전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

이 절차의 전반적인 목표는 폴리에틸렌 글리콜 및 펩타이드를 메스 아크릴레이트 기와 함께 기능화하여 후속 사슬 중합 및 하이드로겔 합성을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 필로폰 아크릴 무수물과 UN 기능화 전구체를 섬광 바이알에 결합하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로파 에너지를 사용하여 페그 또는 펩타이드를 기능화하는 것입니다.

다음으로, PEG DM을 클로로 메탄에 용해시키거나 수지에서 펩타이드를 절단합니다. 그리고 모든 곁사슬 보호 그룹은 산성 칵테일에서 제거됩니다. 마지막 단계는 PEG DM 또는 메스 아크릴아미드 기능성 펩타이드를 에테르에 침전시키는 것입니다.

궁극적으로 양성자 NMR 또는 Maldi 비행 시간 질량 분석법은 PEG 또는 펩타이드 매크로의 성공적인 기능화를 보여주는 데 사용됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 에이미 반 호브입니다. 저는 로체스터 대학교(University of Rochester)의 의생명공학과에서 박사 과정을 밟고 있는 학생입니다.

PEG를 불화 아크릴과 메스화하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 반응이 훨씬 빠르고 환경 친화적이라는 것입니다. 안녕하세요, 제 이름은 브랜든 윌슨입니다. 저는 University of Rochester에서 화학공학을 전공

이 방법은 페그 디메틸을 사용하여 하이드로겔을 생산하는 방법과 같은 생체 재료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 분자 내 치료 세포의 전달을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 의생명공학과 조교수인 다니엘 베누아입니다. 이 기술의 의미는 합성된 화합물이 세포 및 약물 전달 응용 분야에 사용될 수 있기 때문에 다양한 질병에 대한 치료법을 개발하는 데 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 pred는 대형 유청 보트의 물 오염을 방지하기 위해 필요한 유리 제품을 오븐에서 1시간 동안 건조시켰습니다. 1000에서 100, 000 달톤 사이의 분자량을 가진 5g의 말뚝을 빼내십시오. 존재하는 경우 화학 물질 후드에 있는 섬광 바이알의 뚜껑에서 플라스틱 조각을 제거합니다.

10몰 이상의 메스탄 아크릴 무수물을 찢어진 섬광 바이알에 분배합니다. 그런 다음 바이알에 PEG를 추가합니다. 그런 다음 바이알의 캡을 느슨하게 비틀고 바이알을 전자레인지에 넣습니다.

내열 장갑을 끼고 전자레인지를 최대 전력으로 5분으로 설정하십시오. 30초마다 전자레인지에서 바이알을 꺼냅니다. 그런 다음 캡을 완전히 조이고 샘플을 30초 동안 와류로 만듭니다.

바이알을 전자레인지에 다시 넣기 전에 뚜껑을 풉니다. 용액이 전자레인지에 5분 동안 완전히 전환될 때까지 이 단계를 반복합니다. 전자레인지에서 바이알을 꺼낸 후 뚜껑을 풀고 PEG DM을 실온으로 식힙니다.

그런 다음 PEG DM을 10-15 밀리리터의 디 클로로 메탄에 용해시킵니다. 20분 동안 10 x excess pre dathyl ether에 PEG DM을 침전시킵니다. 7cm 버크너 깔때기와 500밀리리터 플라스크를 사용합니다.

진공 여과에 의하여 나무못 DM를 모으십시오. 다음으로, 여과된 PEG DM을 환기를 위해 캡을 통해 뚫린 대형 게이지 바늘이 있는 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 진공 챔버에 넣고 PEG DM을 밤새 건조시킵니다.

진공 챔버에서 튜브를 제거한 후 빨간색은 PEG DM을 얼음처럼 차가운 다틸 에테르로 DI 클로로 메탄 침전물에 용해시킵니다. 여과 및 수집 후 반응성 메스 아크릴 무수물을 제거하려면 이전과 동일한 방식으로 진공 챔버에서 PEG DM을 건조하십시오. 양성자 NMR 분석을 위해 섬광 바이알에 약 10mg의 PEG DM을 넣고 약 1ml의 중수소화 클로로포름을 추가합니다.

샘플이 용해되면 깨끗한 NMR 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 양성자 NMR 스펙트럼을 수집하고 충분한 데이터 해상도를 얻기 위해 최소 64회 스캔을 위해 실온에서 샘플을 실행합니다. 고체상 합성으로 관심 펩타이드를 합성한 후, 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 DMF에서 수지에 보관합니다.

