Name: 에있는 고도 불포화 지방산의식이 보충제 예쁜 꼬마 선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 고도 불포화 지방산을 식이 보충하는 방법을 통해 지방산 기능과 생리적 영향을 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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우리는 원고에 도움이 코멘트 대표 결과 그림 3과 제이슨 와츠와 크리스 웹스터에 표시된 예비 실험을 수행하기 위해 크리스 웹스터 감사합니다. 이 연구를위한 자금 조달은 JLW에 건강의 국립 연구소 (미국) (R01DK074114)에서 교부금에 의해 제공되었다. 이 작품에 사용 된 일부 선충 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40의 OD010440)에 의해 재정 지원 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다.

고도 불포화 지방산은 열, 빛과 산소에 민감합니다. 지방산의 보충 판을 준비 할 때 따라서주의가 필요 지방산 과잉 열과 빛에 노출되지 않도록. 0.1 % TERGITOL (NP-40)를 함유 NGM 매체 지방산 나트륨 염은 일정한 교반하면서 첨가 된 후, 오토 클레이브와 부분적으로 냉각된다. 플레이트는 어둠 속에서 건조 할 수있다. C.에 의해 지방산의 흡수 다음, 가스 크로마토 그래피로 모니터링 할 수있다 elegans의 이러한 플레이트 상에 배양 하였다. 1. 지방산 보충 미디어의 제조 <ol><li> 적절한 크기의 플라스크에 미디어 구성 요소를 측정한다. 1 L 당 17g 박토 한천, 2.5 g의 트립 톤, 3g의 NaCl, 에탄올 1 ㎖ 5 ㎎ / ㎖의 콜레스테롤, 물에 녹여 10 ㎖의 10 % TERGITOL를 추가합니다. </li><li> 밀리 포아 물 최종 원하는 볼륨의 80 %를 추가하고 다른 수와 동일 (빈 유리 병들과 함께 미디어를 압력솥지방산 피 시험 농도)뿐만 아니라, 적절한는 눈금 실린더. </li><li> 55 ° C로 설정 물을 욕조에 차가운 미디어 매체는 유리 바이알을 오픈 깨는 안전 예방책을 사용하고 유리 입자가 지방산과의 혼합하지 않는 보장함으로써 지방산 나트륨 염 작업 원액을 제조 냉각된다. 100 ㎜ 작업 주식을 할 수있을 정도로 충분한 지방산을 달다. </li><li> 정제수 100 ㎜의 최종 농도 지방산 해결책을 가져올. 완전 지방산 나트륨 염을 용해하는 것은 전형적으로 약 20-30 분 걸린다. 불활성 가스와의 접촉은 산화를 방지하기 때문에, 아르곤 또는 질소와 지방산의 작업 스톡 퍼지. 유리 병 캡 미디어가 식을 때까지 어둠 속에서 작업 주식을 저장합니다. </li><li> (선택 사항) RNAi의 매체가 요구되는 경우, 암피실린을 측정하고 여기에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG) 해법. </li><li> 한천은 55 ℃로 냉각되면 1 L 당 추가 C : 11 M 망초의 ML, 1 M 염화칼슘 1 ㎖ 및 인산염 완충액 25 ㎖ (1 L 당 108.3 g의 KH 2 PO 4와 35.6 g의 K 2 HPO 4 멸균). 필터 살균 암피실린 및 IPTG 솔루션 RNAi의 판을 만드는 경우를 추가합니다. 플레이트의 모든 유형의 경우, 1 L.로 최종 미디어 볼륨을 가지고 멸균 물을 </li><li> 불 가까이, 멸균에 미디어를 전송하고 적절하게 눈금 실린더 크기의 다음 원하는 볼륨에 따뜻한 멸균 물을 추가합니다. 