 100 0.1 % PBS-T의 μL와 구슬을 resuspend을 적어도 2 분 동안 500 rpm에서 접시 뿌리를 흔들어. Luminex의 LX200 기계에 접시를 읽고 분석합니다. </li></ol></li></ol> 5. IFN-γ/IL-4 ELISPOT 준비 및 분석 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에 100 μm의 나일론 조직을 통해 비장을 처리 5 ML 멸균 인산에 체 식염수 (PBS)는 멸균 페트리 접시에 버퍼. 멸균 15 ML 튜브 림프구 분리 매체의 3 ML 위에 레이어 비장합니다. </li><li> 붉은 혈액 세포에서 림프구를 분리하는 15 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기. 새로운 멸균 15 ML 튜브에 그라데이션 위의 계층 림프구를 전송합니다. </li><li> 멸균 PBS 10 ML에 볼륨을 조정합니다. 펠렛 세포에 10 분 600 XG에 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 기음과 세포 생존을위한 PBS 1 ML에있는 세포를 resuspend을하고 뮤즈로 계산분석기. 뮤즈 횟수 및 생존 키트 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 1.5 ML 나사 캡 원심 분리기 1:10의 희석 요인 튜브, 1:20 및 횟수 및 생존 시약 (최소 총 부피 300 μL)의 1시 40분 (또는 필요)에서 림프구의 시리얼 희석하십시오. 뮤즈에 혼합하고 분석 할 여러 번 각 희석을 피펫 아래. </li><li> ELISPOT 플레이트 샘플 및 조건의 플레이트지도를 준비합니다. 제조 업체의 프로토콜과 매체의 피펫 100 μL, 펩타이드 (10 ㎍ / ㎖) 또는 스크램블 각 웰에 펩타이드 (10 ㎍ / ㎖)에 따라 ELISPOT 플레이트를 준비합니다. </li><li> 물론 각각 1.0 × 10 6 세포를 제공하고 37 ° C에서 하룻밤 번호판을 품어 세포 현탁액의 피펫 100 μL. </li><li> ELISPOT 분석에 대한 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 해부 현미경을 사용하여 개발 ELISPOT 플레이트를 분석합니다. </li><li> 색 반점의 수를 대응되는 수를 계산하여 결과를 정량화각 우물에서 각 분석에 NG. 반점은 각 우물에 자리 형성 세포의 수 (SFC)에 해당합니다. </li></ol> 6. 면역 조직 화학 (IHC) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 <ol><li> 면역 조직 화학 분석을위한 4 μm의에서 파라핀과 단계 섹션에 포함 위에서 설명한대로 보존 방광 종양 조직 (제 2.4.11)를 가져 가라. </li><li> MUC1의 탠덤 반복 영역을 인식 MUC1 항체를 사용하여 IHC를 수행합니다. 조직에 존재하는 내인성 면역 글로불린과 보조 마우스 항체 반응을 최소화하기 위해 동물 연구 키트 과산화 효소를 사용합니다. </li><li> 표준 프로토콜을 사용하여 H &amp; E 염색을 수행합니다. </li></ol> 7. 통계적 방법 다중 형광 마이크로 비드의 면역을 위해, 평균 치료 및 제어 그룹 간의 혈청 사이토 카인 농도를 관찰 비교하는 두 꼬리 학생의 T - 테스트를 사용합니다. ELISPOT를 들어, 한-W를 사용미디어 컨트롤 사이에 식민지를 형성하는 자리를 비교하는 AY ANOVA는 펩타이드 펩타이드 그룹을 스크램블. 위양성 결과의 가능성을 줄이기 위해 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용합니다. ≤ 0.05의 P-값은 모든 분석을위한 유의 한 차이로 간주됩니다.

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</ol>

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, 그리고 GKH은 경쟁 이익을 선언하지 않습니다. MWD는 머크로부터받은 보조금의 수사 반장, 그리고 MW는 머크의 직원입니다.

