Name: 바닥 플레이트 출시 신호의 기능적 특성을 평가하기 위해 에어컨 중간의 절연 층 플레이트 조직과 생산의 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 마우스 배아 E 12.5 척수에서 바닥판을 분리하여 플라스마 트롬빈 매트릭스에서 배양하는 방법입니다. 이 기술은 바닥판 조건배양액을 생산하여 척수 조직에 적용하고 생화학적 분석을 통해 신경 발달 신호를 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 그들의 도움을 카린 Kindbeiter, 뮤리엘 Bozon 및 Florie 위 Reynaud 감사합니다. 작품은 CNRS, ANR YODA 프로그램과 Labex DevWeCan에 의해 지원됩니다.

1 일 1. E12.5 마우스 배아에서 척수 바닥 플레이트 (FP)의 해부 참고 : 전체 절차는 멸균 조건의 사용을 필요로한다. 이것은 오염을 피하기 위해 해부 후드 절개를 수행하는 것이 바람직하다. 후드의 표면은 에탄올로 청소해야합니다. 모든 해부 악기 멸균 페트리 접시에 소독 및 보관해야합니다. 액체 (매체, 해부 매체는) 밀폐 보관하고 얼음 욕조에 넣어해야합니다. 각각의 배아 개별 신선한 하락에 수집되어야한다. 이 조직 보존을위한 중요합니다. 해부는 뒤몽 # 5 포셉으로 수행된다. 요리, 그립 후뇌에 손상없이 탯줄 또는 머리 사이의 배아를 전송합니다. 그것은 성공적으로 절개를 완료하기 위해 척수 손상되지 중요합니다. 준비 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) -6.5 %의 포도당과 실내 온도 neurobasal 매체. 1.1 척수의 해부 동물은 유럽 지침 다음 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique의 동물 관리 지침에 따라 처리됩니다. 안락사의 방법은 자궁 경부 전위, 그것은 목에 압력을 적용하고 뇌에서 척추 탈구로 구성되어 있습니다. 이 방법은 마우스 동물 모델에게 추천하고, 신속하고 효율적인 방식으로 수행 될 수있다. <ol><li> 임신 (E0.5 = 첫 날 다음 매트)의 E12.5에서 임신 한 쥐를 안락사. 마우스 복부 측면을 위로 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 적시십시오. Adson 집게와 복부의 피부를 조이고 수술 가위로 피부와 복막 레이어를 잘라. 절개를하고 복강을 노출 마우스의 양측에 잘라 사용. </li><li> 배아의 문자열은 마우스의 양쪽에 존재한다. UTE의 하나의 뿔을 잡고두 개의 배아와 외부 부분에서 시작을 해부 사이의 조직에서 RUS. 얼음 차가운 PBS와 100mm 페트리 접시에 그대로 자​​궁을 전송합니다. </li><li> 여분의 배아 조직에서 배아를 추출합니다. 포셉 두 쌍의 태반 조직 (어두운 빨강)을 잡고 조직을 찢어 자궁 주머니에서 배아를 제거하기 위해 부드럽게 잡아 당깁니다. </li></ol> 참고 : 더 나은 보호를 위해, 자신의 자궁 주머니 하나 하나의 배아를 수집합니다. <ol start="5"><li> 다음 단계는 양안 돋보기 및 해부 후드 아래에 이루어집니다. 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 드롭 한 배아를 놓습니다. </li><li> 집게를 사용하여 배아 목을 벨. </li></ol> 참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 다음 단계에 중요합니다. <ol start="7"><li> 실험에 직면 앞쪽 부분에 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다. </li><li> 피부를 꼬집어집게 일쌍와 다른 쌍을 사용하여 태아의 피부을 당깁니다. </li></ol> 주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다. <ol start="9"><li> 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 &quot;아래로 핀&quot;. 다른 집게는 피부를 잡아 배아의 주동이의쪽으로 끌어와. 척수는 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 지금 열려 있습니다. </li><li> 오른쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. </li><li> 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (집게가 척수 손상을 방지하기 위해 폐쇄 개최한다)에서 집게를 밀어 넣습니다. 