2013년 11월 25일
Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석에 대한 설명을 포함한다.
이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 마우스 뇌의 상부 이동 흐름을 따라 신경아세포의 이동을 시각화하고 분석하는 것입니다. 이것은 마우스 팝의 외측 심실에 녹색 형광 단백질을 코팅하는 첫 번째 전기구멍, DNA 플라스미드 ENC에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 전기천공된 쥐에서 뇌 조각을 준비하는 것입니다.
다음으로, 최상의 GFP 신호를 가진 슬라이스를 배양을 위해 선택합니다. 마지막 단계는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 GFP 표지된 철새 신경아세포를 포함하는 뇌 절편의 타임 랩스 이미징입니다. 궁극적으로 타임랩스 동영상은 세포 추적 및 신경아세포 이동의 정량 분석에 사용됩니다.
이 방법은 줄기세포 유래 신경아세포의 움직임이 출생 후 뇌에서 어떻게 유도되고 조절되는지와 같은 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 바이러스 매개체 전달과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 더 쉽고 저렴하며 시간이 덜 걸린다는 것입니다. 또한 신경아세포의 희박한 라벨링을 허용하여 이동 역학을 자세히 분석할 수 있습니다.
전기공공의 전압을 850밀리초 간격으로 100볼트에서 펄스당 50밀리초인 5개의 정사각형 펄스로 설정하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 모세혈관에 연결된 흡인기 튜브를 사용하여 모세관 바늘에 1-2마이크로리터의 DNA를 로드합니다. 다음으로, 출생 후 2일차 새끼 쥐를 케이지에서 꺼내 불소 흡입으로 마취합니다.
그런 다음 덜 지배적인 손의 엄지와 검지 사이에 강아지의 머리를 잡습니다. 올바른 주입 지점을 식별하는 데 도움이 되도록 머리의 피부를 뒤로 약간 당깁니다. 눈과 두개골 미터법의 랜드마크인 Lambda 사이의 가상 선을 생각해 보세요.
그런 다음 람다에서 이 선 길이의 약 1/3 지점에 모세관 바늘을 약 2mm 깊이까지 삽입한 후 입으로 천천히 불어 플라스미드를 주입합니다. 이 절차를 수행하는 동안 손가락이 뇌에 너무 많은 압력을 가하지 않는지 확인하십시오. 모세관에 최소한의 DNA 용액이 남아 있을 때 주입을 중단합니다.
그런 다음 두 전극을 모두 젤로 코팅하고 DNA가 주입된 반구의 측면에 양극이 있는 쪽으로 놓습니다. DNA가 Rostral SVZ에 통합되려면 전극을 주입 지점에 약간 돌출부로 놓습니다. 그런 다음 펄스 풋 스위치 페달을 눌러 전류 전달을 시작합니다.
그런 다음 강아지 머리에서 젤을 닦아내고 몇 분 동안 가열 패드에 산소로 강아지를 다시 살립니다. 그런 다음 케이지에 다시 넣고 어미의 손이 닿지 않는 곳에 두십시오. 어미가 새끼를 되찾아 나머지 새끼와 재결합하도록 하십시오.
이 절차에서 밀리 셀 인서트를 1밀리리터의 필름 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 배양 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 새끼 쥐의 목을 베인 후 메스로 두피를 제거하십시오.
다음으로, 소뇌에서 후각구까지 중간 시상 봉합선을 따라 두개골을 자릅니다. 두개골을 횡단으로 몇 개 더 자르고 집게를 사용하여 두개골 플랩을 부드럽게 제거합니다. 뇌 전체가 노출되어 있는지 확인하고 조직이 손상되지 않도록 각별히 주의하면서 주걱을 사용하여 조심스럽게 해
부합니다.그 후, 반구는 면도날로 뇌를 절개하고 주입된 반구를 버립니다. 그런 다음 vibram 홀더에 작은 테이프 조각을 붙였습니다. 뇌 반구를 부착하는 데 필요한 최소한의 접착제를 사용하십시오.
뇌 반구를 300미크론 조각으로 자르기 시작합니다. 그런 다음 작은 페인트 붓이나 부드러운 접종 루프를 사용하여 조각을 수집합니다. 그런 다음 표준 형광 현미경으로 GFP 신호에 대해 슬라이스의 양면을 확인하고 대부분의 상부 이동 흐름을 따라 밝은 형광을 보이는 것을 선택합니다.
자기 배양 후드에서 뇌 절편의 가장 꼬불꼬불한 부분을 잘라내고 접착제 흔적을 제거합니다. 다음으로, 플라스틱 과거 피펫을 사용하여 슬라이스를 흡인하고 예열된 밀리 셀 인서트의 중앙에 놓습니다. gilson 피펫으로 인서트 상단의 과도한 박리 용액을 제거합니다.
그런 다음 슬라이스 배양물을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 배양기에 최소 1시간 동안 가라앉힙니다. 뇌 절편 준비 후 2시간 이내에 이미징 전. 이미징 챔버의 뇌 절편이 들어 있는 유리 바닥 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.