다시 초기 플라스크에 미디어를 전송하고 교반 혼합한다. </li><li> 화염 가까이에, 오토 클레이브로 측정하여 테스트 할 농도의 수와 같은 병의 번호로 미디어를 전송하고 적절하게 눈금 실린더 크기. 지방산 작업 재고가 완전히 용해 될 때까지 수욕을 사용하여 액체로 분주 미디어를 유지한다. </li><li> 미디어 터치 따뜻한,하지만 섹시하지가 될 때까지 저어 접시와 혼란에 하나의 병을 놓습니다. 충분히 자신을두고 있는지 확인지방산 원액에 저어 미디어가 응고를 시작하기 전에 플레이트를 넣는 시간. 볶음 판은 온도 제어가있는 경우 55 ° C.로 설정 </li><li> 원하는 최종 농도의 용지에 100 ㎜ 지방산 작업 주식을 희석. 볶음 미디어는 흰색 침전물 때까지 용액 (약 1 분)에 있습니다. 미디어는 여전히 그 후 약간 흐린 수 있습니다. </li><li> (선택 사항) RNAi의 미디어가 2 mM의 최종 농도 ㎖ 및 IPTG 0.1 ㎎ /에 추가 암피실린을 원하는 경우. </li><li> 8 60mm 판 당 미디어의 ML 100 mm 플레이트 당 미디어 25 ㎖를 추가, 자동 피펫 원조와 멸균 25 ML 피펫을 사용하여 미디어를 붓는다. 나머지 병의 단계를 쏟아 지방산 또한 플레이트를 반복합니다. </li><li> 한천은 고형화 후, 광 산화로부터 보호하기 위해 잘 배출 카세트 실온 상자 또는 저장소와 지방산 보충 플레이트를 커버. </li><li> 씨 E. 대장균 OP50 접시 건조 한 지 이틀 판에.60mm 판의 경우, (37 ° C에서 성장) 하룻밤 OP50 문화의 피펫 300 μL. RNAi의 플레이트가 부어 된 경우 플레이트가 나흘 동안 건조 후, RNAi의 박테리아의 300 μL와 씨앗. 플레이트 건조 시간으로 인해 다양한 실험실 환경에서 습도의 차이에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 세균 잔디가 건조되는 동안 실온에서 어두운 환경에서 번호판을 품어. </li></ol> 2. DGLA의 보충에 의해 생식 세포의 파괴를 유도 <ol><li> C. 0.3 mM의 DGLA (20시 3분 N-6)을 포함 접시에 성장 엘레 인해 모두 애벌레 단계 성인 선충의 생식 세포의 파괴로 멸균된다. <ol><li> 알칼리 차아 염소산 용액으로 임신하는 자웅 동체를 처리하여 L1 유충의 동기화 된 인구를 준비 (10 ㎖ 솔루션 : 5M 수산화 나트륨, 가정용 표백제의 2.5 ㎖, 7 ㎖의 H 2 O 0.5 ㎖). 조심스럽게 어른 벌레까지이 솔루션에서 임신하는 자웅 동체 바위의 용해. 계란은 보존되고, 저속 원심 분리에 의해 펠릿 화 될 수있다. </li><li> (3g의 KH 2 PO 4, 6g HPO 4, 5g의 NaCl, 1 ㎖ 1 M 망초, H 2 O L.는 고압 증기 멸균 후 망초로 추가 1 2 NA) M9 버퍼에 계란 준비를 3 회 반복한다. 충분한 산소를 제공하기 위해 밤새 진탕 M9 버퍼와 바위의 5 ML의 최종 볼륨에 15 ㎖의 플라스틱 관에서 계란을 재현 탁. </li><li> L1 유충 이틀 RNAi의 세균을 도금 한 후 OP50, 또는 하루 파종 후 보충 판에 추가해야합니다. 그들은 성인의 단계에 도달 할 때까지 사흘 동안 20 ° C에서 벌레를 품어 나. </li></ol></li><li> 어른 벌레는 자궁에서 개발 태아를 시각화하기 위해 충분히 높은 배율과 해부 현미경을 사용하여 무균 득점 할 수있다. 성공적인 생식 세포의 손실은 계란의 명확한 자궁 무효로 표시됩니다. </li><li> 웜은 또한 고정하고 핵산으로 염색하여 획득 할 수있다생식 세포의 핵의 시각화 및 개발 배아를 용이하게 CID 염료 diamindinophenylindole (DAPI). 