집게는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 움직임을 분리하기에 충분하다조직과 후근 신경절 (DRG)를 둘러싼. </li></ol> 참고 : 출발 연결된 주변 조직 따라서 다음 단계 중에 파괴의 가능성을 증가, 척수에 무게를 추가 할 수 있습니다. <ol start="13"><li> 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 신선한 방울의 고립 된 척수를 놓습니다. </li><li> 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다. </li><li> 한 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 &quot;핀 내려&quot;, 두 번째 집게는 수막을 잡아와. 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨. </li></ol> 참고 : 움직임 척수의 분열을 방지하기 위해 천천히 일정해야한다. 진동 운동은 수막의 분리를 용이하게 할 수있다. 1.2 FP 해부 <ol><li> 한 집게와 후뇌 핀치. </li><li> FP는 중앙 TRA이며조직의 nsparent 부분. 메스를 사용하여 바닥 판을 잘라. </li></ol> 참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽 바닥 판의 왼쪽을 잘라. <ol start="3"><li> 실온에서 Neurobasal 배지에서 해부 FP를 보존. </li></ol> 2. FP 문화 참고 : 모든 단계는 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 신선한 매체와 갓 해동 보충 및 시약을 사용합니다. 멸균 유리 커버 슬립, 따뜻한 neurobasal + B27, 플라즈마 및 HBSS - 트롬빈을 준비합니다. 2.1 FP 문화 <ol><li> 100mm 배양 접시에 각각의 coverslip의 중심에 피펫 20 μL 플라즈마의 여러​​ 불임의 coverslips를 놓습니다. </li><li> 각 플라즈마 드롭 2-4 FP를 전송하고 플라즈마 드롭 옆에 20 ㎕의 HBSS - 트롬빈을 추가하고 조심스럽게 섞는다. 커버 슬립을 유지실온에서 충분히의 최소 혈장의 응고를 허용하기 위해. </li></ol> 참고 : 부분 절개의 경우 완전 해부 등의 경우 이전 두 FPS를. 피펫 팁 천천히 혼합 FP 외식과의 접촉을 피하십시오. 플라즈마 응고 응고의 표시로 몇 μm의 후퇴. 응고 플라즈마 응고의 분리를 방지하기 위해, 중간에 중지 할 수 없습니다해야합니다. <ol start="3"><li> 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송하고 Neurobasal + B27의 500 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 48 시간을 품어 </li></ol> 3 일 3. FP 된 배지 (FP의 CM) 수확 참고 : 수확은 조직 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 상층 액을 배양 요정 중에 오염이나 바닥 플레이트 (의미 부동 한 경우에는 사망 할 수있는 경우OD)을 잘에서 FP의 CM을 수확하지 않습니다. 3.1 FP 센티미터 수확 <ol><li> 각 우물에서주의 깊게 매체를 수확. </li></ol> 참고 : 중합 플라즈마 트롬빈 혼합 또는 FP 조각을 피펫하지 마십시오. <ol start="2"><li> C. -80 °에서 100 ㎕의 분취 량을 저장 </li></ol> DAY 4 4. E12.5 마우스 배아에서 척수 Commissural 뉴런의 해부 참고 :이 제제는 무균 조건 하에서 수행 할 필요가 없습니다. 배아를 수집하기 위해 위에서 설명한 절차를 따르십시오. 준비 차가운 PBS, 차가운 HBSS - 6.5 %의 포도당과 차가운 neurobasal. 4.1 척수의 해부 <ol><li> 집게를 사용하여 배아 목을 벨. </li></ol> 참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 중요하다다음 단계. <ol start="2"><li> 실험에 직면 전반부와 신선한 드롭 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다. </li><li> 한 집게로 태아의 피부를 조이고 다른 하나는 피부을 당깁니다. </li></ol> 주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다. <ol start="4"><li> 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 &quot;아래로 핀&quot;. 