인간 MUC1.Tg 마우스의 침략 이행 및 편평 세포 방광 암의 성공적인 유도 면역 요법 개발을위한 전임상 모델을 제공합니다. Immunotherapeutic 연구는 시간뿐만 아니라 면역에 대한 면역 반응을 통해 종양의 진행에 염증 반응을 평가하기 위해 자연 면역 손상 모델의 사용을 필요로합니다. 자연 종양 개발 모델에서 종양 미세 환경은 그대로 남아 있고 종양 치료의 항암 효과의 평가를 위해 수 많은 대표 성장률 개발할 수 있습니다. 또한, 면역 시스템은 치료 효과의 평가를 허용, 생체를 측정하고 모니터링 할 수 있습니다. 면역 테스트를위한 문헌에서 설명하는 다른 종양 베어링 마우스 모델은 이종 이식 모델과 이식 모델을 모두 있습니다. 이 모델은 편리하고 광범위하게 암 연구에 고용되어 있지만은,immunotherapeutic 연구를 수행 할 때 고려해야 할 중요한 제한 사항은 여러 가지가있을 수 있습니다. 이종 이식이나 이식 종양도 저절로 개발, 그들은 종양이 원래 파생 된...

방광 암은 암의 네 번째 가장 일반적인 형태 및 미국 남성의 암 사망의 여덟 번째 주요 원인이다. 미국에서 방광암에서 약 72,500 새로운 케이스 및 15,000의 죽음 2013 년 1 결합 된 남자와 여자 사이 예상된다. 방광 암의 발생률은 여성에 비해 약 3 배 남자 높은 것입니다. 케이스의 90 % 이상을 미국, 이행 세포 암 (TCC)는 계정 편평 세포 암종 (SCC)이 2 % 미만 2 발병률을 가지고있는 동안. 유두 TCC에 대한 전반적인 상대적으로 5 년 생존율은 SCC 2 만 30.9 %에 비해 91.5 %입니다. 비침 유두 TCCS도 환자의 50 % 이상 치료를 더 근육 침략 질병에 3,4로 진행이 환자의 30 %까지로 5 년 내에 재발을 경험하게 될 것입니다와 함께, 진단시에 케이스의 약 75 %를 차지하고 있지만, . 비 근육 인보이스에 대한 일반적인 치료 요법asive 질병은 방광 화학 요법에 이어 요도 절제술 (TUR) 이용하실 수 있습니다. 고급 따 또는 T1 종양 환자에서 반복 TUR 화학 요법 3,4하기 전에 수행 할 수 있습니다. 낮은 수준의 따 재발 또는 고급 따 또는 T1 병변을 가진 환자의 경우, TUR는 Calmette-Guerin의이 (BCG) 3,4 사용할 수 있습니다 간균의 형태로 보조 화학 요법 또는 면역 요법에 의해 따랐다. 방광 BCG는 재발 5 시간에 대하여 방광 마이 토마 이신 C를 우수한 것으로 표시되었습니다. T2 근육 침략 질환, 선행 항암 화학 요법의 유무에 관계없이 급진적 인 방광 치료 3의 권장 코스입니다. SCC 환자에서, 급진적 인 방광이 가장 효과적인 치료 6 것으로 보인다. 최선의 치료를 제공에도 불구하고 재발의 매우 높은 비율을 감안할 때, 방광 암에 대한 새로운, 더 효과적인 치료법에 대한 필요성은 분명히있다. bladd에 대한 새로운 면역을 확대어 암 무병 생존을 확장하기위한 약속을 보유 할 수있는 한 가지 방법입니다. 역사적으로, BCG 방광 암에 대한 유일한 효과적인 면역 요법이다. 행동의 메커니즘은 증가 인터루킨-2 수준 (IL-2)와 인터페론 감마 (IFN-γ) 4를 통해 T-도우미 1 (살전) 형 면역 반응의 특이성 유도를 포함하는 것으로 생각됩니다. 