Name: 마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 마우스 출생 후 뇌에서 신경아세포 이동을 GFP 전기천공과 시간 경과 영상으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 뇌 발달 연구에 활용됩니다.

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MS와 YZ는 KCL과 KCL 중국 박사 studentships에 의해 지원된다. MO는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회의 박사 과정 학생이기 의해 투자되었다. 우리는 일렉트로에 귀중한 조언을 마사루 오카베 및 월 이치 미야자키 PCX-EGFP 플라스미드 및 알랭 Chedotal와 아테나 입실 랜티 감사합니다.

이 절차는 영국 홈 오피스 규정 (동물 과학적인 절차의 법, 1986)에 따른다. 과학자들은 설립하고 자신의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 된 지침을 따라야합니다. 1. 출생 에레 1.1. 유리 모세 혈관, DNA 솔루션 및 Electroporator의 준비 <ol><li> DNA의 주입 뽑아 유리 모세관 (0.86 mm : 1.5 mm, ID OD)를 준비합니다. (셔터 P-97 모세관 끌어 당기는에 대한 지표 설정은 다음과 같습니다 : 열 283, 50를 당겨, 속도 (90), 시간 (50)). 약 2 μL의 부피에 해당하는 모세 혈관에 표시를합니다. </li><li> 850 밀리 초 간격 (100 V, 50 밀리 초 ON 펄스, 850 밀리 초, 펄스 5 OFF 펄스)로, 100 V에서 5 평방 펄스, 50 밀리 초 / 펄스 electroporator의 전압을 설정합니다. </li><li> 1-2 ㎍ / μL의 최종 농도 고순도 (OD&gt; 1.80 280분의 260)를 희석하여 독소 프리 플라스미드 DNA독소와 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 또는 PBS를 무료. 그것은 DNA 용액 (성공적으로 주입했을 때 염료가 뇌실에 확산한다)에 0.1 % 빠른 그린을 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> , 5-7 밀리 전극을 준비 전극 젤 가열 패드를 따뜻하게. </li></ol> 1.2. 일렉트로 <ol><li> 케이지에서 생후 2 마우스 강아지를 제거하고 (~ 0.6 L / min의 유량) 이소 플루 란 흡입으로 마취. </li><li> 약 1 분 후, 다리 핀치 응답을 사용하여 마취 상태를 결정한다. 아무런 움직임이 발생하지 않으면, 뇌 실내 주사를 진행합니다. </li><li> 모세관에 연결 흡입기 튜브를 사용하여 DNA의 1-2 μL 모세관 바늘을 넣습니다. </li><li> 차가운 광원에서 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아. 약간 오른쪽 주입 지점을 식별 할 수 있도록 머리에 피부를 뒤로 당겨. </li><li> 눈과 t 사이에 가상의 선을 고려그는 랜드 마크 람다 (그림 1A)를 craniometric. 람다 (라인 중간 지점에서 약 1 ㎜) 15이 라인의 길이의 3 분의 1에 모세관 바늘을 삽입합니다. 뇌의 깊은 침투를 방지하기 위해 확인하고, 깊이 2mm에 대한 모세관을 삽입합니다. </li><li> 입으로 천천히 불어 플라스미드를 주입​​ (모세관에 연결된 주사기가 또한 사용될 수있다). 이 성공 플라스미드 주입을 방지 할 수 있습니다으로이 절차를 수행하는 동안, 손가락이 뇌에 너무 많은 압력을 적용하지 있는지 확인합니다. </li><li> DNA 용액의 최소량은 모세관 남아 때 주입을 중지. 그것은 두개 내 압력 해로운 증가를 방지하기 위해보다 1 μl를 주입하는 것이 바람직하다. </li><li> 코트 두 젤 전극과는 DNA가 (그림 1A)를 주입 반구의 측면에서 긍정적 인 측면으로 배치합니다. 