빠른 DAPI의 얼룩은 watchglass 9 M9 버퍼의 하락으로 벌레를 선택하여 달성된다. <ol><li> 0.2 NG / m의 1 ㎖와 홍수 시계 유리. DAPI 95 % 에탄올 용액에 약 5 분 동안 앉아 보자. </li><li> 슬라이드에 VectaShield 한 방울로 웜을 선택하고 coverslip을 커버. </li><li> 최적의 염색에 대한 어두운 하룻밤에 4 ° C에서 인감 커버 슬립 및 저장하지만 슬라이드는 즉시 볼 수 있습니다. 존재 또는 UV 램프 및 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하는 생식 세포 핵의 유무에 대한 점수. </li></ol></li></ol> 3. 가스 크로마토 그래피에 의해 지방산 흡수를 확인 C.의 전체 지방산 조성물 엘레은 분리 가스를 사용 CHR 정량화 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)의 제조에 의해 결정될 수있다omatography 4. <ol><li> 물 접시 오프들을 세척 및 실란 13mm × 100 mm 유리 나사 정상 관에 전송하여 500 ~ 1,000 어른 벌레를 수집합니다. </li><li> 벌레가 중력에 의해 정착하자, 다음 유리 파스퇴르 피펫으로 가능한 한 많은 물을 제거합니다. </li><li> 물에 한 번 벌레를 세척 한 후 다시 가능한 한 많은 물을 제거합니다. </li><li> 장의 이미지 수욕에서 1 시간 동안 70 ° C에서 1 2.5 % H 2 ㎖의 메탄올 SO 4, 다음 열을 추가하여 형성된다. </li><li> 물을 욕조에서 튜브를 제거하고 1 분 동안 냉각. </li><li> 1.5 ㎖의 물 및 헥산 0.25 ㎖를 추가하여 장의 이미지의 압축을 풉니 다. </li><li> 요점을 되풀이 튜브와 적극적으로 흔들어. </li><li> 수성 용매에서 헥산을 분리하는 최대 속도로 1 분 탁상 임상 원심 분리기에서 원심 분리기 튜브. </li><li> 수성 단계 중 하나를 전송하지 않도록주의하고, GC 유리 병 안에 GC 유리 병 삽입에 헥산 (꼭대기 층)를 전송합니다. GC의에 대한(분석), 헥산에 대단한 호평 1-2 μL은 장의 이미지 분석에 적합한 극성 모세관 가스 크로마토 그래피 칼럼에 주입된다. 애질런트 7890 GC 인젝터는 1.4 ㎖ / 분의 유속으로, 250 ° C로 설정되고, GC 오븐은 1 분 동안 유지되는 130 ° C의 초기 온도, 프로그래밍된다. 그 후, 온도는 10 ° C / 분까지 190 ° C를 램핑 된 후 210 ° C까지 5 ° C / 분에서 다시 램핑 및 추가 1 분 동안 유지. </li><li> , DGLA의 흡수가 발생했습니다 확인 C의 식별을위한 본격적인 표준을 사용하여 불꽃 이온화 검출 (FID) 또는 질량 분석기 (MS) 검출에 의해 장의 이미지를 분석하려면 지방산 엘레 간스. </li></ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 C의 보충하는 방법을 설명 식이 불포화 지방산의 elegans. 위에서 언급 한 바와 같이 된 PUFA의 이중 결합의 반응 특성이 지방산은 열과 빛 (11)을 통해 산화에 민감하게 반응하는 원인이되기 때문에주의를 PUFA 보충 판의 제조에주의해야합니다. 산화를 방지하기 위해, 용지가 어두운 환경에서 55 ° C 저장 플레이트로 냉각되면, 액체 한천 배지에 PUFA을 추가하는 것이 중요하다. 기타 C.에 유리 지방산을 소개했다 엘레 DMSO 또는 에탄올 캐리어를 사용하여, 또는 다른 직접 외음부 12-14 마이크로 인젝션에 의해 지방산을 추가하여. 돌연변이 표현형의 부분 구조는 TERGITOL (NP40) 14 ~ 15를 사용하지 않고 성장판의 지방산 섭취에 의해 달성되었다. C.에 지방산을 소개하는 효과적인 다양한 방법이 ...

