Name: NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 배우세요 NF-κB 의존 성인 해마 신경 발생 조작 및 분석 방법을 마우스 모델에서. 공간 패턴 분리-바른즈 미로 행동 테스트와 조직학 분석을 통해 치아상회 의존 학습과 구조적 변화를 연관 짓는 기술입니다.

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우리는 우수한 기술 지원 안젤라 Kralemann - 쾰러 감사합니다. 여기에 기술 된 실험 연구는 실험실에서 수행되었으며, CK 및 BK와 BK에 대한 연구 및 교육의 독일 교육부 (BMBF)의 부여에 독일 연구 협회 (DFG)의 보조금에 의해 지원되었다.

윤리 문 본 연구는 정부의 동물 및 관리에 사용위원회, 국가 노스 라인 - 웨스트 팔리 아, (뒤셀도르프, 독일)의 LANUV의 규정에 따라 실시 하였다. 모든 동물 실험은 라이센스 번호 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW)에서 LANUV, 뒤셀도르프에 의해 승인되었다. 모든 노력이 조난 및 연구에 필요한 동물의 수를 최소화하도록 하였다. 1. 동물 관리 및 주택 <ol><li> 연맹 유럽 실험 동물 과학 협회 (FELASA)에 의해 정의 된 명세서에 기술 된 프로토콜에 사용 된 모든 동물은 무균 상태에서 보관해야합니다. </li><li> HEPA 공기 여과와 마우스는 낮의 조건 (12 시간 빛 / 어둠주기)에 따라 온도와 습도 조절 (22 ° C) 방에 표준 케이지에 보관해야합니다. </li><li> 표준화 된 음식과 물을 임의로 제공한다. &lt;/ 리&gt; <li> IκB / TTA 및 IκB는 / IF - 대조군 마우스가 사용되는 7, 18에서 설명한 바와 같이, PCR-기반의 유전형은 각 동물에 대해 수행되어야한다. </li><li> 이하 사일의 나이 차이 말레 동물은 개별 변동을 줄이기 위해 사용되는 것이다. </li><li> (선택 사항) : NF-κB의 활성화의 실험을 위해, 독시 싸이클린은 적어도 14 일 동안 (2.5 % 자당 2 ㎎ / ㎖) 마시는 물을 관리해야합니다. </li></ol> 2. 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM) <ol><li> 모든 행동 테스트는 국제 및 지역 가이드 라인에 따라 실시해야한다. </li><li> 중요! 6 개월 이상 연령이 만 수컷 마우스를 사용합니다. 하나의 테스트 시리즈의 동물 사이의 나이 차이가 적은 4 일 이상이어야합니다. 테스트는 각 시리즈에 대해 동일한 작업자가 수행해야합니다. 마우스는 또한 부분적으로 구동 동기를 부여하기 전에 테스트에 표준 식단을 받아야한다WEET 음식 보상. </li><li> 하드 플라스틱으로 만든 흰색 원형 접시를 설정 최소 4 × 80 (W)와 3 × 215 W 네온 형광 램프 조명, 습도 및 온도 조절 실 (22 ° C)에 (직경 120cm는,도 5a 참조) . 중요! 마우스의 동기가 부분적으로 밝은 노출 장소에 자신의 혐오에 의해 구동되는 음식의 주택을 입력으로, 올바른 조명이 사용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 비디오 추적 시스템을 설정합니다. 카메라는 115cm 플레이트의 중앙 (그림 5A 참조) 위에 배치해야합니다. </li><li> 동물, 판의 경계에서 약 100 센티미터 (그림 5A 참조) 쉽게 볼 위치에 흰색 색 천에 여러 가지 빛깔 추가 미로 큐 (EMC)을 연결합니다. </li><li> 조심스럽게 실험 장치에서 모든 냄새를 제거 할 수있는 빠른 살균제 플레이트를 청소합니다. </li><li> 일곱 동일한 노란색 식품 주택 (12cm X 7cm × 8 cm의 그림 5A를 배치 </하얀 접시에)&gt; 강한. 