다음으로, 적절한 형광등 아래에서 20 x 0.45 대물렌즈를 사용하여 이미징할 슬라이스 영역을 선택하고 초점을 맞춥니다. 현미경에서 타임 랩스 이미징을 설정하려면 L 100 버튼을 클릭하여 샘플의 레이저 스캔을 허용합니다. 다음으로 속도에서 적절한 레이저를 선택하여 ultra view 레이저 체인저를 엽니다.
노출 시간 게인과 레이저 강도를 설정합니다. 그런 다음 뇌 내부를 이미지화할 Zack 간격을 선택합니다. 그런 다음 각 ZS 스택 이미지 사이의 간격을 선택합니다.
각 ZS 스택 캡처와 총 이미징 지속 시간 사이의 시간 간격을 선택합니다. 그런 다음 저장 아이콘을 클릭하여 이미징 매개변수에 대한 변경 사항을 저장합니다. 마지막에 녹음 버튼을 눌러 Velocity 정량 분석 모듈에서 이미징을 시작합니다.
생성된 원하는 라이브러리를 엽니다. 타임랩스 실험을 완료한 후 왼쪽 상단 상자에서 확장된 초점을 선택합니다. 측정 탭을 클릭하여 측정 창을 표시합니다.
작업 목록이 화면 왼쪽 하단에 표시됩니다. 위의 공간에서 트랙을 드래그합니다. 그러면 track이라는 새 창이 열립니다.
화면의 왼쪽 상단 섹션에 있는 트랙 창의 입력 탭에서 포인트를 선택합니다. 포인트 도구를 클릭하고 도구 탭을 클릭한 다음 수동으로 개체 추적 옵션을 선택하면 운영자가 셀 추적을 시작할 수 있는 창이 나타납니다. 세포체의 중앙 영역을 마우스로 클릭하여 이동하는 신경아세포를 추적하기 시작하고 시간 경과의 마지막 시점에 도달할 때까지 세포의 움직임을 계속 추적합니다.
데이터를 얻으려면 측정 항목 만들기를 선택합니다. 측정 메뉴에서 화면 중앙에 창이 나타납니다. 이 창에서 호출된 새 측정 항목을 선택하고 측정 항목의 이름을 입력합니다.
정량 분석을 위한 매개변수가 포함된 파일이 타임랩스 파일 아래에 나타납니다. 이 측정 항목 파일을 두 번 클릭하면 분석된 세포의 단일 트랙을 시각화할 수 있는 창으로 열 수 있습니다. 표시 옵션에서 추적된 지점을 선택하고 이동 경로에 대해 시각화해야 하는 셀을 선택합니다.
마이그레이션 파라미터를 분석하려면 측정 항목 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 텍스트 파일로 내보낸 다음 Excel과 같은 프로그램에서 가져올 수 있습니다. 이것은 쥐의 시상 뇌 절편에서 가져온 신경 아세포의 회전 디스크 타임 랩스 이미지입니다. 플라스미드 이미지를 발현하는 GFP의 전기천공법 후 5일은 1시간 간격입니다.
각 패널은 4미크론 떨어진 28개의 연속 이미지를 Zack 프로젝션한 것입니다. 화살촉은 RMS를 따라 후각구를 향해 이동하는 4개의 대표적인 신경아세포를 나타냅니다. 이들은 4개의 신경아세포의 타임랩스 영상에서 얻은 대표적인 이동 경로입니다.
이 그래프는 두 개의 대표적인 신경아세포의 시간에 따른 이동 거리를 보여줍니다. 이 세포는 전형적인 염분 운동성 행동을 나타냅니다. 이 동영상은 GFP가 migrating이라고 표시된 마우스 RMS 섹션을 보여줍니다.
플라스미드를 발현하는 A GFP의 전기천공법 5일 후에 얻어지는 신경아세포. 후각 전구는 오른쪽 하단 모서리를 향해 보이지 않는 곳에 있습니다. 컨포칼 Z 스택은 회전하는 디스크 컨포칼에서 캡처되었습니다.
120미크론 간격으로 3시간 동안 3분마다 20개의 대물렌즈를 사용하면 재생 속도는 초당 10프레임입니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험을 시작하기 전에 전기천공법을 연습하고 가능한 한 최단 시간에 급성 뇌 절편 배양을 신중하게 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 출생 후 쥐의 뇌에서 신경아세포 이동을 시각화하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 출생 후 마우스 뇌에서 신경아세포 이동을 시각화하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 측정편으로 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 전기포화하고, 이어서 뇌 슬라이스의 시간별 이미징을 통해 신경아세포의 동적을 추적합니다.
Understanding neuroblast migration dynamics provides mechanistic insights into postnatal neurogenesis, supporting target validation for regenerative therapies. This method enables quantitative analysis of cell motility in a near-physiological environment, aiding preclinical de-risking of neurogenic targets. The approach supports early discovery workflows by linking genetic manipulation to functional phenotypic outputs in disease-relevant systems.
The method integrates into early discovery pipelines by enabling hypothesis-driven validation of neurogenic targets prior to lead identification.