그런 다음 여과지와 250밀리리터 플라스크가 있는 7cm 버크너 깔때기를 사용하여 여과를 통해 펩타이드 수지를 수집합니다. 섬광 바이알의 뚜껑에서 플라스틱 조각을 제거하고 수지를 바이알로 옮깁니다. 일회용 피펫을 사용하여 수지를 덮을 만큼만 메스아크릴 무수물을 추가합니다.바이알의 뚜껑을 느슨하게 비틀어 바이알에 끼운 후 전자레인지에 넣고 타이머를 3분으로 설정합니다.

최대 전력으로 내열 장갑을 착용하고 15-20초 간격으로 전자레인지에서 바이알을 꺼냅니다. 캡을 완전히 조인 후 15초 동안 샘플을 볼텍스합니다. 바이알을 전자레인지에 다시 넣기 전에 뚜껑을 풉니다.

용액이 전자레인지에 3분 동안 가득 찰 때까지 이 작업을 반복합니다. 바이알 뚜껑을 풀고 소량의 DMF와 7cm 버크너 깔때기를 사용하여 펩타이드 용액을 실온으로 식힙니다. 여과지와 250 밀리리터 플라스크 포함.

바이알에서 펩타이드 수지를 모아 분열시키고 깊은 보호를 합니다. 펩타이드 수지를 새로운 섬광 바이알에 옮겨 0.25 밀리몰의 아르기닌 함유 펩타이드를 추출합니다. 트리, 이소, 프로필렌, 3 개의 6 이산화물, 1 개의 8 옥탄 디올 티올 탈 이온수 및 18.0 밀리리터의 TFA를 각각 0.25 밀리리터씩 추가합니다.

그런 다음 실온에서 4시간 동안 실험실 지진 회전기에서 반응 혼합물을 회전시킵니다. 완료되면 펩타이드를 10배 이상의 사전 냉각 에틸 에테르에 침전시킵니다. 용액을 4 개의 50 밀리리터 원뿔형 튜브 사이에 균등하게 나누고, 3, 200 G에서 4 개의 샘플을 10 분 동안 원심 분리하여 원심 분리 후 펩타이드를 수집하고, 에테르를 디캔트하여 2 개의 50 밀리리터 원뿔형 튜브 사이에 분할 된 100 밀리리터의 신선한 에틸 에테르에 펩타이드를 재현탁시킵니다.

원심분리 과정을 반복합니다. Resus는 펩타이드를 50ml의 신선한 에테르에 두 번 현탁시켜 마지막 원심분리 단계 후 폐 에테르를 디앤트하고 진공 상태에서 밤새 펩타이드를 건조시킵니다. Maldi ToF(Time of Flight) 분석을 위해 샘플을 준비하려면 1.5ml einor 튜브에 펩타이드 1-2mg을 넣고 샘플을 1ml의 maldi 용매에 용해시킵니다.

그 후, multis 용매에 Alpha Sano 4 히드 록시 세라믹 산의 밀리리터 당 10 밀리그램 매트릭스 용액을 준비한다. 펩타이드와 매트릭스 용액을 1:1 비율로 결합하고, 결합된 용액 중 1마이크로리터를 MALDI 시료 플레이트의 세 개의 별도 위치에 배치합니다. 히트 건을 사용하여 얼룩을 말리십시오.

그런 다음 각 샘플을 다시 스폿하고 건조시킵니다. 마지막으로, MALDI 비행 시간 데이터를 수집하고 펩타이드의 말단 말단에 메스 아크릴아미드 그룹의 첨가로 인해 분자량이 몰당 68g 증가한 것을 확인합니다. 여기에 표시된 것은 이 반응을 위해 마이크로파 보조 방법을 사용하여 기능화된 2킬로달톤 선형 PEG DM의 NMR 스펙트럼입니다.