위치는 (그림 5A 참조) 명백하게 표시해야한다. </li><li> 그림 5A에게 단 하나의 정의 음식 집은 동물 (위치 F에 자유롭게 접근 채 (그림 5A 참조) 정의 된 위치에있는 모든 음식을 집 안에 달콤한 음식 펠릿 보상 (Kellogs`의 Froot 루프 / 음식 집의 내무반)를 참조 배치 ). 투명 호일로 비 표적 식품 주택을 닫습니다. </li><li> 시험 전에, 습관화 (작업을 시작하기 전에 하루) 수행합니다. 모든 식품 주택 자유롭게 액세스 할 수있게하고, 마우스는 자유롭게 미로를 탐험하고 식품 펠​​렛 보상 (10 분 / 동물)를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 컴퓨터와 카메라를 전환하고 영상 추적 시스템 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 녹음을 시작합니다. </li><li> 원형 접시에 정의 된 시작점 (그림 5A, S : 시작 위치)에 동물을 배치하고 마우스는 10 분 동안 대상 식품 하우스를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 스토P 비디오 추적. </li><li> 중요! 빠른 살균제 각 시험 후 원형 접시와 음식의 주택을 청소합니다. </li><li> (각 동물에 대한) 일곱 연속 일 동안 매일 테스트를 반복합니다. </li><li> 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 결과 (대기 시간, 거리 적용 및 오류)를 분석합니다. 잘못된 음식 집 및 / 또는 입력하고 음식 펠릿 보상을 검색하지 않고 적절한 상자와의 접촉을 접근으로 오류를 정의합니다. 분류 분석을 위해 Bonferroni 사후 테스트를 양방향 ANOVA를 사용합니다. </li><li> (선택 사항) 쥐를 희생하고 아래에 설명 된대로 해마를 분석합니다. </li></ol> 3. BrdU의 라벨링 <ol><li> 삼일 (분화와 통합의 분석) 또는 단일 주사 (증식 분석) 200 ㎎ / ㎏ IP의 회 복강 내 50 ㎎ / ㎏의 IP가 BrdU를 주입. </li><li> , 동물을 희생 해마를 해부 아래에 설명 된대로 40 μm의 섹션을 준비합니다. </li><li> Denaturate10 분 동안 2 M HCl로 섹션 및 10 분 동안 0.1 M 보레이트 완충액 부화. </li><li> BrdU의에 대한 항체를 사용하여 아래에 설명 된대로, 면역 조직 화학 염색을 각 동물에서 40 μm의 섹션 (떨어져 240 μM)의 1 인 12 개의 시리즈 레이블을 지정합니다. </li><li> 과립 세포층과 subgranular 영역 rostrocaudal 범위에 걸쳐 공 촛점 현미경 분석에 의해 표지 된 세포를 정량화. DG 당 표지 세포의 수를 얻기 위해 두 가지에 의해 해마 및 분할 당 BrdU의 표지 세포의 예상 수를 얻기 위해 (12)에 의해 생성 된 숫자를 곱합니다. </li></ol> 4. 망막 비관 동물의 두뇌와 저온부의 제조 제거 <ol><li> 동물을 안락사에 대한 로컬 승인 절차를 준수하십시오. 마우스는 직접 자궁 전위에 의해 안락사 할 수있다. </li><li> (선택 사항) 동물 복강 인제에 의해 예를 들어, 지역 및 국제 가이드 라인에 따라 euthanization 전에 마취 할 수 있습니다(갓 식염수 나 생리 버퍼의 1.85 ㎖로 2.2 mg의 2,2,2 - tribromoethanol 이소 아밀 에탄올 ML 1에서 만든 150 ㎖의 원액을 혼합하여) 33g 마우스 0.8 ML Avertin의의의 ction. </li><li> 베타 딘 (10 % 포비돈 요오드)을 적신 70 % 에탄올에 적신 거즈로 그 후 거즈와 면봉을 사용하여 머리를 소독. </li><li> 적절한 수술 가위를 사용하여 동물의 목을 벨 옆 피부를 당겨. </li><li> (OPTIONAL) Fixators 뒤로 지연된 피부의 접는 피하기 위해 적용될 수있다. </li><li> 두개골의 중간 선 절개를 조심스럽게 옆으로 두개골 조각을 당기십시오. </li><li> 조심스럽게 적절한 외과 용 기기 (예 : 모리아 스푼)를 사용하여 뇌 전체를 제거합니다. </li><li> 드라이 아이스 -30 -40 ° C에서 50 ㎖ 비이커 (예 : Schott 쇼트 듀란)의 2 - 메틸 부탄의 Precool 25 ML. 