지방산은 세포막의 필수 구조적 구성 요소뿐만 아니라 효율적인 에너지 저장 분자이다. 또한 지방산은 리파제에 의해 세포막에서 절단 될 수 있고, 효소 ​​적 시그널링 이펙터 하나를 생성하도록 변형 될 수있다. 자연적으로 발생하는 고도 불포화 지방산 (PUFAs에)는 두 개 이상의 시스 이중 결합을 포함하고 있습니다. 오메가 -3 지방산과 오메가 -6 지방산은 지방산의 메틸 말단에 대하여 이중 결합의 위치에 기초하여 서로 구별된다. 건강한 식단은 오메가 -6와 오메가 -3 지방산을 모두 필요로한다. 그러나, 서양 식단은 오메가 -6 지방산과 오메가 -3 지방산이 가난한 특히 풍부하다. 높은 오메가 -6 오메가 -3 지방산 비율은 심장 혈관 및 염증성 질환의 위험이 증가하지만, 특정 지방산의 정확한 유익하고 해로운 기능이 잘 이해되지와 연관된다. 거위 Caenorhabditis의의 ELEGA그것은 오메가 -3 불포화, 대부분의 동물 3,4 부재 활동 등 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생성하는 데 필요한 효소를 모두 합성 때문에 NS 지방산 기능 연구에 유용하다. 지방산 불포화 화 효소 결핍 돌연변이 발생 및 신경 학적 결함 4-6의 범위에 이르는, 특정 된 PUFA를 생산하지 못한다. 식이 지방산의 생리 학적 효과를 연구하기 위해, 우리는 C.에 돌연변이 및 RNAi의 노크 다운 기술을 모두 사용하여 유전자 분석과 호환되는 생화학 적 분석을 개발했다 엘레. 특정 된 PUFA와 보충제는 이전에 붓는 한천 배지에 지방산 나트륨 염 용액을 첨가함으로써 달성된다. 이는 E. 의해 PUFA 흡수 초래 이 세균의 세포막에 축적 대장균 음식 소스. C. 엘레는 PUFA 함유 박테리아를 섭취하고,이식이 보충제으로 결함을 구출하기에 충분하다PUFA가 결핍 된 돌연변이 체의 TS. 대부분 지방산 보충제 그러나 특정 오메가 -6 지방산, 특히 디 호모-γ 리놀렌산 (DGLA, 20시 3분 N-6) C.의 영구 파괴 원인을 야생형 동물에 아무런 악영향이 없다 엘레 배아 세포 7,8. 기체 크로마토 그래피는 세균성 음식 소스 (OP50 HT115 또는 하나)에서뿐만 아니라, 선충의 보충 지방산의 흡수를 모니터링하기 위해 사용된다. 미디어 세제 TERGITOL (NP-40)의 첨가는 전체 플레이트와 E. 의한 지방산의 더 효율적인 흡수를 통한 지방산의 균일 한 분포를 허용 대장균 및 선충. 우리는 불포화 지방산이 쉽게 박테리아와 C.에 의해 흡수되는 것을 발견했다 엘레 있지만, 포화 지방산의 흡수는 훨씬 덜 효율적이다. 이 문서에서는 지방산과 한천 매체를 보완하는 방법을 단계별로 설명합니다,뿐만 아니라 일의 지방산 흡수를 모니터링하는 방법과 같은 것가스 크로마토 그래피를 사용하여 전자 선충.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(에탄올 내 5 mg/mL)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 디호모감마 리놀레네이</td>트 <td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>따뜻한 멸균 Millipore 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>벌레 <td></td><td></td><td></td><td>수집을 위한 멸균수</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 DGLA 원액용 물</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>물 중 100mg/ml(RNAi 플레이트용)</td></tr><tr><td>이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>물 중 1M(RNAi 플레이트용)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>디아민디노페닐린돌(DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>유리 플라스크</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>교반이 있는 오토클레이브 가능한 유리병</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 유리 눈금 실린더</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>55+ &deg의 수조; C</td><td>정밀 과학 Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Screwcap 