양성자 NMR 분석은 중앙 PEG 양성자에 대한 말단 메타크릴레이트 양성자의 관찰된 비율에서 이론적 비율까지의 기능화 비율을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 전체 기능화 비율은 91%이며 이 PEG DM은 하이드로겔 합성에 사용하기에 적절하게 기능화되었습니다. 펩타이드의 양성자 NMR 분석에서 발생하는 수많은 양성자 피크로 인한 백분율 기능화 계산에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

펩타이드 기능화는 maldi 비행 시간 질량 분석기를 사용하여 더 쉽게 조사할 수 있습니다. 이는 펩타이드 G-K-R-G-D-S-G를 합성하여 메스 아크릴아미드 기능화를 실시한 곳에서, 펩타이드의 작은 부분을 사전 기능화 분자량 평가를 위해 절단한 곳에서, 관찰된 분자량 피크가 몰당 676g에서 발생하는 것을 보여주었으며, 펩티드의 예상 분자량, 펩티드의 나머지 부분은 메타 아크릴아미드 기능화 후 분열 전에 메스 아크릴아미드 기능화를 거쳤습니다. 관찰된 분자량 피크는 몰당 744g에서 발생하며, 이는 필로폰 아크릴아미드 기능화 펩타이드의 예상 중량입니다.

PEG DM과 메타 아크릴아미드 기능성 펩타이드의 기능을 입증하기 위해 PEG 하이드로겔은 0.5 밀리몰라 메타폰의 유무에 관계없이 생산되었습니다. 여기에 표시된 아크릴아미드 기능화 GK R-G-D-S-G는 페그 겔 단독 및 메스 기능화 펩타이드를 함유한 페그 겔에 있는 MSC의 대표적인 위상차 및 살아있는 사형 형광 이미지입니다. MSC는 UN의 기능성 페그 하이드로겔에 부착할 수 없었지만, 세포 접착 펩타이드 RGD를 포함하자 하이드로겔 표면에 부착되어 퍼질 수 있었습니다.

살아있는 죽은 이미지는 시드된 MSC 개체군의 생존 가능성을 나타내지 않습니다. 오히려, 형광 이미지는 부착 세포와 하이드로겔 토폴로지의 작은 변화를 구분하기 위한 것이며, 이는 위상차 미만으로는 어려울 수 있습니다. 흥미롭게도, PEG에 파종된 비확산 세포는 칼슘 AM과 AUM 동질이머 모두에 대해 양성으로 염색되었는데, 이는 이미징 당시 세포가 죽어가고 있었음을 나타냅니다.

PEG 하이드로겔의 많은 장점 중 하나는 페그의 특정 구성을 수정하는 고도로 조정 가능한 특성입니다. 하이드로겔은 연구자들에게 여기에 설명된 바와 같이 탄성 계수와 같은 특성에 대한 높은 수준의 제어를 제공합니다. PEG 분자량과 중량 백분율은 모두 하이드로겔 메쉬 크기, 그에 따른 하이드로겔, 강성 및 캡슐화된 약물의 방출 속도를 제어하는 것으로 알려져 있습니다.

이는 다양한 분자량 PEG dm을 가진 하이드로겔을 생산하고 그에 따른 하이드로겔 계수 및 메쉬 크기를 조사하여 PEG의 분자량을 증가시킨다는 가설을 통해 입증되었습니다. Macer는 하이드로겔 메쉬 크기의 증가를 유발하고 하이드로겔 강성의 감소를 일으켰으며, 하이드로겔 메쉬 크기 및 그에 따른 겔 강성은 무게를 변경하여 제어할 수도 있습니다. PEG 하이드로겔의 비율은 다양한 중량으로 생산되었습니다.

선형 10 킬로달톤 PEG DM의 퍼센트와 하이드로겔 강성 및 메쉬 크기는 여기에 표시된 바와 같이 결정되었으며, PEG의 중량 퍼센트가 증가하면 메쉬 크기가 크게 감소하고 하이드로겔 강성이 증가합니다. 캡슐화된 소 혈청 알부민을 함유하는 하이드로겔은 여기에 표시된 바와 같이 다양한 분자량 페그를 사용하여 형성되었습니다. 소 혈청 알부민 방출은 하이드로겔 내의 더 큰 메쉬 크기의 결과로 더 높은 분자량 PEG DM을 사용하여 형성된 하이드로겔에서 더 빠르게 발생합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마이크로파 보조 방법을 사용하여 PEG DME 영예를 합성하는 방법과 양성자 NMR을 사용하여 기능화를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 마스터하면 하이드로겔 분해가 세포 기능에 미치는 영향에 대한 추가 질문에 답하기 위해 가수분해 분해성 그룹의 고리 개방을 활용할 수도 있습니다. 또한 이 기술을 사용하여 말단 말단 펩타이드 염기서열에 메타 아크릴아미드 기능을 선택적으로 통합하는 방법과 다중 비행 시간 질량 분석기를 사용하여 이러한 기능화를 평가하는 방법을 잘 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다.