다른 겸자로, 피부를 잡아 척수를 노출하는, 배아 주동이쪽으로 당긴다. </li><li> 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 이제 노출 열려 있습니다. </li><li> 오른쪽에있는 배아 전방 측을 배치합니다. </li><li> 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (폐쇄 집게를 유지)에서 집게를 밀어 넣습니다. 에CEPS는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 운동은 인접 조직과 후근 신경절 (DRG)를 분리하기에 충분하다. </li><li> 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 새로운 드롭에 고립 된 척수를 전송합니다. </li><li> 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다. </li><li> 두 번째 집게가 수막을 잡아 함께, 하나의 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 &quot;핀 내려&quot;. 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨. </li></ol> 4.2 Commissural 신경 해부 <ol><li> 한 집게와 후뇌 핀치. </li><li> Commissural 신경 세포는 척수 (등쪽)의 대부분의 측면 부분에 위치하고 있습니다. 미세 메스이 측면 부분을 잘라. </li></ol> 주 : 척수의 지느러미 부분 셀 (D)의 차이에 의해 복부 부분으로부터 구별 될 수있다ensity, 복부 부분이 불투명하게되고. 참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽과 왼쪽의 작은 길이를 잘라. <ol start="3"><li> 즉시 사용을위한 얼음에 Neurobasal 매체의 해부 조직을 보존. </li></ol> 5. FP의 CM과 Commissural 조직의 치료 참고 :이 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 조직은 각각 1.5 ML 튜브에 수집되어야한다. 냉동 FP 센티미터 한 번만 사용해야합니다. 여러 재 냉동하지 마십시오. 따뜻한 FP의 CM을 준비합니다 (37 ° C). commissural 신경의 5.1먼트 <ol><li> 작은 가위로 commissural 조직을 Dilacerate. </li></ol> 참고 : 최대한 작게 조직을 잘라 세포의 접근성을 강화시킬 수 있습니다. <ol start="2"><li> 상당히 다른 실험 조건 제어 처리 및 FP 센티미터 치료 사이의 조직을 배포합니다. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800 XG에서 조직 조각을 원심 분리기 </li><li> 튜브 사이의 재분할을 확인합니다. </li></ol> 참고 : 조각까지 다시 필요 재분배와 원심 분리기가 동일하게 분배하는 경우. <ol start="5"><li> 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조직에 따뜻한 FP의 CM 및 제어 처리를 추가합니다. </li></ol> 주 : 볼륨 펠렛의 양을 조절할 수 있어야하며, 적어도 두번 펠릿의 양이어야한다. <ol start="7"><li> 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 흔들 <ol start="8"><li> 1 분 800 XG에 원심 분리기 및 처리를 제거합니다. </li><li> 용해 버퍼를 추가 </li></ol> 주 : 볼륨을 조정해야펠릿의 실장 및 적어도 두 펠릿 볼륨이어야한다. <ol start="10"><li> 최대 피펫 아래로 펠렛을 재현 탁 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 와류가 또한 사용될 수있다. <ol start="11"><li> 얼음에 15 분 알을 품다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 유지하고 브래드 분석 (9)와 단백질의 양을 측정합니다. </li><li> 배의 램리 버퍼를 추가합니다. </li><li> 단백질 함량을 변성 5 분 동안 95 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 샘플은 즉시 사용할 수 있습니다 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 <ol start="16"><li> 웨스턴 블롯 (10)에 의한 처리의 효과를 평가한다. </li></ol> 참고 : 전체 단백질의 적어도 50 μg은 각 레인에로드해야합니다.