에 주동이의 SVZ에 DNA의 설립을위한 장소 전극이 약간 주동이주입 지점. 전극의 위치를 변화 시키면 SVZ 22, 25의 다른 지역에있는 일렉트로의 지역 특이성을 달성 할 수있다. </li><li> 펄스 풋 페달을 눌러 현재의 전송을 시작합니다. 일렉트로가 완료되면 (더 낮은 전압 값이 열악한 전기 천공 효율과 상관 관계 이후 전압 값이 90 V 이하이어야한다) electroporator 디스플레이에 전압을 점검한다. </li><li> 몇 분 동안 가열 패드에 산소에서 강아지를 재 활성화하고 떨어져 어머니를 배치, 케이지로 돌아갑니다. 어머니가 강아지를 검색하고 쓰레기의 나머지와 재결합해야합니다. 일렉트로 후, 다음 단계 전에 4-7일에 대한 자신의 어머니와 함께 새끼를 떠난다. </li></ol> 2. 급성 뇌 슬라이스 문화의 준비 2.1. 솔루션 및 도구 준비 <ol><li> 다음 용액은 (는 해부 및 이미징 고 글루코스 DMEM을 사용하는 것도 가능하다 필요17) 해부 매체 (500 ㎖) Gey의 균형 미디어 - 500ML 45 % 포도당 - 5 ㎖ 영화 매체 (10 ㎖) 45 % 포도당 - 0.110 ML HEPES 1 M - 0.100 ML 펜 / Strep의 - 0.100 ML FCS - 0.500 ML B27 - 0.100 ML 글루타민 - 0.200 ML 둘 베코 수정 이글 중간 (페놀 레드 무료) - 8.89 ㎖의 </li><li> 37 ° C에서 따뜻한 영화 매체 </li><li> 배치 밀리 셀은 37 ° C / 5 % CO 2에서 가습 인큐베이터에서 영화 매체와 장소 1 ㎖를 포함하는 35mm 유리 바닥 문화 요리에 삽입합니다. </li><li> vibratome 액세서리 (드라이버, 실, 면도날, 접착제)를 준비합니다. </li><li> 가위, 작은 주걱, 직선 겸자 : 해부 도구를 준비합니다. </li><li> 조각을 처리하기위한 도구를 준비 작은 붓이나 부드러운 접종 루프 (크기 : 10 μL), 플라스틱 파스퇴르 피펫, 아이스 박스와 여러 6cm 플라스틱 접시. </li><li> 해부 매체를 Precool2-4 ° C에서 </li></ol> 2.2. 뇌 조각의 준비 <ol><li> 예냉 해부 매체 6cm 접시를 입력하고 (갓 잘라 조각을 유지하기 위해) 얼음에 놓습니다. </li><li> 자궁 경부 전위 다음, 마우스 강아지 목을 벨 가위를 사용합니다. , 메스로 두피를 제거 소뇌에 OB에서 중간 시상 봉합 따라 두개골을 잘라 조심스럽게 집게를 사용하여 두개골 뚜껑을 제거합니다. 뇌 전체가 노출되어 있는지 확인하고 신중하게 조직을 손상하지 않도록 특별한주의를 가지고, 주걱을 사용하여 해부. 절개는 신중하게 수행되어야하지만 동시에 매우 신속하게 (가능한 분 미만). 약물 / 가스 마취제와 터미널 마취가 neuroblasts과 동물의 희생을 다음과 같은 상대적으로 신속하게 이미지화 할 필요가 뇌 슬라이스 문화의 건강한 상태의 이동성 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 경추 탈구는 우리가 선호하는 방법입니다. </li><li> 말이 맞아 함께 뇌를 Hemisect또는 블레이드 (그림 2). uninjected 반구를 폐기하거나 다른 실험을 위해 사용합니다. </li><li> vibratome 홀더 테이프의 작은 조각을 놓고 그 위에 뇌 반구 (그림 2)를 연결하는 접착제의 최소한의 필요한 양을 사용합니다. 이는 반복되는 접착제 응용 프로그램에 홀더 표면의 손상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 접착제가 몇 초 동안 건조시킵니다. </li><li> 예냉 해부 솔루션으로 가득 vibratome 트레이에 홀더를 배치합니다. 잎으로 후각 망울 (그림 2)를 가리 킵니다. </li><li> 적절한 설정을 사용하여 뇌의 반구를 절단 시작합니다. 다음 매개 변수를 사용하는 것이 좋습니다 : 슬라이스 두께 300 μm의, 속도 ~ 3-5, 주파수 ~ 9. 