갈색 유리 바이알</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>아르곤 가스 탱크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫 에이</td>드 <td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫 (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>FAMEs 유도체화를 위한</td><td>실란화 유리관</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td></tr><tr><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임상 탁상용 원심분리기</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC 크림프 바이알</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC 바이알 인서트</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC 바이알 캡</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>가스 크로마토그래프</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr> 질량 분석 검출기 <tr><td>가스 크로마토그래피용</td><td>Agilent</td><td></td> 5975C 컬럼 Suppelco SP 2380 <td>30m x 0.25mm 용융 실리카 모세관 컬럼</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에있는 고도 불포화 지방산의식이 보충제<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

지방산은 다수의 세포 기능에 필수적이다. 이들은 세포막의 소수성 코어를 구성하고, 다양한 신호 전달 경로에 참여하는 등 효율적인 에너지 저장 분자를 봉사. Caenorhabditis의 엘레 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생산하는 데 필요한 효소를 모두 합성한다. 이것은 간단한 해부학 가능한 유전 도구의 범위와 함께, 그것은 지방산의 기능을 연구하는 매력적인 모델합니다. 식물 지방산의 생리 학적 효과를 매개하는 유전자 전달 경로를 조사하기 위해, 우리는 C.를 보완하는 방법을 개발했다 불포화 지방산 elegans의 다이어트. 보충제 웜의 지방산 조성을 변경하는 효과적인 수단이며, 또한 지방산 결핍 돌연변이 체의 결함을 구하기 위해 사용될 수있다. 우리의 방법은 지방 acidsodium 소금으로 보충 선충의 성장 매체 한천 (NGM)를 사용합니다. 보충 판에있는 지방산은 incorpora가테드 다음 C.에 의해 흡수되어 세균의 음식 소스의 세포막에 보충 박테리아에 먹이 엘레. 또한 보충 웜 발생 지방산 조성의 변화를 모니터링하기 위해 가스 크로마토 그래피 프로토콜을 설명한다. 이것은 C의 크고 작은 집단의 다이어트를 보완 할 수있는 효율적인 방법입니다 엘레,이 방법에 대한 응용 프로그램의 범위에 대한 허용.

C의 보충 엘레 다이어트는 세균의 막에 지방산 통풍 관과 통합하는 세균의 먹이 원의 능력에 의해 제한된다. E.의 능력을 결정하기 위해 그 멤브레인으로 각종 지방산을 동화 대장균 OP50은 OP50가 없음 서플리먼트, 0.1 ㎜ 및 스테아린산 (18시), 올레산 나트륨 (18시 1분 N-9), 및 소듐 DGLA (20 0.3 mM의 농도와 함께 매체 상으로 도금 하였다 : 내지 3n-6). 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 2 일 동안 건조시키고, 3 일 동안 20 ° C에서 배양 하였다. 세균의 잔디가 부드럽게 화염 멸균 주걱 물에 잔디를 긁어 수집 하였다. 세균은 원심 분리에 의해 펠릿 화하고, 2.5 %의 H 2 SO로 처리 절차에 나열된 방법 3 단계 다음 GC / MS로 분석 하였다 지방산 메틸 에스테르를 생성하는 메탄올 중 4. 결과는 불포화 지방산 (올레산과 DGLA)가 t보다 더 높은 양으로 OP50에 통합 함...

&lt;em&gt; 사용 Caenorhabditis의의 우 •은 &lt;/ EM은&gt; 개발 및 생리학에 고도 불포화 지방산의 기능을 탐구 할 수있는 유용한 모델입니다. 이 프로토콜의 &lt;em&gt; C.의 보충의 효율적인 방법을 개시 엘레 &lt;/ EM&gt; 고도 불포화 지방산 다이어트.