<ol><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system%3A+how+to+cross+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+floor+plate%3A+multiple+cells%2C+multiple+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The floor plate: multiple cells, multiple signals.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).</li>
<li>Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).</li>
<li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li>
<li>Ruiz de Almodovar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+mediates+commissural+axon+chemoattraction+through+its+receptor+Flk1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1.</a> Neuron. 70, 966-978 (2011).</li>
<li>Charoy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gdnf+activates+midline+repulsion+by+Semaphorin3B+via+NCAM+during+commissural+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance.</a> Neuron. 75, 1051-1066 (2012).</li>
<li>Kiecker, C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organizers+in+patterning+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of organizers in patterning the nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).</li>
<li>Le Dreau, G., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube%3A+a+tale+of+three+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+collaborates+with+netrin-1+to+guide+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord.</a> Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).</li>
<li>Bechara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK-MAPK-dependent+adhesion+disassembly+downstream+of+L1+contributes+to+semaphorin3A-induced+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse.</a> EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어

바닥 판 에어컨 매체의 생산은 바닥 판 출시 신호의 생물학적 특성을 평가하기위한 효율적이고 쉬운 방법을 제공합니다. 플라즈마 트롬빈 매트릭스는 조직의 생존을위한 최상의 조건​​을 제공합니다. 그럼에도 불구하고,이 풍부한 환경 실험의 몇 가지 유형에 대한 제한이있을 수 있습니다. 따라서, 바닥 판 조직은 또한 아가 로스 매트릭스에서 배양 될 수있다. 바닥 판 에어컨 매체의 품질은 GDNF (그림 2), 쉬와 네트 린 (11)로 알려진 바닥 판 출시 신호의 검출에 의해 평가 될 수있다. 에어컨 중간에서 자신의 존재는 서양 얼룩이나 점 오점에 의해 평가 될 수있다. 이 과정에서 세포는 그 나라의 미세 환경에서 공부하고 있습니다. 이 치료에 반응 조직에있는 세포의 종류에 대한 자세한 정보를 방지 할 수 있습니다. 바닥 판은 균일 한 구조, 행동의 농도가 아니므로같은 Wnts으로 살아...

바닥 판은 조상과 postmitotic 세포 계통의 사양에 중요한 역할을 수행하고 축삭 탐색 7,8를 제어, 개발 척수의 잘 알려진 패턴 센터입니다. FP의 CM을 생산하기 위해 여기에 설명 된 실험 절차는 수사관 세포 패턴과 생존의 세포와 축삭 이주, 발달 과정의 다양한 상황에서 바닥 판에서 파생 된 신호의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다. 이러한 FP의 CM의 사용을 설명하기 위해, commissural 신경 세포를 포함하는 등의 척수 조직은 해부 dilacerated 및 FP의 CM로 자극된다. 조직은 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리 될 수있다. 이 바닥 판 발매 신호에 의한 축삭지도 기계의 규정을 조사 할 수 있습니다. dilacerated 신선한 조직의 치료 방법 일 이내에 세포 미세 환경을 보존하는 큰 장점을 보유전자 조직. 따라서 FP의 cm 의해 치료 또는 치료의 종류의 영향은 세포 및 조직 배양 조건에서보다 더 많은 생리적 방법으로 평가된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents Required</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Sigma</td><td>P-3266</td><td>1 mg/ml (H2O 및 여과액에 재구성)</td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>Sigma</td><td>T-4648</td><td>10 mg/ml(H2O 및 여과액에 재구성)</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>50x</td></tr><tr><td>HEPES (260 g/mol)</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5513</td><td>0.5 m, pH 8</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Euromedex</td><td>2189</td><td>1M</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>Complete 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)Sigma</td><td></td> <td>S-6508</td><td></td></tr><tr><td>증류 H 2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 1.시약이 필요합니다. </td></tr><tr><td colspan="4">도구 및 재료</td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson 펜치</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tips 펜치</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Microknives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10136-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 2. 도구 및 재료. </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Dissection and FP culture</td> </tr> <tr> <td>에탄올 70%</td> <td></td> </tr><tr> <td>dissection hood</td> <td></td> </tr><tr> <td>해부 현미경</td> <td></td> </tr><tr> <td>페트리 접시</td> <td></td> </tr><tr> <td>유리 커버 슬립</td> <td>18 mm x 18 mm</td> </tr><tr> <td> 분젠 가스 버너</td> <td></td> </tr><tr>> <24-well plate</td> <td></td> </tr><tr> <td>조직 배양 인큐베이터(37 &deg; C, 5% CO2, 습도 조절)</td> <td></td> </tr><tr> <td>Centrifuge</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">조리법</td> </tr> <tr> <td colspan="2" >FP 배양 배지</td> </tr> <td> <td>Neurobasal</td> <td></td> </tr><tr> <td>B27</td> <td>1/50e 재고에서 희석</td> </tr><tr> <td colspan="2">HBSS-thrombin </td> </tr> <tr> <td>HBSS</td> <td>1 ml </td> </tr><tr> <td>트롬빈 10 mg/ml</td> <td>30 &mu; l</td> </tr><tr> <td colspan="2">용해 완충액 pH pH 7,4</td> </tr> <tr> <td>HEPES (260 g/mol) </td> <td>25 mM</td> </tr><td> <td>EDTA (pH 8) </td> <td>5 mM</ td> </tr><tr> <td>MgCl2 </td> <td>1 mM</td> </tr><tr> <td>글리세롤 </td> <td>10%</td> </tr><tr> <td>IGEPAL (NP40) </td> <td>0.10%</td> </tr>< tr> <td>프로테아제 억제제 칵테일 </td> <td>1x</td> </tr><tr> <td>오르토바나데이트나트륨 </td> <td>0.2 M</td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </tr><tr> <td colspan="2">Laemmli 버퍼</td> </tr> <tr> <td>트리스 0.5 M, pH 6,8 </td> <td>375 mM</td> </tr><tr> <td>SDS</td> <td>6%</td> </tr><tr> <td>글리세롤</td> < td>60%</td> </tr><tr> <td>DTT</td> <td>0.6 M</td> </tr><tr> <td>브로모페놀 블루</td> <td></td> </tr><tr> <td>H2O</td> <td></td> </ TR></tbody> </테이블></td></tr></tbody></table>