높은 주파수와 낮은 속도는 슬라이스의 손상을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 작은 붓이나 부드러운 접종 루프를 사용하여 조각을 수집합니다. 만 볼 수 OB (보통 2 ~ 3 조각 / 뇌)로 조각을 유지합니다. 일반적으로 RMS의 대부분을 포함하는 슬라이스는 캘리포니아N 바닥면에서 ~ 300 μm의에서 찾을 수. </li><li> (양쪽면에 형광을 확인을 뒤집어 확인하는) GFP 신호에 대한 표준 형광 현미경으로 조각을 확인하고, RMS의 대부분을 따라 밝은 형광을 나타내는 사람을 선택합니다. </li></ol> 2.3. 배양 뇌 조각 <ol><li> 세포 배양 후드에서, 뇌 슬라이스의 가장 꼬리 제를 버려야 정밀 직선 핀셋이나 미세 절제 메스를 사용하는 접착제의 흔적을 제거합니다. </li><li> 섬세 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이스를 대기음 (더 큰 구멍을 만드 피펫의 끝을 잘라을,이 조각의 손상을 방지한다) 및 삽입 데워진 밀리 셀의 중앙에 놓습니다. </li><li> 밝은 형광 신호면이 밀리 셀은 (거꾸로 현미경과 영상을 위해) 삽입과 접촉에 배치되어 있는지 확인합니다. </li><li> 피펫 삽입물의 상단에 초과 해부 솔루션을 제거합니다. </li><li> 에 슬라이스 문화를 남겨이미징 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 정착. </li></ol> 3. Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상 <ol><li> 적어도 2 시간 이미징 전에 상수로 설정 하마 마츠 C10600-10B (ORCA-R2)의 디지털 CCD 카메라를 냉각 퍼킨 엘머 UltraViewVoX 공 촛점 회전 디스크 시스템, 반전 니콘 티-E 현미경 및 난방 시스템 (솔 렌트 과학)를 켭니다 37 ° C의 온도 </li><li> Volocity 소프트웨어 획득 모듈을 열고 &quot;즉&quot;버튼을 클릭 이미징 레이저 (들)을 선택합니다. </li><li> 뇌 슬라이스 제제 2 시간 이내에, 현미경 스테이지 촬상 챔버 뇌 슬라이스를 포함하는 유리 바닥 접시를 배치. </li><li> 이미지를 만들 조각의 영역 (예를 들어, 그냥 주사 부위 후 RMS의 첫 번째 하강 부분, 또는 ELBO을 선택하고 초점을 적절한 형광등 아래에서 니콘 CFI 슈퍼 계획 형석 ELWD 20X/0.45 목표를 사용RMS의 지역 W, 또는 neuroblasts가 OB를 입력하기 전에 팔꿈치 후). </li><li> 다음 작업으로 시간 경과 영상을 설정합니다 : <ol><li> 현미경에서 샘플의 레이저 스캐닝을 허용하도록 L100 버튼을 클릭합니다. </li><li> Volocity에서 적절한 레이저 (GFP에 대한 예를 들어, 488 nm의 레이저)를 선택하여 UltraVIEW 레이저 체인저를 엽니 다. </li><li> 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간 (일반적으로 100 ~ 500 밀리 초 사이) 및 레이저 강도 (일반적으로 20 ~ 30 %)을 설정한다. </li><li> 세포의 시각화를 개선하기 위해 이미지를 디지털 게인을 조정합니다. </li><li> 뇌 조각 내부의 이미지에 Z-스택 간격 (보통 이상 100 ~ 120 μm의 간격)을 선택합니다. (이것은 이후의 추적 분석을 용이하게한다)를 최대한 중첩 가능한 피하기 절연 세포의 적절한 개수와 간격을 선택한다. </li><li> 각각의 Z-스택 이미지 (보통 2-4 μm의) 사이의 간격을 선택합니다. </li><li> 시간 INT 선택각각의 Z-스택 캡처 (예 : 3 분) 및 총 이미징 기간 (예 : 3 시간) 사이 erval. </li><li> 영상 매개 변수에 대한 변경 사항을 저장하기 위해 &quot;저장&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 영상을 시작 녹음 버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> 제어 및 실험 샘플의 다른 영상 같은 날에 걸쳐 (예를 들어, 차량 / 약물 치료 또는 다른 일렉트로 플라스미드에 대한). </li></ol> 4. Neuroblast 마이그레이션 분석 <ol><li> Volocity 정량 모듈에서 시간 경과 실험을 완료 한 후 생성 된 원하는 라이브러리를 엽니 다. 