휴대 전화, 또는 살전 면역, 체액, 또는 Th2 사이토으로 암 면역 요법의 중요한 면역는 성장 인자 수용체 7에 대한 감독 항체를 제외하고, 단단한 종양에 대한 효과적인 것으로 표시 적이있다. BCG 단독 요법의 이점을 개선하기위한 시도에서, IFN-α 2B/BCG 조합 면역 요법은 결정적 결과를 8 단계 II 임상 시험에서 평가되었다. 방광 암에 대한 면역 요법에 대한 대안 7 암 면역 요법보다 구체적인 만든 식별 어느 종양 관련 항원 (TAAS)을 대상으로 할 수 있습니다 </s&gt;까지. 하나의 TAA는 방광, 유방, 폐, 췌장 암 9,10 많은 상피 세포 암에서 과발현 세포 표면 당 단백질 점액 1 (MUC1)입니다. MUC1의 발현 및 수정도 크게 발암 중에 변경되는 등 그 underglycosylation는 펩타이드 코어 탠덤 반복의 변수 번호 (VNTR)로 알려진 아미노산의 항원 시퀀스를 노출합니다. MUC1은 자기 분자 있지만, 이러한 immunodominant VNTR 영역은 일반적으로 인해 광범위한 당화에 노출되지 않으며, 따라서 그들은 외국 11,12으로 면역 시스템에 의해 볼 수 있습니다. 특히 MUC1 항원을 인식 세포 독성 T 림프구 (CTL을)를 MUC1에 대한 잠재적 인 대상 만들기, 유방암 환자의 13뿐만 아니라, 골수종 환자 14,15의 혈액과 골수의 종양 림프절에서 분리 된 세포 면역 반응. underglycosylate의 immunodominant VNTRsMUC1 d의 형식은 16-19 종양 세포의 파괴의 결과로, CTL을에 의해 인식됩니다. 암 MUC1에 기본 세포 및 / 또는 체액 성 면역 반응은, 그러나, 종양을 제거 할 수있을만큼 강력하지 않습니다. MUC1에 대한 기존의 약한 면역 반응을 증가시키기 위해, 합성 immunodominant 펩티드는 임상 이득 18,20 될 정도로 강한 CTL 반응을 생성하기 위해 예방 접종을 도입 할 수 있습니다. MUC1 리포솜 백신은 이미 폐암 환자 21,22 생존을 증가 MUC1 양성 종양 세포를 죽이는 능력이 CTL을 생성하고, 살전 편광 사이토 카인 반응 23,24을 생산하기 위해 표시되었습니다. MUC1 표현 9,11,25의 높은 수준, 방광 암은 MUC1-감독 면역 26,27 테스트를위한 논리적 인 후보이다. 또한, MUC1 암 28, TCC에있는 MUC1 발현이 크게 무대와 등급과 연관되어 방광의 예후 인자로 잠재력을 가지고, 그리고 전이성 TCCMUC1 29 표현을 계속 보여왔다. 방광 암 MUC1 - 감독 면역 요법의 잠재력 유틸리티를 평가하기 위해, 우리는 면역 그대로 사람 MUC1 (hMUC1) 표현 6 / C57BL 배경 30 방광암 congenic의 형질 전환 (MUC1.Tg) 마우스 모델을 개발했다. 사람 MUC1은 인간 30,31에서 관찰과 일관성 조직의 발현 양상의 결과로 자신의 발기인의 통제하에 자체 단백질로 표현됩니다. 생쥐는 다음 알려진 방광 발암 물질 N-부틸-N-(4 - 히드 록시 부틸) 니트로사민 (OH-BBN) 32, 그 결과 종양이 hMUC1 표현과 종양의 종류와 등급을 평가 하였다 함께 유도 하였다. 종양의 개발 과정에서 Th1/Th2 사이토 카인 수준에 대한 발암 물질의 효과를 평가하기 위해 혈청 샘플은 멀티 플렉스 분석을 위해 주기적으로 수집되었다. 마우스는 다음 MUC1 표적 펩타이드 백신을 취급하고, 혈청 사이토 카인 면역 반응은 evalua 있었다되었다다중 형광 마이크로 비드 면역와 ELISPOT에 의한 테드.

