NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 성인 뇌에서 전사 인자 NF kappa B의 기능을 조사하는 것입니다. 이것은 뉴런에서 NF kappa B 활성을 특이적으로 억제하는 형질전환 마우스를 먼저 육종함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 공간 패턴, 분리 또는 헛간, 미로를 사용하여 NF 카파 B 억제의 행동 결과를 테스트하는 것입니다.

세 번째 단계는 동물을 조심스럽게 풍부하게 먹이고, 뇌를 제거하고, 뇌를 적절히 절단하는 것이다. 마지막 단계는 면역 염색을 통한 이끼 낀 섬유 투영을 시각화하는 것과 같은 조직학적 및 구조적 효과를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 행동 검사와 조직학을 사용하면 치상회(dentate gyrus) 의존 학습의 변화와 관련 조직의 구조적 변화를 연관시킬 수 있습니다.

Mars Vase와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 공간 패턴 분리 결합 MA가 이 뇌 영역의 신경 퇴화 및 재생뿐만 아니라 아동 의존 학습 과정에 반대하는 것을 구체적으로 측정할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 특수 패턴 분리로서의 학습과 같은 성인 신경 발생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미로 시연은 제 연구실의 기술자인 Angela Kula가 수행할 것입니다.

관류는 연구원인 Peter Hyman이 발표할 예정입니다. 그런 다음 뇌 절편은 Ulrich KA 기술자가 보여줍니다. 마지막으로, 컨포칼 주사 현미경은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Jeanine Muah가 공간 패턴 분리를 수행합니다.

Barnes Maze 국제 및 지역 지침에 따른 행동 테스트. 이 분석을 위해서는 최소 6개월 된 수컷 마우스만 사용하는 것이 중요합니다. 각 테스트 시리즈에 대해 동물은 생후 4일 이내여야 하며 동일한 작업자가 테스트 전에 모든 테스트를 수행해야 합니다.

쥐는 단 음식에 의해 동기 부여가 될 수 있도록 표준 식단을 먹여야 합니다. 먼저 테스트를 설정하려면 단단한 플라스틱으로 만든 직경 120cm의 흰색 플레이트를 구합니다. 추가 미로 큐는 다양한 재질로 만들 수 있으며 모양이 다를 수 있습니다.

중요한 것은 동물이 달리는 바퀴가 명확하게 인식할 수 있도록 높은 대비를 가져야 한다는 것입니다. 사다리와 터널은 모두 좋은 신호입니다. 적당히 강렬한 여러 개의 네온 형광등 아래에 플레이트를 배치하여 쥐가 빛에서 벗어나도록 동기를 부여하십시오.

실내는 습도가 조절되어야 하며 섭씨 22도의 일정한 온도를 유지해야 합니다. 이제 비디오 추적 시스템을 설정합니다. 플레이트의 중심에서 115cm 위에 카메라를 배치합니다.

다음으로, 플레이트에 맞는 흰색 천에 여러 가지 색상의 추가 미로 신호를 부착합니다. 동물이 쉽게 볼 수 있도록 천 중앙 근처에 배치하십시오. 이제 실험 설정에서 냄새를 제거할 수 있는 급속 소독제로 플레이트를 조심스럽게 청소하십시오.

흰색 접시에 7개의 동일한 노란색 식품 집을 배치합니다. 테스트를 시작하기 하루 전에 위치를 명확하게 표시해야 하며 각 마우스를 디스크에 습관화해야 합니다. 거주 시험을 위해 7개의 식량 집 각각에 4등분된 과일 고리와 같은 달콤한 음식 펠릿 보상을 배치합니다.

각 마우스를 플레이트의 시작점에 놓고 10분 동안 탐색하도록 합니다. 생쥐 간의 이 탐색을 기록합니다. 원형 접시와 식품 하우스를 급속 소독제로 청소하십시오.

식량 보상도 보충할 수 있습니다. 다음 7일 연속으로 테스트에 대한 테스트 테스트를 실행합니다. 한 집을 제외한 모든 집이 전체 실험 동안 투명 테이프로 닫혀 있습니다.

항상 같은 집입니다. 각 집에는 여전히 보상이 주어지며 테스트는 습관화 시험처럼 실행됩니다. 생체 리듬 변화를 피하기 위해 각 동물에 대해 하루 중 같은 시간에 테스트를 실행합니다.

나중에 적절한 통계를 사용하여 대기 시간, 이동한 거리 및 오류를 분석합니다. 소프트웨어는 잘못된 식품 집에 접근하거나 적절한 상자에 접촉했지만 보상을 찾아 넣지 못하는 것으로 오류를 정의합니다. 그룹을 비교하려면 양방향 분산 분석과 사후 검정을 사용합니다.

버틴의 복강 간 주사로 동물을 마취한 후, 헤파린과 프로판이 함유된 PBS로 조심스럽게 경선으로 관류합니다. 26게이지 바늘을 사용하여 좌심실에 구멍을 뚫습니다. 또한 오른쪽 심방을 절개하여 혈액과 관류 8이 흘러나오도록 합니다.

관류 바늘을 구멍의 좌심실에 직선 각도로 1-2mm 깊이로 삽입합니다. 1.2-1.4미터의 정수압을 사용하고 2-4분에 걸쳐 마우스를 관류합니다. PBS에서 4%파라알데히드가 함유된 헤파린과 프로판을 10-15분 동안 따릅니다.

관류는 분당 15 밀리리터의 속도여야합니다. 이제 뇌를 해부해 보십시오. 옅은 흰색이어야 하며 눈에 띄는 붉은 혈관이 없어야 합니다.