왼쪽 상단 상자 (그림 4A, 단계 1)에서 &quot;확장 포커스&quot;를 선택합니다. </li><li> (그림 4A, 2 단계) 측정 창을 표시하려면 &quot;측정&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> 작업 목록이 화면의 왼쪽 하단에 표시됩니다. 드래그 &quot;트랙&quot;( &quot;기타&quot;에서 현재는 하단에 제목위의 공간에있는 목록). 이 화면의 왼쪽 상단 부분에서 &quot;트랙&quot;이라는 새로운 창 열기 (그림 4A, 3 단계)를 묻는 메시지가 표시됩니다. </li><li> 트랙 창에서 &quot;입력&quot;탭 (그림 4A, 4 단계)에서 &quot;포인트&quot;를 선택합니다. </li><li> 포인트 도구에 (그림 4A, 5 단계)를 클릭합니다. </li><li> 전지 본체의 중앙 영역에 마우스로 클릭하여 마이그레이션 neuroblast 추적을 시작하고 시간 경과의 마지막 시점까지 세포의 움직임을 추적하는 것을 계속할 도달 (3 시간 길이의 영화에 대한 예를 포인트 번호 (61)) . </li><li> 데이터 선택 얻으려면 측정 메뉴 (그림 4B, 6-7 단계)에서 &quot;측정 항목을 확인합니다.&quot; 창은 화면의 중앙에 표시됩니다. </li><li> 이 창에서 &quot;라는 새로운 측정 항목 :&quot;를 선택하고 (그림 4C, 8 단계)의 이름을 입력합니다. 홍보 전에 &quot;모든 timepoints&quot;옵션을 선택해야합니다싱 OK (그림 4C, 9 단계). 측정 항목 파일은 시간 경과 파일 아래에 나타납니다 및 정량 분석을위한 매개 변수 (예 : 마이그레이션 거리, 속도, 변위, 변위 속도)가 포함됩니다. </li><li> 창 (그림 4D, 10 단계)로 열 측정 항목 파일을 두 번 클릭합니다. </li><li> 분석 세포의 하나의 트랙을 시각화 &quot;디스플레이&quot;옵션 (그림 4D, 11 단계)에서 &quot;트랙 포인트&quot;를 선택합니다. </li><li> 오른쪽 측정 항목 파일을 클릭 한 다음 마이그레이션 매개 변수를 분석 할 수있는 엑셀 같은 프로그램에서 가져올 수있는 텍스트 파일로 내 보냅니다. </li><li> , 촬영 기간 동안 각 셀에 의해 측정 항목 파일에서 &quot;디스플레이&quot;옵션 &quot;포인트&quot;또는 &quot;집단&quot;에서 선택 (모든 트랙이 고유 한 ID를 가지고) ID를 클릭 연속 프레임과 일시 정지 사이의 움직임을 측정합니다. 진행에 의해 생성 된 파일을 내 보냅니다단계 4.10에 설명 된대로 보내고. </li></ol>

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RMS를 따라 신경 전구 세포의 효율적인 마이그레이션 기능 신경 (10)에 자신의 후속 성숙을 보장합니다. OB 향하는 신경 전구 세포의 탁월한 스트림은 인간의 초기 단계에 볼 수 있습니다 초기 출생 후의 인간의 두뇌 발달 (27)에 중요한 역할을 할 가능성이있다. 또한,이 세포는 손상과 신경 퇴행의 4,28에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로 할 수 있습니다. 실시간으로 neuroblast 역학에 유전자 조작의 효과를 모니터링 할 수 있다는 것은 완전히 neuroblast 이동이 안내 및 규제 방법을 이해하는 것이 필수적이된다. 여기에서 우리는 급성 뇌 슬라이스 문화의 시간 경과 공 촛점 회전 디스크 현미경과 생체 출생 일렉트로을 결합하여 SVZ 파생 neuroblast 마이그레이션을 모니터링하는 프로토콜을 설명했다. 특히, 우리는 신경 전구 세포를 마이그레이션하는 것은 SVZ에서 플라스미드 E...