바닥 플레이트 출시 신호의 기능적 특성을 평가하기 위해 에어컨 중간의 절연 층 플레이트 조직과 생산의 문화

Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

개발하는 동안, 조상 및 사후 유사 분열 뉴런은 자신의 운명을 통제 인접 지역에서 신호를 수신합니다. 바닥 판은 복부 위치에 뇌실막 운하 안감 glial 세포의 그룹입니다. 바닥 판은 척수에있는 세포 계통의 패턴에 기여 키 morphogens을 표현한다. 나중에 발달 단계에서, 바닥 판은 commissural 축삭 1로 동측의 축삭과 제어 중간 선 횡단의 횡단을 방지하기 위해 장벽 역할을 척수에있는 축삭의 탐색을 조절한다. 이 기능은 여러지도 단서의 분비를 통해 달성된다. 다른 사람들이 현지지도 단서 2,3에 축삭의 감도를 조절하는 지침 수용체 및 다운 스트림 신호를 조절하면서 이러한 신호의 일부는 성장 축삭에 대한 유인 및 방충제 역할을합니다. 여기에서 우리는 deve을의 다양한 바닥 판 파생 된 신호의 특성을 조사 할 수있는 방법을 설명합니다바닥 플레이트 에어컨 매체 (FP의 CM) 4-6의 생산에 따라 lopmental 상황. 우리는 그 다음 축삭의 맥락에서이 FP의 cm의 사용을 예증. 첫째, 척수는 E12.5에서 마우스 배아에서 분리되어 바닥 판은 밖으로 해부 및 플라즈마 트롬빈 매트릭스 (그림 1)에서 재배된다. 둘째 이틀 후, commissural 조직은 E12.5 배아로부터 해부 분쇄 및 FP의 CM에 노출되어 있습니다. 셋째, 조직은 commissural 마커의 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리됩니다.

Commissural 조직은 FP의 CM에 의해 처리하고, 시료는 웨스턴 블롯에있는 수용체 수준의 분석을 위해 처리되었습니다. FP의 CM의 응용 프로그램 (그림 2)을 교차 한 후 중간 선 구충제 Semaphorin3B에 commissural 축삭의 감도를 매개 안내 수용체, PlexinA1의 수준을 높일 것으로 나타났다. 이 FP에 의해 발표 신호가 PlexinA1 수준에게 4,6를 조절하는 것으로 나타났다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50884/50884fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50884/50884fig1.jpg"> 그림 1. 바닥 플레이트를 분리하는 절개 절차의...

바닥 플레이트, 척수 개발 조상에 확산 신호를 제공하고 분화 신경의 중요한 구조이다. 우리는 바닥 플레이트 조정 배지를 생산하는 신선한 척수 조직에 적용하는, 생화학 의해 그 단백질에 영향을 평가하는 방법을 서술.