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 지방산 기능 및 조절을 연구하기 위해 식이 수단을 사용하여 바다 우아함의 지방산 구성을 변경하는 것입니다. 이것은 불포화 지방산이 있는 상태에서 선충 먹이 공급원을 배양함으로써 달성됩니다. 다음으로 바다의 우아함은 보충된 박테리아를 먹여 지방산을 흡수하고 지렁이에 통합할 수 있도록 합니다.그런 다음 지질은 바다의 우아함으로 바뀝니다. 지방산 조성은 가스 크로마토그래피 질량 분석 분석으로 확인됩니다. 마지막으로, 불포화 지방산을 먹은 후 벌레는 불임 상태에 대한 점수를 매깁니다.발달 행동을 통한 지방산 조성 변화의 생리학적 영향과 유전자 발현의 변화를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 유전자 조작과 식이 기여를 모두 사용하여 지방산 구성을 변경하고 결과를 모니터링 할 수 있기 때문에 바다, 우아함, 개발 및 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 불포화 지방산이 산소 및 고온에 민감하기 때문에 일관된 결과를 얻기 어렵기 때문에 주의하고 신중해야 합니다.1리터의 지방산이 보충된 배지를 준비하려면 다음 성분을 플라스크에 넣고 측정합니다. 최대 800ml의 밀리포어 물을 첨가하고 매체가 섭씨 55도에서 냉각되는 동안 테스트할 각 지방산 농도에 대한 빈 유리병과 적절한 눈금 실린더와 함께 매체를 고압멸균합니다. 유리 입자가 분말에 들어가지 않도록 유리 바이알을 조심스럽게 깨뜨려 열고 100 밀리몰 스톡 용액을 만들 수 있을 만큼 무게를 측정하고 필요한 양의 정제수를 첨가하여 지방산 나트륨 염의 작업 스톡 용액을 준비합니다.다음으로, 아르곤 또는 질소 가스를 사용하여 용액을 퍼지하여 지방산 산화를 방지합니다. 그런 다음 바이알의 뚜껑을 닫고 바이알을 어두운 곳에 보관하는 동안 지방산, 나트륨 염이 용해됩니다. 농업이 다음에 섭씨 55 도까지 냉각되면 화염 근처에서 용액을 멸균 눈금 실린더로 옮겼습니다.멸균수를 최대 1리터까지 추가하기 전에 매체를 플라스크로 다시 옮기고 계속 혼합합니다. 멸균 눈금 실린더를 사용하여 테스트할 각 지방산 농도에 대해 배지의 부분 표본을 하나의 오토클레이브 병으로 옮깁니다. 그런 다음 교반 접시에 병을 따뜻하게 유지하십시오.멸균 25ml 피펫을 사용하여 플레이트를 붓기 전에 적절한 농도의 지방산 원액을 저어주고 플레이트를 응고시킨 후 덮개를 덮고 어두운 곳에서 잘 검증된 장소에서 실온으로 보관합니다. 이틀 후, 대장균 OP 50을 사용하여 플레이트에 씨를 뿌린 다음 박테리아 잔디가 건조되는 동안 실온의 어두운 환경에서 플레이트를 배양합니다. Ravi Hermaphrodites를 알칼리성 차아염소산염 용액으로 처리하여 L 한 유충의 동기화된 개체군을 준비합니다.성충이 녹을 때까지 이 용액에서 GR 자웅동체를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 저속으로 원심분리하여 계란을 펠릿으로 만듭니다. M nine 버퍼를 사용하여 계란을 세 번 씻습니다.그런 다음 15 밀리리터 튜브에 5 밀리리터의 M nine 버퍼와 록에 밤새 다시 매달아 둡니다. 0.3 밀리몰 디 호모 감말린 산 또는 DGLA가 보충된 OP 50 파종 플레이트에 L 유충 1마리를 추가하고 섭씨 20도에서 3일 동안 또는 유충이 성충기에 도달할 때까지 배양합니다. 해부 현미경을 사용하여 성충의 불임 여부를 채점합니다.성공적인 세균 손실은 난자가 없는 투명한 자궁으로 나타납니다. 또는 시계 유리에 있는 M nine 버퍼 한 방울로 웜을 선택하여 점수를 매기십시오. 그런 다음 1밀리리터당 0.2나노그램 dappy 용액 1ml를 사용하여 시계 유리를 가득 채우고 약 5분 동안 배양합니다.배양 후, 커버 슬립으로 덮기 전에 슬라이드의 장착 매체 한 방울로 벌레를 선택하고 커버 슬립을 밀봉하고 밤새 어둠 속에서 섭씨 4도에서 보관하거나 형광 현미경으로 즉시 볼 수 있습니다. 지방산 흡수를 정량화하려면 물을 사용하여 플레이트에서 씻어내고 실리콘화하여 옮겨 500-1000마리의 성충을 수집합니다. 13 x 100mm 유리 나사 상부 튜브.벌레가 중력에 의해 정착하도록 한 다음 피펫을 지나는 유리를 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거합니다. 메탄올에 2.5% 황산 1ml를 넣고 후드 아래에서 1분 동안 냉각한 후 섭씨 70도의 수조에서 튜브를 1시간 동안 가열하고 물 1.5ml와 헥산 0.25ml를 추가하여 프레임을 추출합니다. 튜브의 뚜껑을 다시 닫고 세게 흔듭니다.그런 다음 탁상용 임상 원심분리기에서 튜브를 1분 동안 원심분리하여 수성 용매에서 헥산을 분리합니다. 