포유 동물의 뇌에 새로운 뉴런 (신경)의 발생은 주로 두 지역에서 출생 후 발생, 해마 1의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 좌우 심실과 subgranular 영역의 subventricular 영역 (SVZ). 최근 몇 년 동안 수집 된 증거는 해마와 후각 망울 메모리 기능 1-3 출생 후 신경을위한 중요한 역할을 지원합니다. 중요한 것은, 출생 후 신경은 치료 때문에 퇴행성 신경 질환과의 관계의 가능성, 뇌 4-6 부상 사이트를 마이그레이션 할 neuroblasts의 능력을 보유하고있다. subventricular 영역 (SVZ)는 최근 중요한 신경성 틈새 시장으로 떠오르고있다. SVZ 파생 neuroblasts이 출생 후의 뇌 -1,7,8,8에서 가장 긴 마이그레이션 프로세스 만들기, 주동이의 철새 스트림 (RMS)를 통해 후각 망울 (OB)를 향해 이동한다. 포유류의 SVZ / RMS / OB 시스템이되고있다이러한 증식, 이동 및 분화 1,8 등의 신경에있는 다른 단계를 공부하는 유용한 모델. 많은 성장 인자와 세포 외 신호는 RMS를 따라 SVZ 신경과 이동을 조절하지만, 세포 내 분자 메커니즘은 지금까지 완벽하게되는 1.9을 이해합니다. RMS에 따라 적절한 이주 신생아 뉴런 (10)의 연속적인 성숙을 위해 매우 중요합니다. 또한, 일부 연구는 SVZ 파생 neuroblasts가 뇌 손상 사이트 4-6,11-13에 RMS 밖으로 마이그레이션 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 신호 전달 메커니즘의 조절 neuroblast 마이그레이션을 조사하는 것은 신경을 이해할뿐만 아니라 기본적인뿐만 아니라 잠재적 인 치료 응용 프로그램입니다. 여기, 우리는 생체 내 출생을 전기 SVZ 신경 전구 세포를 라벨 및 시간 경과 회전 디스크 공 촛점 microsco를 사용하여 급성 뇌 슬라이스 문화의 RMS를 따라 그들의 이동을 감시하기위한 세부 프로토콜을 설명평. 일렉트로 널리 배아에서 성인 단계 (14-18)에 발달 연구에 사용됩니다. 그것은 SVZ 신경 전구 세포를 대상으로 조작 할 수있는 강력한 도구입니다 및 형질 전환 모델 1,15,19,20의 바이러스 성 벡터 또는 생성의 정위 주입 저렴하고 상당히 빠른 대안을 나타냅니다. 그것은 수술을 필요로하고 높은 생존율이없는 비교적 간단한 절차입니다. shRNA를 나에 loxP 시스템이 관심의 유전자를 대상으로하거나 SVZ 조상의 영구 라벨을 달성하기 위해, 따라서 성인 신경 연구 (21, 22)를위한 유용한 도구를 나타내는 데 사용할 수 있습니다 채용 마우스 유전자 모델에서 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로. 그대로 뇌 이미징 RMS의 neuroblast 마이그레이션은 여전히​​ 인해 현재 기술적 한계에 도전합니다. 그러나,이 공정은 적당한 SYST 제공 급성 뇌 조각의 촛점 회전 디스크 경과 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다EM은 밀접하게 약물 조작 (23, 24)에 또한 의무가 생체 내 조건을 닮은. 시간 경과 영상과 생체 출생 일렉트로의 커플 링 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고 뇌의 복구를 촉진하기 위해 새로운 접근 방법의 발전에 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀리셀</td><td>밀리포어</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 유리 바닥 배양 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey의 균형 미디어</td><td>시그마</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>포도당, 45%</td><td>시그마</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>펜/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(페놀 레드-프리)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>시그마</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>주입용 유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>흡인기 튜브</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 모세관 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrodes 7mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>풋스위치 모델 1250F</td><td>하버드 장치</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>전극용 젤</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX 스피닝 디스크 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD 카메라가 장착된 맞춤형 설정(여러 레이저 소스 사용 가능)</td></tr><tr><td>Volocity 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>획득, 정량화, 시각화 모듈</td></tr><tr><td>현미경 검사용 환경 챔버</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>Ti-E 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 대물렌즈는 이 백서에 설명된 응용 분야에 권장됩니다</td></tr></tbody></table>.

