Name: 바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 실크 단백질 합금 재료 제작 방법을 전자 회로와 통합하여 생체 재료 특성을 조절하는 기술입니다. 이 프로토콜은 생분해성 임플란트 및 의료 기기 개발에 활용됩니다.

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저자는이 연구의 지원 로완 대학 감사합니다. 터프 츠 대학의 XH도 덕분에 박사 데이비드 L. 카플란 및 이전 기술 교육에 대한 NIH P41 조직 공학 정보 센터 (TERC).

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

&quot;합금&quot;단백질 생산 시스템에서 가장 중요한 절차의 하나가 블렌딩 된 단백질의 상용 성을 검증하는 것이다. 그렇지 않으면, 안정된 특성과 동조하지 않고 단지 비혼 화성 혼합물을 단백질 또는 단백질 합성 시스템이다. 실험 열 분석 방법은, 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 그들의 합금의 특성을 확인하기 위해. 단백질 - 단백질 상호 작용은 플로리 - 허긴의 격자 &quot;용매&quot;(우세한 단백질 성분) 사이의 상호 작용과 같은 모델 (48) 및 &quot;용질&quot;(마이너 단백질 성분)에 따라 확인할 수있다. 이 모델에 기초하여, &quot;용매&quot;및 &quot;용질&quot;사이 혼합 동안 자유 에너지 변화는 블렌드 (48)의 상용 성을 제어. 일반적으로 상용 성 정도의 세 가지가있다 : (a) 완전 혼화 (거시적 형태 1 단계 소재), (b) 준 안정 (양식 세미 혼화 재료 상), 및 (c)은 비혼 화성 (개별 단백질과 B 도메인) 3,4...

활동은 구조 단백질의 제한된 수를 사용하여 가변 다기능 생물학적 행렬을 생성하기위한 전략을 만들었다. 예를 들어, elastins 및 콜라겐은 항상 특정 조직 1,2에 필요한 조정의 장점과 기능을 제공하기 위해 생체 내에서 함께 사용됩니다. 이 전략의 핵심은 블렌딩이다. 블렌딩 비율은 특정 단백질과의 혼합을 포함하고 가변하고 다양한 특성 3-5 간단한 재료 시스템을 생성하는 기술 접근 방법이다. 합성 공학 ​​전략 6,7과 비교하여, 혼합 재료는 균일 인한 운전 8-16의 용이성 물질을 처리 할 수있는 능력을 향상시킬 수있다. 따라서, 다기능, 생체 단백질 합금 재료를 설계하는 의학 연구의 새로운 영역이다. 이 기술은 세포 및 조직의 기능 VIT 모두에서 천연 단백질 기질의 영향에 대한 체계적인 지식을 제공한다RO 및 생체 10,17한다. 다른 단백질 사이의 분자 인터페이스를 최적화함으로써, 단백질 계 합금 재료는, 예컨대 열 상이한 온도에서의 안정성, 가변 장기에 다양한 조직, 전기적 감도를 지원하는 탄성 및 각막 조직 재생 3 광학 특성 등의 물리적 기능의 범위를 포괄 할 수있다 18-27. 이러한 연구의 결과는 조정 조직 수리 및 질병 치료와 자신의 새로운 치료 및 진단 기능은 3을 구상 할 수있다 생분해 성 임플란트 장치에 더 우위에 직접 관련성 생명 과학 분야에서 새로운 단백질 물질 플랫폼을 제공 할 것입니다. 많은 자연의 구조 단백질은 생체 재료 행렬 후보로 악용 될 수 있습니다 중요한 물리적, 생리 활성 특성을 갖는다. 다른 웜 종 실크, 다른 조직으로부터 머리와 양모, elastins 및 콜라겐에서 케라틴 및각종 식물성 단백질 (도 1) 18-27 가변 단백질 계 재료를 설계에 사용되는 가장 일반적인 구조 단백질의 일부이다. 일반적으로, 이들 단백질은 그들의 독특한 반복적 차 아미노산 서열 3,28-35에 다른 이차 구조의 분자 (예 : 실크, 베타 시트, 또는 케라틴 코일 용 코일)을 형성 할 수있다. 이러한 기능은 생체 고분자 물질의 소중한 자원으로 자신의 유틸리티를 자극 생물 인터페이스에 고유 한 기능을 가진 자기 조립 거시적 구조의 형성을 촉진한다. 여기서, 구조 단백질의 두 종류가 사용되었다 (야생 tussah 실크 예로 들여진 뽕나무 실크 단백질로부터 단백질 B)는 각종 단백질 합금 생체 재료의 제조 일반적인 프로토콜을 설명한다. 증명 프로토콜은 1 부 포함 : 단백질 상호 작용 예측 및 시뮬레이션, 2 부 : 단백질 합금 솔루션의 생산 및 부품 (3) : 단백질 합금의 제조를시스템, 광학, 전기 및 제약 응용 프로그램. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50891/50891fig1highres.jpg" width="500" /> 그림은 일반적으로 단백질 기반의 물질을 설계하는 다른 웜 종의 실크를 포함하여 우리의 실험실에서 사용되는 다양한 구조 단백질의 1 원시 자료, 머리와 양모, 다른 조직에서 elastins 및 다양한 식물성 단백질에서 케라틴.