수집된 모든 뇌를 4%파라 포름알데히드로 섭씨 4도에서 24시간 동안 고정합니다. 다음 날. Cryo는 PBS에서 30% 자당으로 뇌를 보호하고 나중에 최소 24시간 동안 섭씨 4도에서 저장합니다.

뇌는 극저온 톤 스테이지에서 얼어붙고 40미크론 두께의 수평 섹션으로 자릅니다. 신경 필라멘트 M에 대한 항체로 절편을 염색한 후, 형광 항체에 적합한 파장에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이끼 낀 섬유 투영을 시각화할 수 있습니다. 저배율에서 스캔을 시작하고 해마와 이끼 낀 섬유 돌출부를 향합니다.

그런 다음 더 높은 배율에서 I kappa B alpha AA one transgene의 발현을 조사하기 위해 분석을 위해 이끼 낀 섬유의 고해상도 제왕절개 스캔을 수집합니다. 이중 형질전환 마우스에서 뇌를 분리하고, GFP 컨포칼 레이저 스캐닝에 대한 항체를 사용하여 극저온 절편 및 염색했습니다. 현미경 검사는 CA 1 영역, CA 3 영역 및 DG에서 전이 유전자의 높은 발현을 밝혀 해마 신경 인성 영역에서 CAMK 2 알파 구동 I kappa B 알파 AA 1을 발현하는 가장 빠른 세포 유형을 결정했습니다.

I Kappa BTTA의 하마 Campi의 냉동 절편. 동물을 이중 쿠르탱(double courtin)으로 염색하고 전이유전자 컨포칼 분석을 통해 CAMK 2 알파 활성에 의한 전이유전자 발현 유도를 나타내는 화살표로 표시된 어린 DCX 양성 과립 세포에서 GFP 신호를 밝혔습니다. i kappa BTTA 및 i Kappa B에서 마우스를 뺀 해마의 코로나 단면을 이끼 낀 섬유 돌기를 시각화하고 I kappa BTTA 마우스의 복잡하고 수포적인 조직을 드러내기 위해 신경필라멘트 M을 염색했습니다.

이끼 낀 섬유 돌출부는 심각하게 손상되었습니다. 또한 NF kappa B 억제로 인해 급격한 구조적 결함의 잠재적 원인을 연구하기 위해 speral blade 두께가 크게 감소하고 DG 부피가 작아졌습니다. 대조군과 I kappa BTTA 마우스의 고정되지 않은 신선한 해마 절편을 플루오로 옥 C로 염색하여 신경 세포 사멸을 특이적으로 검출할 수 있었습니다.

행성돌기의 수가 급격히 증가한 것은 단일 형질전환 대조군에 비해 이중 형질전환 동물에서 관찰되었습니다. 또한, I kappa BTTA 마우스에서 절단된 capace 3개의 양성 세포의 현저한 증가가 검출되었습니다. 대조적으로, DCX에 대한 면역조직화학적 염색은 I kappa BT 마우스의 뇌에서 DCX 양성 세포의 양이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다.

또한, I kappa B TTA hippo Campi의 d CX 양성 세포는 sub granular zone에만 배열되지 않고 dg의 더 깊은 영역에서도 발견되었습니다. 대조군에서 D CX 양성 전구세포는 거의 독점적으로 하위 과립 영역 내에 국한되었습니다. DCX 발현 세포의 증가된 양을 테스트하는 것은 초기 전구 세포의 성숙의 결과이거나 DCX 양성 세포의 증식에 직접적으로 기인합니다.

BRDU를 i kappa BTTA 및 대조군 마우스의 복강내 주입한 다음 증식 분석을 위해 DCX 및 BRDU로 동결 절편하고 염색했습니다. BRDU를 한 번 주입한 후 24시간 후에 분석했습니다. 분화 분석을 위해 매일 3회 주입을 실시한 후 BRDU 1회 주입 후 7일 후에 분석을 수행했습니다.

I kappa, BTTA 음성 및 대조군 동물 간의 총 BRDU 양성 세포 수에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 대조적으로, 3가지 연속 주사 접근법은 I capa, BTTA의 DG에서 B-R-D-U-D-C-X 양성 세포의 양이 명확하게 증가한 것으로 나타났습니다. DCX 발현 세포의 분화 또는 통합이 방해받은 마우스는 세포 수를 증가시켰을 수 있으며, 이중 형질전환 마우스의 거동을 특이적으로 테스트하기 위해 3형 세포가 관여했을 수 있습니다.

DG 종속 작업에서는 S-P-S-B-M이 사용되었습니다. I kappa B 대조 동물은 실험 첫날에 식품 하우스를 연속적으로 탐험했습니다. 7일간의 훈련 후, 동물들은 열린 먹이 집을 직접 찾을 수 있었습니다.

대조적으로, IA BTTA 동물은 훈련 후에도 계속해서 먹이 집을 탐색합니다. i 카파 B 대조군 동물에 비해 I 카파 BTTA 동물에서 커버한 거리의 현저한 증가와 더 높은 지연 시간 및 오류율이 관찰된 것은 이 동물들이 심각한 학습 결함을 가지고 있음을 시사합니다. 일단 확립되면이 기술은 개발 후 적절하게 수행되면 동물 한 마리당 30 분 안에 완료 할 수 있습니다.

이 기술은 생쥐의 성인 신경 발생 퇴화 또는 재생과 같은 자이로 의존 작업에 관심이 있는 다른 신경 과학자들에게 길을 열어줄 수 있습니다.