마우스 급성 뇌 조각의 neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후 뇌의 주요 신경 인성 틈새 시장 중 하나입니다. 여기에, 신경 전구 세포 증식과 후각 망울 (OB)으로 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 이동할 수 neuroblasts에 상승을 제공합니다. 이러한 장거리 이동은 OB 신생아 신경의 후속 성숙에 필요하지만,이 과정을 조절 분자 메커니즘은 아직 불분명된다. neuroblast 운동성을 조절하는 신호 전달 경로를 조사하는 신경의 기본적인 단계를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라, 부상, 뇌졸중, 또는 변성에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로하도록 neuroblasts의 능력 부여, 치료 회생 가능성이 있습니다뿐만 아니라. 이 논문에서 우리는 생체 내 출생의 일렉트로 마우스 RMS의 neuroblast 마이그레이션 이후의 시간 경과 영상에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 출생 일렉트로 효율적 SVZ 조상 형질 할 수 있습니다다시 RMS를 따라 이주 neuroblasts을 생성하는 세포. 급성 뇌 슬라이스 문화의 디스크 시간 경과 현미경을 회전 공 촛점을 사용 neuroblast 마이그레이션 밀접하게 생체 조건과 유사한 환경에서 모니터링 할 수 있습니다. 또한, neuroblast 운동성 추적 및 정량적으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 RMS를 따라 이주 neuroblasts 레이블을 시각화하기 위해 GFP를 발현하는 플라스미드의 생체 내 출생의 전기 충격을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 에 loxP 시스템을 사용하는 조건부 녹아웃 마우스에 shRNA를 또는 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 또한 관심의 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 급성 뇌 슬라이스 배양 물의 약리 조작 neuroblast 이주 다른 시그널링 분자의 역할을 조사하기 위하여 수행 될 수있다. 시간 경과 영상과 생체 전기 충격에 결합함으로써, 우리는 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘을 이해하고 개발에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다소설의, 표준은 뇌의 복구를 촉진하기 위해 접근한다.

SVZ에서 파생 된 철새 neuroblasts의 레이블은 보통 4~8일 성공적인 일렉트로 (그림 1B) 후, RMS 함께 관찰 할 수있다. 긴 시간의 가볼만한 곳으로는 선택 될 수있다, 그러나 대부분은 OB를 입력 때문에 적은 세포는 RMS에서 찾을 수 있습니다. Neuroblasts 정도 2~3주 일렉트로 후 (도시하지 않음) OB에서 성숙 과립 세포의 전형적인 형태와 기능을 습득 시작합니다. ~ 1 시간 동안 배양 한 후, 일렉트로 마우스 새끼의 뇌 조각은 안정적으로 최대 3 ~ 4 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 이전에 23, 26를보고, neuroblasts 양적 세포 추적 (그림 4)를 사용하여 분석 할 수있다 (그림 3 및 비디오 1) 복잡한 마이그레이션 역학을 표시 할 수 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 마우스 뇌의 상부 이동 흐름을 따라 신경아세포의 이동을 시각화하고 분석하는 것입니다. 