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

이 절차의 전반적인 목표는 바닥판 컨디셔닝 매체의 생산을 기반으로 다양한 개발 맥락에서 바닥판 파생 신호의 속성을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 E 12.5에서 마우스 배아에서 척수를 분리하고 바닥판을 해부함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 플라즈마 트롬빈 매트릭스에서 바닥판을 배양하여 바닥판 컨디셔닝 매체를 생산하는 것입니다.다음으로, E 12.5에 있는 마우스 배아의 척수를 분리하고 comm, choral neuron을 포함하는 등쪽 조직을 해부합니다. 마지막 단계는 절개된 통신 조직을 바닥판 컨디셔닝 매체 샘플에 대한 양이온 및 노출입니다. 궁극적으로 조직은 웨스턴 블롯과 같은 생화학적 분석을 위해 처리되어 commissural markers 발현을 보여줍니다.이 방법은 발달 생물학 분야에서 zuki 질문을 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 플로어 플레이트에서 방출되는 신호는 세포 지방, 분화, 증식 및 축삭 유도 조직 및 다양한 기원의 세포를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. ZA는 바닥판 상태 매체에 노출되어 절차가 실험실의 A 기술자에게 친절할 것임을 보여줍니다.안락사된 임신 E 12.5 마우스 복부 쪽을 위로 향하게 하여 이 절차를 시작합니다. 복부에 70% 에탄올을 담그십시오. 다음으로 집게로 복부 피부를 꼬집고 수술 용 가위로 피부와 복막층을 잘라냅니다.절개를 하여 복강을 노출시킵니다. 배아의 끈이 마우스의 양쪽에 존재합니다. 두 배아 사이의 조직에서 자궁의 한쪽 뿔을 잡고 바깥쪽부터 해부합니다.그런 다음 온전한 자궁을 얼음 위에 차가운 PBS와 함께 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 여분의 배아 조직에서 배아를 추출합니다. 두 쌍의 집게로 검붉은 태반 조직을 잡고 부드럽게 당겨 조직을 찢고 자궁 주머니에서 배아를 제거합니다.해부 후드에 배아 하나를 차가운 HBSS 포도당 한 방울에 넣습니다. 배아의 목을 베인 후, 배아의 배쪽을 아래로 향하게 하고 앞쪽 부분이 실험자를 향하도록 놓습니다. 한 쌍의 집게로 배아의 피부를 꼬집고 다른 쌍으로 피부를 잡아당깁니다.배아의 앞쪽 부분에서 피부가 완전히 제거될 때까지 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 하나의 집게로 배아의 앞쪽을 왼쪽으로 돌립니다. 배아를 앞쪽에 고정합니다.다른 집게로 피부를 잡고 배부 쪽으로 당겨 척수를 노출시킵니다. 다음으로, 집게의 한쪽 면을 사용하여 아직 척수를 감싸고 있는 수막을 자릅니다. 이제 척수가 열렸습니다

culture-isolated-floor-plate-tissue-production-conditioned-medium-to

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 적어도 24 시간 동안 자극의 다양한 종류에 대한 응답의 문화와 모니터링 인간의 장 점막의 유지 관리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 우리의 방법으로, 조직의 극성이 혀끝의 경로를 통해 생리적 자극 수 있도록 유지됩니다.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

다음 프로토콜은 2차원(2D)과 3차원(3D) 세포 환경 사이의 중간 단계로 사용할 샌드위치와 같은 배양을 조립하는 절차를 설명합니다. 엔지니어링된 시스템은 현미경 검사, 생체 역학, 생화학 및 세포 생물학 분석에 적용할 수 있습니다.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

세포외 기질은 세포의 미세환경을 정의하고 세포 거동 및 표현형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 우리는 세포 유래 세포 외 기질의 분리를 위한 신속한 방법을 설명하며, 이는 현미경, 생화학적, 단백질체학 또는 기능 연구를 위해 다양한 규모에 적용할 수 있습니다.

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

여기에서는 3차원(3D) 세포외 기질에서 IDG-SW3 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양

배우세요 마우스 배아 E 12.5 척수에서 바닥판을 분리하여 플라스마 트롬빈 매트릭스에서 배양하는 방법입니다. 이 기술은 바닥판 조건배양액을 생산하여 척수 조직에 적용하고 생화학적 분석을 통해 신경 발달 신호를 연구하는 데 활용됩니다.

바닥 플레이트 출시 신호의 기능적 특성을 평가하기 위해 에어컨 중간의 절연 층 플레이트 조직과 생산의 문화

더 많은 동영상 탐색