상단 헥산 층을 GC 바이알 내의 가스 크로마토그래피 또는 GC 바이알 인서트로 옮깁니다. gc로 분석하려면 1-2마이크로리터의 명성을 fame 분석에 적합한 극성 모세관 가스 크로마토그래피 컬럼에 주입합니다.인젝터를 분당 250밀리리터의 유속으로 섭씨 1.4도로 설정합니다. 오븐을 섭씨 130도의 초기 온도로 프로그래밍하고 1분 동안 유지합니다. 그런 다음 섭씨 190도에 도달할 때까지 온도를 분당 섭씨 10도씩 증가시킨 다음 다시 분당 섭씨 5도씩 섭씨 210도까지 상승시킨 다음 DGLA의 흡수가 발생했는지 확인하기 위해 추가로 1분 동안 유지합니다.바다의 우아함을 식별하기 위한 확실한 표준을 사용하여 화염 이온화 검출 또는 질량 분석 또는 MS 검출로 프레임을 분석합니다. 바다 엘레강스 다이어트의 지방산 보충은 박테리아 먹이원이 지방산을 흡수하고 박테리아 막에 통합하여 대장균 OP 50이 다양한 지방산을 막으로 동화시키는 능력을 결정하는 능력에 의해 제한됩니다. OP 50은 이 그림에서 볼 수 있듯이 보충제가 없는 매체에 0.1 밀리몰 및 0.3 밀리몰 농도의 스테릭산, 나트륨 에이트 및 나트륨 DGLA가 함유되어 있으며, GCMS의 Fame 분석은 OLEATE 및 DGLA를 포함한 불포화 지방산이 포화 지방산 스테릭산보다 더 높은 수준으로 OP 50에 통합됨을 보여줍니다.또한, 성충의 지방산 양을 측정한 결과, 포화 지방산의 보충은 지렁이 조직의 상대적인 포화 지방산의 양에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있습니다. 그러나 불포화 지방산을 보충하면 이러한 지방의 상대적인 양이 증가했습니다. 이러한 데이터는 see elegance에서 보충된 지방산의 상대적 축적이 식이 대장균에서 지방산의 상대적 축적과 직접적인 상관관계가 있음을 나타냅니다.이전에 시연한 바와 같이, 이 그래프는 바다의 우아함에서 DGLA 불임 유도의 용량 반응을 보여줍니다. 개체군의 50%가 불임인 지질에서 DGLA의 농도는 약 12%이며, 흥미롭게도 DGLA에 대한 반응은 기생충의 유전적 돌연변이에 의해 변경될 수 있습니다. 인슐린 성장 인자 의존 스트레스 경로가 DGLA 유도 생식 세포 파괴에 영향을 미칠 수 있다는 최근 발견에 근거합니다.DAF 2 인슐린 IGF 수용체 또는 DAF 16 FOXO 전사 인자에 유해한 돌연변이를 포함하는 기생충의 식단을 보충했다 DGLA를 사용하여 각 균주에 대한 무균 점수는 DAF 2 돌연변이가 두 DGLA 농도 모두에서 야생형 기생충에 비해 유도 생식 세포 손실이 거의 또는 전혀 없이 생식력이 있음을 보여주었다. 대조적으로, 비활성 vox O가 있는 DGLA 보충제 지렁이는 0.15 밀리몰의 지방산이 포함된 플레이트에 먹이를 주었을 때 야생형에 비해 무균 지렁이의 비율이 더 높았습니다. 이 절차에 따라 연구원들은 유전자 발현 연구, 행동 분석, 발달 또는 생식 분석과 같은 보충된 바다 우아함을 사용하여 수많은 분석을 수행할 수 있습니다.이러한 분석은 이러한 과정에서 특정 지방산의 역할을 밝힐 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바다 우아함의 지방산 구성을 변경하는 데 사용할 수 있는 지방산 보충 매체를 지속적으로 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에 단단한 판 기반식이 제한을 수행하는 프로토콜을...

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

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에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

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에이<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 영양 상태 기반 구리 혐오 검정

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자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

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예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 고도 불포화 지방산을 식이 보충하는 방법을 통해 지방산 기능과 생리적 영향을 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 활용됩니다.

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