이것은 마우스 팝의 외측 심실에 녹색 형광 단백질을 코팅하는 첫 번째 전기구멍, DNA 플라스미드 ENC에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 전기천공된 쥐에서 뇌 조각을 준비하는 것입니다.다음으로, 최상의 GFP 신호를 가진 슬라이스를 배양을 위해 선택합니다. 마지막 단계는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 GFP 표지된 철새 신경아세포를 포함하는 뇌 절편의 타임 랩스 이미징입니다. 궁극적으로 타임랩스 동영상은 세포 추적 및 신경아세포 이동의 정량 분석에 사용됩니다.이 방법은 줄기세포 유래 신경아세포의 움직임이 출생 후 뇌에서 어떻게 유도되고 조절되는지와 같은 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 바이러스 매개체 전달과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 더 쉽고 저렴하며 시간이 덜 걸린다는 것입니다. 또한 신경아세포의 희박한 라벨링을 허용하여 이동 역학을 자세히 분석할 수 있습니다.전기공공의 전압을 850밀리초 간격으로 100볼트에서 펄스당 50밀리초인 5개의 정사각형 펄스로 설정하여 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 모세혈관에 연결된 흡인기 튜브를 사용하여 모세관 바늘에 1-2마이크로리터의 DNA를 로드합니다. 다음으로, 출생 후 2일차 새끼 쥐를 케이지에서 꺼내 불소 흡입으로 마취합니다.그런 다음 덜 지배적인 손의 엄지와 검지 사이에 강아지의 머리를 잡습니다. 올바른 주입 지점을 식별하는 데 도움이 되도록 머리의 피부를 뒤로 약간 당깁니다. 눈과 두개골 미터법의 랜드마크인 Lambda 사이의 가상 선을 생각해 보세요.그런 다음 람다에서 이 선 길이의 약 1/3 지점에 모세관 바늘을 약 2mm 깊이까지 삽입한 후 입으로 천천히 불어 플라스미드를 주입합니다. 이 절차를 수행하는 동안 손가락이 뇌에 너무 많은 압력을 가하지 않는지 확인하십시오. 모세관에 최소한의 DNA 용액이 남아 있을 때 주입을 중단합니다.그런 다음 두 전극을 모두 젤로 코팅하고 DNA가 주입된 반구의 측면에 양극이 있는 쪽으로 놓습니다. DNA가 Rostral SVZ에 통합되려면 전극을 주입 지점에 약간 돌출부로 놓습니다. 그런 다음 펄스 풋 스위치 페달을 눌러 전류 전달을 시작합니다.그런 다음 강아지 머리에서 젤을 닦아내고 몇 분 동안 가열 패드에 산소로 강아지를 다시 살립니다. 그런 다음 케이지에 다시 넣고 어미의 손이 닿지 않는 곳에 두십시오. 어미가 새끼를 되찾아 나머지 새끼와 재결합하도록 하십시오.이 절차에서 밀리 셀 인서트를 1밀리리터의 필름 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 배양 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에 넣습니다. 새끼 쥐의 목을 베인 후 메스로 두피를 제거하십시오.다음으로, 소뇌에서 후각구까지 중간 시상 봉합선을 따라 두개골을 자릅니다. 두개골을 횡단으로 몇 개 더 자르고 집게를 사용하여 두개골 플랩을 부드럽게 제거합니다. 뇌 전체가 노출되어 있는지 확인하고 조직이 손상되지 않도록 각별히 주의하면서 주걱을 사용하여 조심스럽게 해부합니다.그 후, 반구는 면도날로 뇌를 절개하고 주입된 반구를 버립니다. 그런 다음 vibram 홀더에 작은 테이프 조각을 붙였습니다. 뇌 반구를 부착하는 데 필요한 최소한의 접착제를 사용하십시오.뇌 반구를 300미크론 조각으로 자르기 시작합니다. 그런 다음 작은 페인트 붓이나 부드러운 접종 루프를 사용하여 조각을 수집합니다. 그런 다음 표준 형광 현미경으로 GFP 신호에 대해 슬라이스의 양면을 확인하고 대부분의 상부 이동 흐름을 따라 밝은 형광을 보이는 것을 선택합니다.