<table><tbody><tr><td>Q100 시차 주사 열량계(DSC)</td><td>TA Instruments, New Castle, DE, USA </td><td>N/A</td><td>소프트웨어와 함께 모든 유형의 DSC를 사용하여 열 용량을 계산할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>SS30T 진공 스퍼터링 시스템&nbsp;</td><td>TM 진공 제품, Inc., Cinnaminson, 뉴저지, 미국</td><td>N / A</td><td>맞춤형 제작 부품; 당신은 코팅하기 위해 스퍼터링 시스템의 모든 유형을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>VWR 1415M 진공 오븐</td><td>VWR International, Bridgeport, NJ, USA</td><td>N/A</td><td>모든 유형의 진공 오븐을 사용하여 샘플을 물리적으로 가교할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

섬유 단백질은 바이오 센서, 나노 의학, 조직 재생 및 약물 전달과 같은 생의학 분야에서 다양한 용도로 사용되어왔다 서로 다른 서열과 구조를 표시합니다. 이 단백질 사이의 분자 규모의 상호 작용을 기반으로 자료를 설계하는 것은 조정 가능한 특성을 가진 새로운 다기능 단백질 합금 생체 물질을 생성하는 데 도움이됩니다. 이러한 합금 재료 시스템은 또한 때문에 체내에서 생분해 성 재료, 생체 적합성 및 tenability 전통적인 합성 중합체에 비해 이점을 제공한다. 이 문서에서는 단백질 합금을 생산하는 방법 계산 방법에 의해 단백질 - 단백질 상호 작용을 예측하는 방법을 포함하여이 주제에 관한 유용한 프로토콜을 제공하기 위해 예를 들어 야생 tussah 실크 (Antheraea의 pernyi) 및 국내 뽕나무 실크 (Bombyx 모리)의 단백질 혼합 사용 솔루션은, 어떻게 열 분석에 의해 합금 시스템을 확인하는 방법과 변수 합금 재료를 제조회절 격자와 광학 재료, 회로 코팅과 전기 재료 및 약물 방출 및 전달을위한 제약 재료 포함. 이러한 방법은 다른 단백질 합금에 기초하여 차세대 다기능 생체 재료 설계에 중요한 정보를 제공 할 수있다.