참고 : 이상적으로 공 초점 레이저 주사 현미경에 적합하다 &quot;두께&quot;섹션의 자유 부동 염색의 경우, 뇌를 제거, 3 세척뇌 (보통 하룻밤) 아래로 아래로 침몰 할 때까지 인산 4 ° C에서 버퍼와 저장소에있는 시간은 50 ML 튜브에 30 % 자당 솔루션을 버퍼. </li><li> 조심스럽게 Nescofilm (파라 필름)의 조각에 뇌를 놓고 TissueTek의 OCT 화합물의 충분한 양 커버, -80 ° C에서 사용할 때까지 2 - 메틸 부탄, 저장소에 Nescofilm에 동결. 참고 : 9 % 자당, 7 mM의 MgCl2를, 50 mM의 인산염 완충액, 44 % 글리세롤에 -20 ° C 점에서 오랜 시간 보관하십시오. </li><li> 적절한 cryomicrotome에 10 ~ 12 μm의 두께 섹션으로 머리를 잘라. 참고 : 두께, 자유 부동 섹션의 경우 (예 : Reichert는 정, Frigomobil.) 및 -20 °에서 40 μm의 수평 부분을 잘라 적절한 cryotome의 cryotome 무대에서 뇌 동결 - 25 ° C. 미세 브러시와 나이프에서 섹션을 수집하고 버퍼에 수집하거나 장기간 저장을 위해 -20 ° C에서 (4.9 단계) 스토리지 솔루션을 유지. </li><li> 조심스럽게 하나의 현미경 슬라이드에 두 조각을 탑재합니다. 우리Superfrost UltraPlus 슬라이드 전자가 높은 부분의 접착 성을 극대화하는 것이 좋습니다. </li><li> 실온에서 5 분간 슬라이드를 건조. 슬라이드를 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. 관류 동물에서 섹션의 준비 <ol><li> (단계 8.4) 상술 한 바와 같이 동물을 마취. </li><li> 조심스럽게 10 ~ 15 분 동안 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 2 ~ 4 분 동안 인산염 완충 헤파린을 함유하는 생리 식염수 (PBS) (0.025 100g 당 ml의 PBS) 및 프로 카인 (0.5 100g 당 ml의 PBS)로 transcardially 동물을 perfuse . 관류 최적으로 약 1.2-1.4 m 또는 약 15 ㎖ / 분으로 설정 연동 펌프를 사용의 수압을 이용하여 좌심실과 우심방의 개방을 통해 관류에 의해 수행된다. 더 붉은 혈관이 눈에 보이는 것없는 그 창백한 흰색 두뇌에 최적의 관류 결과. </li><li> 해부 및 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정. </li><li> 극저온최소 24 시간 동안 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당의 머리를 보호합니다. </li><li> cryotome 무대에서 머리를 고정. </li><li> 적절한 cryotome를 사용하여 전체 forebrains에서 40 μm의 수평 섹션을 준비합니다. </li><li> 슬라이드는 -20 ° C에서 사용할 때까지 동결 방지제 용액 (0.1 M 인산염 완충액, 50 % 글리세롤, 0.14 %의 MgCl2를 8.6 % 자당)에 저장 될 수 있습니다. </li></ol> 6. 망막 비관 동물의 뇌 섹션의 면역 조직 화학 <ol><li> 10 분 동안 -20 ° C, 냉 메탄올을 사용하여, 전술 한 바와 같이 제조 저온부를 사후 고정한다. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 (이차 항체를 제기에 사용 된 종) 0.3 % 트리톤-X를 포함하는 5 % 정상 혈청 차단 </li><li> 1X PBS로 3 회 세척하고 4 ℃에서 밤새 차 항체와 부화 </li><li> 1X PBS로 3 회 헹구 1 시간 동안 실온에서 이차 항체와 함께 배양한다. </li><li> 1X PBS로 3 회 씻어 </li><li> 기SYTOX 녹색 또는 DAPI (또는 대안 DNA 염료)를 사용하여 DNA를위한 섹션 nterstain. </li><li> 1X PBS로 3 회 씻어 </li><li> 수성 삽입 매체의 섹션을 포함합니다. </li><li> 삽입 매체는 적어도 48 시간 동안 중합 보자. </li></ol> 7. 관류 동물의 뇌 섹션의 면역 조직 화학 <ol><li> 단계 6.2에서 설명하고 이후 4 ℃에서 하룻밤 동안 0.3 % 트리톤-X (자유 부동)를 포함하는 PBS에 희석 차 항체 용액에 고정 된 뇌 부분을 품어로 차단 </li><li> 1X PBS로 3 회 헹군 후 3 시간 동안 실온에서 0.3 % 트리톤 X-(부동성)를 함유하는 PBS에 희석 차 항체 용액에 부화. </li><li> 1X PBS로 3 회 씻어 </li><li> SYTOX 녹색 또는 DAPI (또는 다른 DNA 염료)를 사용하여 DNA에 대한 섹션을 Counterstain. </li><li> 1X PBS로 3 회 씻어 </li><li> 수성 삽입 매체의 섹션을 포함합니다. </li><li> 매립 매체에 대한 중합하자T 최소 48 시간. </li></ol> 8. 이끼 낀 섬유 계획 조사 <ol><li> , 동물을 희생 상술 한 바와 같이 40 μm의 코로나 섹션을 준비하고 신경 미세 섬유 M.에 대한 항체를 사용하여 해마 부분을 얼룩 </li><li> 이끼 섬유와 핵을 시각화하는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 적절한 파장에서 섹션을 스캔. 낮은 배율에서 스캔을 시작합니다. </li><li> 방향의 낮은 배율 이미지를 사용하여 이끼 섬유 돌기 해마를 대상으로. </li><li> 높은 해상도와 높은 배율 섹션 (Z-절편)을 검사합니다. </li><li> NF-M에 대한 염색을 통해 시각화 이끼 섬유의 형태 학적 모양과 연결을 분석합니다. </li><li> (선택 사항) 해마 블레이드의 크기와 볼륨을 분석합니다. 측정을위한 DNA 신호를 사용합니다. </li></ol> 9. 플루오로 옥 C 분석 (신경 세포의 죽음) <ol><li> 동물을 희생 hippoc 해부ampus, 전술 한 바와 같이 12 μm의 섹션을 준비합니다. </li><li> 섹션은 실온에서 30 분 동안 건조 시키십시오. </li><li> 실온에서 40 분 동안 4 % PFA의 섹션을 고정한다. </li><li> 간단히 섹션 DDH 2 O.와 배 세척 </li><li> 연속, 부드러운 흔들림에서 10 분 동안 0.06 % 과망간산 칼륨 (의 KMnO4)과 섹션을 품어. </li><li> 섹션 DDH 2 O로 3 배 씻으 </li><li> 실온에서 20 분간 0.002 % 플루오로 옥 C 용액으로 섹션 부화. </li><li> (옵션)을 동시에 핵 염색에 들어, 0.002 % 플루오로 옥 C 솔루션은 10 ㎍ / ㎖의의 DAPI로 보충 할 수있다. </li><li> 간단히 섹션 DDH 2 O.와 배 세척 </li><li> 섹션은 실온에서 30 분 동안 건조 시키십시오. </li><li> 크실렌과 섹션을 품어 (1 분) </li><li> 크실렌 기반 설치 매체 (DPX)를 사용하여 섹션을 탑재합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.