<table><tbody><tr><td><강한>시약&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-니트로사민(OH-BBN)</td><td>TCI America</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>20 g Gavage Needles</td><td>Popper Sons, Inc.</td><td>7921</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>펩타이드 백신</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>조사제</td></tr><tr><td>BD Microtainers</td><td>BD</td><td>365957</td><td></td></tr><tr><td>조직 카세트</td><td>Simport</td><td>M490-12</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>용해 버퍼</td><td>피어싱</td><td>87787</td><td></td></tr><tr><td>중단 프로테아제 & 포스파타제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Scientific</td><td>78444</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>마우스 사이토카인 20plex 키트</td><td>Invitrogen</td><td>LMC006</td><td></td></tr><tr><td>자기 마이크로스피어 비드</td><td>Luminex</td><td>MC100xx-01</td><td>xx는 비드</td></tr><tr><td></td><td></td><td>551225</td><td></td></tr><tr><td>영역입니다.안티 마우스 TNF- 검출 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>554415</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IFN- 캡처 항체</td><td>Abcam</td><td>ab10742</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IFN- 검출 항체</td><td>Abcam</td><td>ab83136</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>분석 버퍼</td><td>Millipore</td><td>L-MAB</td><td></td></tr><tr><td>사이토 카인 표준</td><td>Millipore</td><td>MXM8070</td><td></td></tr><tr><td>멀티 스크린 HTS 96well 필터 플레이트</td><td>Millipore</td><td>MSBVN1210</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Invitrogen</td><td>SA10044</td><td></td></tr><tr><td>100 m 나일론 조직 체</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>비장 세포 분리 매체</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td></td></tr><tr><td>TNF- / IL-4 ELISpot 플레이트</td><td>R& D Systems</td><td>ELD5217</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-MUC1 단클론 항체</td><td>Epitomics</td><td>2900-1</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-actin monoclonal 항체</td><td>Sigma</td><td>A1978</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit HRP 항체</td><td>Promega</td><td>W401B</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-mouse HRP 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>BioRad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean TGX 프리캐스트 겔</td><td>BioRad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Muse Count & 생존력 키트</td><td>Millipore</td><td>MCH100104</td><td></td></tr><tr><td>MUC1 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>550486</td><td>IHC 항체</td></tr><tr><td>Animal Research Peroxidase Kit</td><td>Dako</td><td>K3954</td><td>IHC staining</td></tr><tr><td>Equipment and Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore plate vaccum apparatus</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Luminex Lx200</td><td>Millipore / Luminex</td><td>40-013</td><td>Luminex에서 제조, Millipore</td></tr><tr><td>Luminex Xponent Software</td>에서 배포 <td>Millipore / Luminex</td><td>N/A</td><td>버전 3.1; Luminex Lx200</td></tr><tr><td>Milliple Analyst Software</td>에 포함 <td>Milliplex / VigeneTech</td><td>40-086</td><td>버전 5.1</td></tr><tr><td>Muse 세포 분석기</td><td>Millipore</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>Muse 소프트웨어</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td>버전 1.1.0.0; 분석기에 포함됨</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Unitron</td><td>Z730</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Software</td><td>Graphpad Software Inc.</td><td>N/A</td><td>버전 5.1</td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus</td><td>BioRad</td><td>165-8001</td><td></td></tr><tr><td>트랜스 블롯 SD 셀 및 PowerPac</td><td>BioRad</td><td>170-3849</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 본래대로 사람 muc1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