(단백질 및 단백질 B 사이 예) 전형적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 전하 - 전하 (정전) 명소, 수소 결합 형성, 소수성 - 친수성 상호 작용뿐만 아니라, 다이폴, 용매, 카운터 이온 및 특정 사이 엔트로피 효과가 포함되어있을 이 단백질의 도메인 (그림 2) 3. 따라서, 근본적으로, 우리가 계산 시뮬레이션에 의한 이러한 상호 작용의 효과를 예측할 수있다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50891/50891fig2highres.jpg" width="500" /> 도 단백질과 단백질 B. 2 사이의 상호 작용은 일반적으로, 이러한 상호 작용은 전하 - 전하 (정전) 명소, 수소 결합의 형성, 또는 이들 두 단백질의 특정 도...

혼합 속성과 결합하여 광범위한 기능과 생체 물질을 생성 할 수있는 효율적인 방법입니다. 다른 천연 실크 단백질 분자 사이의 상호 작용을 예측함으로써, 가변 기계적 복원력 전기적 응답, 광학 투명성, 화학적 가공성, 생분해 성, 또는 열적 안정성을 가진 새로운 실크 실크 단백질 합금 플랫폼을 설계 할 수있다.

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 전자 회로가 포함된 실크 복합 필름을 사용하여 다양한 단백질 합금 재료를 제작하는 방법을 시연하는 것입니다. 그 예로, 먼저 두 가지 서로 다른 종의 누에 고치로부터 각각의 단백질 용액을 재생함으로써 이를 수행합니다.두 번째 단계는 서로 다른 비율의 단백질 용액 두 가지를 혼합하여 일련의 블렌딩 용액을 생성하는 것입니다. 다음으로, 박막 제작 기술을 사용하여 유리 기판 위에 전자 회로를 제작합니다. 마지막 단계는 블렌딩 용액을 유리 기판에 코팅하고 전자 회로를 건조된 단백질로 전사하는 것입니다.복합 필름을 기존의 합성 고분자 재료와 비교했을 때, 단백질 재료는 인체 내에서 더 우수한 생체 적합성, 생분해성 및 조절 가능성을 제공할 수 있습니다. 서로 다른 비율로 단백질을 혼합하는 것은 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성을 조절할 수 있는 합금 재료를 생성하기 위한 간단한 기술적 접근 방식입니다.이 기술을 이식형 생체 의료 시스템으로 확장하면 전자 모니터링이 가능해져 의료 치료의 진단과 치료 효과를 높일 수 있습니다. 또한, 이 기술은 더 이상 필요하지 않을 때 체내에서 흡수될 수 있는 소자를 개발하는 데 사용될 수 있습니다. 본 영상에서는 야생 TOSA 실크와 가공 뽕나무 실크의 단백질 혼합물을 예로 들어, 단백질 용액의 제조 방법과 전자 회로를 이용한 재료 제작 방법을 포함하여 이 주제와 관련된 유용한 프로토콜을 제공하겠습니다.증착과 같은 다른 방법과 비교했을 때 본 회로 코팅 기술의 주요 장점은, 코팅 과정 동안 단백질 재료가 직접적으로 또는 복사열을 통해 고온에 노출되지 않는다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면, 야생 tssa 실크 고치를 3 g의 무게로 자릅니다. 2 L 유리 비커에 증류수를 채운 다음, 유리 비커를 가열판 위에 올립니다.알루미늄 호일로 덮고 끓을 때까지 가열합니다. 알루미늄 호일 덮개를 제거하고 끓는 물에 탄산수소나트륨 3 g을 천천히 넣어 완전히 녹입니다. 탄산수소나트륨이 완전히 녹으면 야생 실크 고치를 끓는 물에 넣고 2~3시간 동안 끓입니다.