성인 신경, 독시 싸이클린을 통해 신경 세포에서 NF-κB의 억제, 그 이후 재 활성화를 통해 그 조작의 가능성은 성인 뇌뿐만 아니라 신경 드 다시 세대에 신생아 뉴런에 수사 매혹적인 시스템을 제공합니다 . 이 시스템의 장점은 그 신경 세포의 죽음, 조상의 증식과 이동, 심각한 구조 및 해부학 적 변화뿐만 아니라, 명백한 학습 결함의 변화에​​ 신경 결과뿐만 아니라에서 NF-κB 신호 전달 경로를 억제. 중요한 것은, IκB / TTA 동물의 표현형은 실험적으로 반전 독시사이클린의 투여 후 구조 될 수 있습니다. 표현형이 복귀 구조적 측면을 포함하고, 또한 DG 의존 2 학습에 상당한 개선으로 이어질 수 있습니다. 행동 실험에 대한 해석 결과를 보장하기 위해, 그것은 중요합니다 그 나이의 다른 작풍 만 수컷이하 4 일 이상의 후부가 사용 될 수있다. 또한, 모든 테스트는 일련의 동일한 오퍼레이터에 의해 수행되어야한다. 시험 장소에 관해서는, 우리는 강력하게...

론적, 해마는 알려진 가장 오래된 해부 뇌 구조의 하나이다. 그런 장기 기억, 공간 방향, 및 각각의 메모리 형성 및 통합의 조절에 중추적 인 기능 등 다양한 복잡한 태스크를 책임진다. 해부학, 해마는 subgranular 영역 내에서 과립 세포와 약간의 신경 전구 세포를 포함하는 뿔 Ammonis (CA1, CA2, CA3 및 CA4) 지역과 치아 이랑 (dentate gyrus) (이랑 dentatus), 등의 피라미드 세포 층 (지층 pyramidale)로 구성 . 과립 세포는 소위 이끼 섬유 (과립 세포의 축삭)를 통해 CA3 영역을 향해 돌출. 지난 세기 말까지, 성인 포유류의 뇌 세포의 가소성과 신경을 결여 정적 인 기관이 될 것으로 추정했다. 그러나 지난 20 년간, 기록의 성장 양이 명확하게 일어나고 성인 신경을 보여줍니다 이상두 뇌 영역, subventricular 영역 (SVZ) 및 해마의 subgranular 영역. 우리의 이전 연구와 다른 그룹의 사람들은 전사 인자 NF-κB가 성인 신경의 중요한 분자 규제 중 하나이며, 심각한 구조적 해마 결함과인지 장애 1-6에서의 규제 완화의 결과가 있다는 것을 보여 주었다. NF-κB는 다섯 DNA 결합 서브 유닛의 다른 이량 체의 조합으로 구성된 유도 전사 인자의 총칭이다 : P50, P52, C-상대, RelB 및 P65 (상대적), 후자의 세 전이 활성화 도메인이. 뇌 내에서 세포질에서 발견되는 가장 풍부한 형태는 P50와 카파 B (IκB) 단백질의 억제하여 비활성 형태로 유지 P65의 이종입니다. NF-κB 중심 신경을 공부하고 직접 조작하기 위해, 우리는 NF-κB의 subun의 모든 간단한 억제 할 수 있도록 유전자 변형 마우스 모델을 사용그는 구체적 전뇌 7 (도 1 참조). 및 -/tTA -이를 위해, 우리는 다음의 유전자 변형 마우스 라인 IκB / 교차 사육. 형질 전환 IκB / - 라인은 NF-κB 억제제 IκBa (슈퍼 억제 IκBa-AA1)의 트랜스 지배적 부정적인 돌연변이 체를 사용하여 생성 된 8. 야생형 IκBα 달리 IκBα-AA1은 억제제의 인산화와 후속 프로 테오 분해를 방해 알라닌 (V32 및 V36)에 변이 개의 세린 잔기를 갖는다. IκBa-AA1-유전자의 전뇌 신경 세포의 특정 표현, IκB / - 마우스는 마우스는 칼슘 - 칼 모듈 린 의존성 키나제를 숨겨와 교차 자란 IIα 테트라 사이클린 트랜스 활성제 (TTA)에 의해 구동 될 수있다 (CAMKIIα) 발기인 9. P65 녹아웃 마우스 인해 대규모 간 세포 사멸 (10), 배아 치명적인 표현형이있다, 그래서 여기에 표시된 방법은 우아한 방법을 제공출생 후 성인 신경에서 NF-κB의 역할을 조사하는. 공간 학습과 기억을 연구하는 고전적인 행동 시험은 리처드 모리스, 모리스 물 미로 (MWM) 11로 알려진 시험에 의해 1980 년대에 설명했다. 이 오픈 필드 물 미로에서, 동물은 방향과 추가 - 미로 단서에 따라 숨겨진 플랫폼에 불투명 한 물에서 탈출을 배웁니다. MWM의 건조 변형은 소위 반스 미로 (BM) 12. 이 테스트는 하나의 탈출 상자로 정의 된 구멍 및 방향에 대한 시각적 여분 미로 단서로, 판의 경계에 배치 (20)의 원형 구멍이있는 원형 접시를 사용합니다. 두 실험 패러다임은 짐승`의 물에 대한 혐오, 또는 오픈, 밝은 조명 공백으로 유도 비행 동작에 의존하고 있습니다. 두 시험은 공간 방향에 대한 조사 및 관련 메모리 성능을 할 수 있습니다. 해마는 공간 기억 형성의 일반적이고 필수적인 역할을하지만, 해마 R참여 egions 적용 시험에 따라 다릅니다. BM에서 테스트 메모리는 enthorinal 피질 (EC)와 DG 13-16의 기여없이 해마의 CA1 - 지역에있는 피라미드 뉴런 사이의 연결 활동에서 발생한다. 특히, 고전 BM은 주로 중요한 것은, DG가 결정적으로 처리뿐만 아니라 의미 소위 공간 패턴 인식 17 일에 관여 EC V.에 CA1에 EC III에서 monosynaptic 측두 - ammonic 경로를 통해 탐색에 의존 시각 및 공간 정보뿐만 아니라, 서로 다른, 겹치지 않는 표현으로 유사한 표현이나 기억의 변형. 이 작업은 CA1과 BM (15)에 테스트 할 수 없습니다 EC VI에 CA3에 DG에 EC II에서 기능 트라이 시냅스 회로가 필요합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 구체적으로 공동의 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는인지 성능을 테스트하기 위해 행동 테스트로 SPS-BM을 고안했다ntrol 동물 및 NF-κB 억제 다음 IκB / TTA 슈퍼 억제 모델. 중요한 것은, MWM 또는 BM 대조적으로, SPS-BM은 신경의 손상으로 인해 발생하는 미묘한 행동 적자를 공개 할 수 있습니다. 