침입 방광 암의 임상 모델은 인간의 점액 1 (MUC1) 면역 요법 및 / 또는 세포 독성 화학 요법을 평가하기위한 목적으로 유전자 변형 (MUC1.Tg) 생쥐에서 개발되었다. 방광 암, C57BL / 6 마​​우스 (MUC1.Tg 및 야생 유형)이 3.0 ㎎ / 하루에 발암 물질 N-부틸-N-(4 - 히드 록시 부틸) 니트로사민 (OH-BBN)와 경구 치료했다 5 일 / 주를 유발하는 12 주 동안. 종양 개발하는 동안 혈청 사이토 카인 프로필에 OH-BBN의 효과를 평가하기 위해 전체 혈액 턱밑 치료 이전에 출혈과 4 주마다를 통해 수집되었다. 또한, MUC1 표적 펩타이드 백신과 위약을 8 주 동안 매주 쥐 그룹에 투여 하였다. 종양의 개발과 백신 접종시 혈청 사이토 카인의 다중 형광 마이크로 비드의 immunoanalyses을 수행 하였다. 종료시, 인터페론 감마 (IFN-γ) / MUC1 특정 T 세포 면역 반응과 종양 유형의 조직 병리학 적 평가를위한 인터루킨-4 (IL-4) ELISPOT 분석및 등급을 수행 하였다. 결과를 보여 주었다 (1) MUC1.Tg 야생 양 식 생쥐의 방광암 발생률은 67 %였다 (2) 2:1 비율로 개발 한 이행 세포 암 (TCC)는 편평 세포 암종 (SCC)에 비해 (3) 염증성 사이토 카인은 종양의 개발 과정에서 시간이 증가하고, (4) 펩타이드 백신의 투여 살전-편광 혈청 사이토 카인 프로필과 MUC1 특정 T 세포 반응을 유도합니다. MUC1.Tg 마우스에있는 종양은 MUC1 발현 양성이었고, MUC1.Tg와 야생형 생쥐의 모든 종양의 절반 침략했다. 결론적으로, 약리학, 면역학, 병리학 및 분자 생물학의 노력의 조정을 통해 팀 접근 방식을 사용하여, 우리는 hMUC1을 표현 방광 암의 면역 그대로 형질 전환 마우스 모델을 개발했습니다.

방광암의 새로운 면역 요법 및 이들의 조합의 효과 전임상 평가는 적절한 동물 모델의 개발이 필요합니다. 우리의 유전자 변형 마우스 모델에서, 화학적 발암 물질 OH-BBN을 가진 유도 인간의 방광 암과 유사한 일부 SCC와 주로 TCC의 방광암 발생의 높은 비율로 만들었습니다. 종양의 조직 학적, MUC1 발현 상태 및 펩티드 백신 치료에 면역 반응을 확인하기 위해 21 MUC1.Tg 18 야생형 마우스는 OH-BBN 유도 후 혈액의 수집, 방광, 비장 (그림 1) 8 주 동안 안락사되었다 (주 28). 두 MUC1.Tg (14 / 21)와 야생 유형 (18분의 12) 쥐의 방광 암 발생률은 67 %였다. 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E)는 염색 2:1 비율로 지배적 인 TCCS로, TCC과 SCC 모두의 존재를 확인했다. 이 중, 우리는 고급 침략 종양 낮은 고급 비침의 범위를 관찰했다.모든 MUC1.Tg 방광 암 표본 IHC (그림 2)에서 MUC1 발...

N-부틸-N-(4 - 히드 록시 부틸) 니트로사민 유도 방광암 모델은 인간의 점액 1 (MUC1) 테스트의 목적 MUC1-감독 면역 형질 전환 생쥐에서 개발되었다. MUC1 표적 펩타이드 백신을 투여 한 후, MUC1에 대한 세포 독성 T 림프구 반응은 혈청 사이토 카인 수준과 T 세포의 특정 활동을 측정하여 확인 하였다.