끓인 후, 스패튤라를 사용하여 용액에서 단백질 섬유를 조심스럽게 꺼내고 꽉 짜서 과잉 수분을 제거합니다. 다음으로, 2 L 비커에 담긴 차가운 증류수에 섬유를 담그고 30분씩 2회 세척하여 섬유 표면의 불순물 잔여물을 완전히 제거합니다. 세척 후, 흄 후드 내에서 섬유를 최소 12시간 동안 건조합니다.야생 실크 단백질 섬유를 용해시키기 위해 유리 비커에 48.784 g의 질산칼슘을 넣고 65 °C에서 가열하여 액체 상태로 만듭니다. 그 다음 섬유와 용매를 섬유 1 g당 용매 10 mL의 비율로 혼합합니다. 95 °C에서 5~12시간 동안 섬유를 용해시킨 후, 야생 실크 용액을 12 mL 투석 튜브에 붓고 2 L의 증류수로 투석합니다.용액 내의 질산칼슘 용매를 제거하기 위해 증류수를 자주 교체하십시오. 3일 후, 투석 카세트에서 단백질 용액을 수집하여 13,000 RPM 정격 튜브에 넣습니다. 그 다음, 4 °C에서 3,500 RPM으로 1시간 동안 용액을 원심분리합니다.완료 후 침전물을 제거하기 위해 세 번 세척합니다. 가축화된 뽕나무 실크와 같은 다른 천연 단백질을 수집한 후, 최종 용액을 4 °C 냉장고에 보관하십시오. 측정된 농도의 최종 단백질 수용액이 얻어질 때까지 적절한 비누와 용해 용매를 사용하여 위의 과정을 반복합니다.다음으로, 피펫을 사용하여 1 wt% 야생 실크 용액과 1 wt% 가축 실크 용액을 천천히 혼합합니다. 단백질 응집을 방지하기 위해 최종 용액을 4 °C에서 보관합니다. 유리 기판 위에 전기 회로 패턴을 제작하려면, 먼저 Hinox와 같은 탈지 용제와 초음파 세척기를 사용하여 유리 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 아세톤에서 5분, 메탄올에서 5분 동안 세척합니다.180리터 액체 질소 탱크의 기화로 생성된 건조 질소 가스를 사용하여 유리 슬라이드를 불어 건조시킵니다. 이 단계에서 기판 재료를 증착 챔버에 넣고 로드락을 30 mTor 압력까지 진공 상태로 만듭니다. 그런 다음 로드락과 메인 증착 챔버 사이의 게이트 밸브를 열어 기판을 챔버 내부로 진입시킵니다.아르곤 가스와 압력 조절기를 켜고 압력을 원하는 증착 압력으로 조절하여, 타겟의 산화층과 오염 물질을 제거하기 위해 몇 분 동안 프리 스퍼터링(pre sputter)을 수행합니다. 셔터를 연 후, 원하는 두께를 얻을 수 있는 증착 속도로 기판 위에 금속을 스퍼터링합니다. 스퍼터링 공정이 완료되면 코팅된 유리 슬라이드를 챔버에서 꺼냅니다.스피너를 사용하여 필름 표면에 양성 포토레지스트를 코팅합니다. 필름 위에 레지스트를 스핀 코팅한 후, 레지스트를 건조시키기 위해 90 °C에서 5분 동안 소프트 베이크를 수행합니다. 완료되면, 소자 이미지가 그려진 컨택 마스크를 레지스트 위에 단단히 밀착시킵니다.포토레지스트를 1000 watt UV 광원에 10초 동안 노광합니다. 그 다음, 투영된 이미지가 나타날 때까지 필름을 포토레지스트 현상액에 넣습니다. 이미지가 나타난 직후, 필름을 탈이온수에 담가 노광되지 않은 포토레지스트에 현상액이 더 이상 작용하지 않도록 합니다.그런 다음 건조 질소 가스로 필름을 불어 건조시킵니다. 포토레지스트를 하드 베이크하기 위해 필름을 120 °C의 오븐에 15분 동안 넣습니다. 필름이 식으면, 포토레지스트로 보호되지 않은 금속이 제거될 때까지 식각액에 넣습니다.식각을 중단하기 위해 필름을 물에 담급니다. 다음으로, 경화된 포토레지스트를 제거하기 위해 필름을 아세톤으로 헹굽니다. 그 후 필름을 메탄올로 헹구고 건조 질소로 불어 건조시킵니다.