공간 패턴 분리가 E​​C II와 DG와 CA3와 CA1과 EC VI 사이의 기능 회로에 엄격하게 의존하기 때문에,이 테스트는 내 잠재적 인 신경의 변화, 이끼 섬유 경로의 수정 또는 조직의 항상성의 변화에​​ 매우 민감 DG. 기술적으로, 우리의 테스트의 셋업은 Clelland 등의 연구를 기반으로합니다., 공간적 분리 패턴이 나무 8 팔 레이디 얼 미로 (RAM) 19를 사용하여 테스트 한에서. 우리의 수정 된 설정에있는 8 개의 팔은 일곱 동일한 노란색 식품 하우스로 대체되었다. 요약하면, 방법은 해마, 이끼 섬유 돌기, 신경 세포 드에게 내 doublecortin 발현 (DCX +) 세포의 분석을 포함하여, 여기에 표시ATH 특히 SPS-BM 여기서 제시된, 성인 신경에 영향을 도입 유전자를 도입 한 다른 마우스 모델 연구에 적용될 수있다. 또한 응용 프로그램이되는 약물의 연구와 DG 및 공간 패턴의 분리에 미치는 영향을 측정을 포함 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Moria MC17 퍼포레이티드 스푼&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>뇌 제거</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>뇌 제거</td></tr><tr><td>수술용 가위&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>뇌 제거</td></tr><tr><td>수술 용 가위&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>뇌 제거</td></tr><tr><td>Dumont #5 겸자</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>뇌 제거</td></tr><tr><td>SuperFrost 슬라이드</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>면역조직화학을 위한 슬라이드</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>고정액</td></tr><tr><td>TissueTek OCT 화합물</td><td>Sakura Finetek 1004200018</td><td></td><td>뇌 매립</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>IHC 차단</td></tr><tr><td>Normal Rabbit Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>IHC</td></tr><tr><td>차단 anti-Neurofilament-M 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>2H3</td><td>IHC, 희석 1:200</td></tr><tr><td>안티-더블코르틴&nbsp; 항체</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, 희석 1:800</td></tr><tr><td>항-GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, 희석 1:2,000</td></tr><tr><td>항-BrdU 항체</td><td>OBT0030G</td><td>정확한 화학물질</td><td>IHC, 희석 1:2,000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td>, <td>FJ-C</td>, <td>HistoChem</td><td>신경 세포 사멸</td></tr><tr><td>측정 Betadine</td><td>Mundipharma</td><td>D08AG02</td><td>소독제</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>뇌 절편 준비</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>관류</td></tr><tr><td>경질 플라스틱으로 만든 원형 플레이트 (직경 120cm)</td><td>실험실 제작</td><td></td><td>SPS-BM용 무판, 지름 120cm</td></tr><tr><td>Buraton 빠른 소독제&nbsp;</td><td>슈&uuml; lke Mayr</td><td>113 911</td><td>소독제</td></tr><tr><td>비디오 추적 시스템 TSE VideoMot 2 소프트웨어 패키지 포함 VideoMot2</td><td>TSE 시스템</td><td>302050-SW-KIT</td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100의 추적 및 분석&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>투과성화/IHC</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>40 &micro 준비; m brain slices</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>슬라이드 임베딩</td></tr><tr><td>SYTOX green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>식품 펠릿 (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, Version 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 또는 Zen 2011 소프트웨어의</td> 통계적 평가<td>Carl Zeiss</td><td></td><td>소프트웨어 (컨포칼 현미경)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>Fluoro-Jade C 염색용 마운팅 매체</td></tr></tbody></table>