면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

다음 실험의 전반적인 목표는 방광암에서 종양 관련 항원을 표적으로 하는 세포독성 T 림프구 반응을 효과적으로 유도하는 것입니다. 이는 인간 종양 관련 항원 마하 1을 발현하는 마우스에서 방광암을 유발함으로써 달성됩니다. 다음으로, 펩타이드 백신을 마우스에 주입하고 마하 1 특정 세포독성 T 림프구 반응을 생성합니다.그런 다음 혈청 종양과 비장을 분리하고 조직을 분석하여 각각 사이토카인, 항원 및 면역 반응을 확인합니다. 웨스턴 블롯 멀티플렉스, 플루오로 메트릭 마이크로비드, 면역분석 면역조직화학 및 라이브 스팟 분석을 활용하여 방광암에 대한 펩타이드 백신의 효능을 테스트할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아주 새크라멘토에 있는 캘리포니아 대학교 데이비스 보건 시스템의 연구 과학자인 그레고리 웨츠 박사입니다.이종이식편과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 이종이식편에는 면역이 저하된 숙주가 필요한 반면, 당사 모델은 펩타이드 백신의 표적인 인간 종양 관련 항원을 발현하는 면역 온전한 형질전환 마우스를 사용한다는 것입니다. 저와 함께 이 기술을 시연할 사람은 모두 동료 연구 과학자인 Daniel V와 Dr. Chaga와 Audrey Gutierrez, 그리고 Dr. Michael de Gregorio의 실험실과 UC Davis Health System입니다. 방광암을 유발하기 위해 N 부틸, N 4 히드록시, 부틸 니트로사민 또는 O-H-B-B-N의 첫 번째 용량을 투여하기 전에 각 마우스에 대해 턱밑 출혈을 수행하여 전혈 및 혈액 응고 튜브를 채취하고 혈액이 응고될 때까지 30분 동안 기다립니다.스테인리스 스틸 20게이지 간침을 사용하여 8주부터 시작하여 12주 동안 주 5일 동안 O-H-V-B-N을 경구 투여합니다. 20주차에 0.9% 멸균 식염수 600마이크로리터를 사용하여 동결건조 펩타이드 백신의 각 바이알을 재구성하고 식염수를 사용하여 0.5인치 27게이지 바늘을 통해 용액을 6회 당겨 완전히 재현탁합니다. O-H-B-B-N의 마지막 투여 후 100마이크로리터의 부피로 원하는 용량이 전달되도록 농도를 조정하고 O-H-B-B-N의 마지막 투여 후 8주 후에 25게이지 바늘을 사용하여 100마이크로리터의 백신을 주입하여 8주 주기로 매주 백신을 투여합니다.이산화탄소 질식으로 모든 쥐를 안락사시킨 후 각 쥐를 해부 보드에 놓고 네 팔다리를 모두 고정합니다. 그런 다음 집게와 가위를 사용

induction-invasive-transitional-cell-bladder-carcinoma-immune-intact

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 방광 벽 주입은 orthotopically 방광 줄기 세포와 암 생물학을 연구하는 유용한 방법입니다. 이 섬세한 microsurgical 방법은 신중 기술과 연습 마스터하실 수 있습니다.

마우스 블레더 월 주입

방광 종양은 catheterization, 지역 소작하고, 화상 사이트에 암종 세포의 후속 유착을 통해 법으로서 방식으로 여성의 생쥐에 설립되었습니다.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

초음파와 발광 생물 이미징에 의한 intravesically 전달 saRNA 및 모니터링 종양 성장의 antitumor 효과를 평가하는 orthotopic 방광 종양 모델을 수립.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

이 비디오에서는 암세포를 마우스 모델의 방광으로 전달하는 방광 내 절차에 대해 설명합니다. 이 절차는 치료 전략을 개발하는 데 사용할 수 있는 정형소 방광 종양 모델을 생성하는 데 도움이 됩니다.

마우스 모델에서 정소성 방광 종양 모델링: 쥐 방광에 암세포의 방광 내 투여 절차

기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

Murine 방광 종양 N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine 발암 물질 (BBN)으로 유발 됩니다. 방광 종양 생성은 이기종; 따라서, 종양 짐의 정확한 평가 랜덤 실험적인 치료를 하기 전에 필요 하다. 여기 우리는 빠르고, 신뢰할 수 있는 MRI 프로토콜 종양 크기 및 단계 평가를 제시.

발암 물질 유발 Murine 방광 종양의 자기 공명 영상 평가

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

이 프로토콜은 발암물질 유도 뮤린 방광암에서 유래한 방광 종양 오르가노이드의 3차원 시험관 내 배양을 확립하기 위한 상세한 실험 단계를 제공한다. 종양 오르가노이드의 통과, 유전 공학 및 정형외 이식을 포함하는 배양 방법이 기재되어 있다.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

배우세요 MUC1 표적 펩타이드 백신을 이용한 방광암 면역요법 모델 구축 방법을. MUC1 유전자 변형 마우스에서 세포독성 T 림프구 반응을 유도하고 면역 반응을 분석하는 기술입니다.

면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

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