코팅된 유리가 준비되면, 서로 다른 단백질 합금 용액을 유리 표면에 떨어뜨립니다. 피펫을 사용하여 흄 후드 내에서 최소 12시간 동안 건조시켜 유리 위에 단백질 합금 박막을 형성합니다. 그 다음, 핀셋을 사용하여 얇은 금속 패턴이 있는 단백질 합금 박막을 유리 기판에서 떼어냅니다. 불용성 단백질 합금 재료를 얻으려면, 챔버 바닥에 물 그릇을 놓은 상태에서 25 kilo pascals의 60 degrees Celsius 진공 오븐에 건조된 박막을 넣습니다.오븐 내부의 공기를 펌프로 제거하여, 최소 2시간 동안 샘플의 수증기가 모두 제거되도록 합니다. 진공을 해제하고 오븐에서 샘플을 꺼낸 후, 핀셋을 사용하여 기판에서 수불용 필름을 벗겨냅니다. 마지막으로, 단백질 합금 필름 위 금속 패턴의 전기 저항을 측정하고 이를 유리 위의 원래 패턴과 비교합니다.전형적인 단백질-단백질 상호작용에는 정전기적 인력, 수소 결합, 소수성-친수성 상호작용뿐만 아니라 단백질 특정 도메인 간의 쌍극자 용매 대이온 및 엔트로피 효과가 포함될 수 있습니다. 이러한 상호작용의 효과는 신장 시뮬레이션 중 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 예측할 수 있습니다. 어떤 단백질은 스프링과 같은 탄성 네트워크를 형성하여 재료에 초탄성을 제공하는 반면, 다른 단백질은 재료를 위한 강력한 물리적 가교제 역할을 하는 입자로 작용할 수 있습니다.에너지를 저장 및 방출하거나 추가적인 기계적 지지력을 제공하기 위해 서로 다른 도메인에서 동적인 구조 전이를 유도할 수 있습니다. 단백질 합금 용액은 열적, 기계적, 광학적, 전기적, 화학적 또는 생의학적 응용을 위한 재료 매트릭스를 포함하여 조절 가능한 특성을 가진 다양한 생체 재료로 형성될 수 있습니다. 본 시연에서는 2단자 및 4단자 기술을 사용하여 단백질 박막 위 전기 회로의 상온 전기 비저항을 측정하였습니다.2단자 측정 결과, 박막의 비저항은 3.6 × 10⁻⁷ Ω·m로, 벌크 상태보다 약 20배 더 높게 나타났습니다. 벌크에 비해 박막에서 더 높은 비저항이 측정되는 것은 이미 제한된 전류 경로와 전하 운반자가 결함을 피할 수 없기 때문에 나타나는 일반적인 현상입니다. 단백질 성분의 비율을 변경함으로써, 최종 재료의 탄성, 강도, 표면 거칠기 또는 표면 전하와 같은 생물물리학적 특성을 제어할 수 있습니다.이러한 특성은 궁극적으로 재료에 부착된 조직의 기능과 거동에 영향을 미칩니다. 따라서 단백질 합금 시스템은 향후 기능 조절이 가능한 이식형 의료 기기나 재료를 제작할 수 있는 새로운 경로를 제공합니다. 이 영상을 시청하고 나면 이러한 재료 위에 회로를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 본 논문에서 제공하는 프로토콜이 향후 다양한 생의학 분야의 연구 과학자와 임상 의사 모두에게 도움이 되기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

실크 필름은 생물 의학 응용 프로그램의 배열에 대해 쉽게 사용자 지정 biomaterials의 소설 클래스입니다. 제시 실크 영화 문화 시스템의 다양한 고도의...

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뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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