nf-κb에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

해마는 일시적인 기억의 형성 및 통합에 중요한 역할을하며, 공간 방향. 역사적으로, 성인의 해마가 포유 동물 뇌의 매우 정적 인 해부학 적 영역으로 조회되었습니다. 그러나, 최근의 연구 결과는 해마의 치아 이랑은 기존의 연결 회로의 수정뿐만 아니라, 성인 신경뿐만 아니라 포함, 성인의 엄청난 가소성의 영역임을 증명하고있다. 이 소성은 전사 인자 NF-κB가 중요한 역할을 담당하는, 전사 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 성인 신경, NF-κB 활성의 전뇌 특정 신경 세포의 억제를위한 형질 전환 마우스 모델을 사용할 수를 연구하고 조작 할 수 있습니다. 본 연구 방법은 구조적 측면, 신경 세포의 사멸 및 전구 확산,인지 의미, whic 포함하여 NF-κB에 의존하는 신경의 분석에 대해 설명합니다H는 특히 치아 이랑 (DG)에 의존하는 행동 테스트, 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)을 통해 평가되었다. SPS-BM 프로토콜은 단순히 성인 해마 신경의 특정 유전자의 영향을 평가하기 위해 설계된 다른 트랜스 제닉 동물 모델에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 또한, SPS-BM는 약리학 제제를 사용하여, 예를 들면, DG 의존 학습을 조사하고 조작 겨냥한 다른 실험 설정에서 사용될 수있다.

IκB /의 교배 - 그리고 TTA 유전자 변형 마우스 라인은 해마에서 NF-κB 활성의 조건 억제에 이르게한다. 이중 형질 전환 마우스 (그림 1A)에서 IκBα-AA1-유전자의 발현을 조사하기 위해, 뇌 절연, 저온 절단 및 GFP (녹색 형광 단백질)에 대한 항체를 사용하여 염색 하였다. 공 초점 레이저 주사 현미경은 CA1과 CA3 지역에서 유전자의 고 발현을 공개하고, DG (그림 1B). IκBα-AA1-유전자는 유형-2B 전구 세포로 표현하고, 중간 미성숙 한 상태에서 성숙한 과립 세포에서 활성화되어 있습니다. 해마 신경 인성 영역에서 CAMKIIα 중심 IκBα-AA1을 표현하는 최초의 세포 유형을 확인하려면, IκB / TTA 동물에서 해마의 저온부는 doublecortin에 ...

NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

이 절차의 전반적인 목표는 성인 뇌에서 전사 인자 NF kappa B의 기능을 조사하는 것입니다. 이것은 뉴런에서 NF kappa B 활성을 특이적으로 억제하는 형질전환 마우스를 먼저 육종함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 공간 패턴, 분리 또는 헛간, 미로를 사용하여 NF 카파 B 억제의 행동 결과를 테스트하는 것입니다.세 번째 단계는 동물을 조심스럽게 풍부하게 먹이고, 뇌를 제거하고, 뇌를 적절히 절단하는 것이다. 마지막 단계는 면역 염색을 통한 이끼 낀 섬유 투영을 시각화하는 것과 같은 조직학적 및 구조적 효과를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 행동 검사와 조직학을 사용하면 치상회(dentate gyrus) 의존 학습의 변화와 관련 조직의 구조적 변화를 연관시킬 수 있습니다.Mars Vase와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 공간 패턴 분리 결합 MA가 이 뇌 영역의 신경 퇴화 및 재생뿐만 아니라 아동 의존 학습 과정에 반대하는 것을 구체적으로 측정할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 특수 패턴 분리로서의 학습과 같은 성인 신경 발생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미로 시연은 제 연구실의 기술자인 Angela Kula가 수행할 것입니다.관류는 연구원인 Peter Hyman이 발표할 예정입니다. 그런 다음 뇌 절편은 Ulrich KA 기술자가 보여줍니다. 마지막으로, 컨포칼 주사 현미경은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Jeanine Muah가 공간 패턴 분리를 수행합니다.Barnes Maze 국제 및 지역 지침에 따른 행동 테스트. 이 분석을 위해서는 최소 6개월 된 수컷 마우스만 사용하는 것이 중요합니다. 각 테스트 시리즈에 대해 동물은 생후 4일 이내여야 하며 동일한 작업자가 테스트 전에 모든 테스트를 수행해야 합니다.쥐는 단 음식에 의해 동기 부여가 될 수 있도록 표준 식단을 먹여야 합니다. 먼저 테스트를 설정하려면 단단한 플라스틱으로 만든 직경 120cm의 흰색 플레이트를 구합니다. 추가 미로 큐는 다양한 재질로 만들 수 있으며 모양이 다를 수 있습니다.중요한 것은 동물이 달리는 바퀴가 명확하게 인식할 수 있도록 높은 대비를 가져야 한다는 것입니다. 사다리와 터널은 모두 좋은 신호입니다. 적당히 강렬한 여러 개의 네온 형광등 아래에 플레이트를 배치하여 쥐가 빛에서 벗어나도록 동기를 부여하십시오.실내는 습도가 조절되어야 하며 섭씨 22도의 일

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

성인 동물 신생아 이가있는 과립 세포의 통합을 연구하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 생체내 기능 통합 확인할 수 electrophysiological 녹음 뒤에 신생아 뉴런을 라벨 설계 레트로 바이러스를 사용합니다.

성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

성인 태생 포유류의 신경 세포의 기능은 조사의 활성 영역 남아있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생을 억제한다. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR)를 사용하여, 특정 신경 전구 인구 입체 해부 타겟팅 이제 성인 신경의 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다.

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 중요한 단계입니다. 여기에 설명되는 프로토콜은 DNA / 작은 머리핀 RNA (shRNA를) nucleofection 및 설치류 출생 주동이의 철새 스트림에서 격리 neuroblasts와 3D 마이그레이션 분석을 사용하여 neuroblast 마이그레이션 후보 규제 기관의 역할을 조사 할 수 있습니다.

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

여기에 제시된 것은 형광 활성화 핵 (FAN) 분류를 통해 대부분의 뉴런을 배제하는 마우스 치아 이랑에서 분리 된 단일 핵을 서열화하는 방법입니다. 이 접근법은 고품질 발현 프로필을 생성하고 신경 줄기 세포와 같은 희소 한 집단을 포함하여 틈새 시장에서 대표되는 대부분의 다른 세포 유형에 대한 연구를 용이하게합니다.

해마 신경인성 틈새를 연구하기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱과 결합된 뉴런의 형광 활성화 핵 음성 분류

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

배우세요 NF-κB 의존 성인 해마 신경 발생 조작 및 분석 방법을 마우스 모델에서. 공간 패턴 분리-바른즈 미로 행동 테스트와 조직학 분석을 통해 치아상회 의존 학습과 구조적 변화를 연관 짓는 기술입니다.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

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