자기 배양 후드에서 뇌 절편의 가장 꼬불꼬불한 부분을 잘라내고 접착제 흔적을 제거합니다. 다음으로, 플라스틱 과거 피펫을 사용하여 슬라이스를 흡인하고 예열된 밀리 셀 인서트의 중앙에 놓습니다. gilson 피펫으로 인서트 상단의 과도한 박리 용액을 제거합니다.그런 다음 슬라이스 배양물을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 배양기에 최소 1시간 동안 가라앉힙니다. 뇌 절편 준비 후 2시간 이내에 이미징 전. 이미징 챔버의 뇌 절편이 들어 있는 유리 바닥 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.다음으로, 적절한 형광등 아래에서 20 x 0.45 대물렌즈를 사용하여 이미징할 슬라이스 영역을 선택하고 초점을 맞춥니다. 현미경에서 타임 랩스 이미징을 설정하려면 L 100 버튼을 클릭하여 샘플의 레이저 스캔을 허용합니다. 다음으로 속도에서 적절한 레이저를 선택하여 ultra view 레이저 체인저를 엽니다.노출 시간 게인과 레이저 강도를 설정합니다. 그런 다음 뇌 내부를 이미지화할 Zack 간격을 선택합니다. 그런 다음 각 ZS 스택 이미지 사이의 간격을 선택합니다.각 ZS 스택 캡처와 총 이미징 지속 시간 사이의 시간 간격을 선택합니다. 그런 다음 저장 아이콘을 클릭하여 이미징 매개변수에 대한 변경 사항을 저장합니다. 마지막에 녹음 버튼을 눌러 Velocity 정량 분석 모듈에서 이미징을 시작합니다.생성된 원하는 라이브러리를 엽니다. 타임랩스 실험을 완료한 후 왼쪽 상단 상자에서 확장된 초점을 선택합니다. 측정 탭을 클릭하여 측정 창을 표시합니다.작업 목록이 화면 왼쪽 하단에 표시됩니다. 위의 공간에서 트랙을 드래그합니다. 그러면 track이라는 새 창이 열립니다.화면의 왼쪽 상단 섹션에 있는 트랙 창의 입력 탭에서 포인트를 선택합니다. 포인트 도구를 클릭하고 도구 탭을 클릭한 다음 수동으로 개체 추적 옵션을 선택하면 운영자가 셀 추적을 시작할 수 있는 창이 나타납니다. 세포체의 중앙 영역을 마우스로 클릭하여 이동하는 신경아세포를 추적하기 시작하고 시간 경과의 마지막 시점에 도달할 때까지 세포의 움직임을 계속 추적합니다.데이터를 얻으려면 측정 항목 만들기를 선택합니다. 측정 메뉴에서 화면 중앙에 창이 나타납니다. 이 창에서 호출된 새 측정 항목을 선택하고 측정 항목의 이름을 입력합니다.정량 분석을 위한 매개변수가 포함된 파일이 타임랩스 파일 아래에 나타납니다. 이 측정 항목 파일을 두 번 클릭하면 분석된 세포의 단일 트랙을 시각화할 수 있는 창으로 열 수 있습니다. 표시 옵션에서 추적된 지점을 선택하고 이동 경로에 대해 시각화해야 하는 셀을 선택합니다.마이그레이션 파라미터를 분석하려면 측정 항목 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 텍스트 파일로 내보낸 다음 Excel과 같은 프로그램에서 가져올 수 있습니다. 이것은 쥐의 시상 뇌 절편에서 가져온 신경 아세포의 회전 디스크 타임 랩스 이미지입니다. 플라스미드 이미지를 발현하는 GFP의 전기천공법 후 5일은 1시간 간격입니다.각 패널은 4미크론 떨어진 28개의 연속 이미지를 Zack 프로젝션한 것입니다. 화살촉은 RMS를 따라 후각구를 향해 이동하는 4개의 대표적인 신경아세포를 나타냅니다. 이들은 4개의 신경아세포의 타임랩스 영상에서 얻은 대표적인 이동 경로입니다.이 그래프는 두 개의 대표적인 신경아세포의 시간에 따른 이동 거리를 보여줍니다. 이 세포는 전형적인 염분 운동성 행동을 나타냅니다. 이 동영상은 GFP가 migrating이라고 표시된 마우스 RMS 섹션을 보여줍니다.플라스미드를 발현하는 A GFP의 전기천공법 5일 후에 얻어지는 신경아세포. 후각 전구는 오른쪽 하단 모서리를 향해 보이지 않는 곳에 있습니다. 컨포칼 Z 스택은 회전하는 디스크 컨포칼에서 캡처되었습니다.120미크론 간격으로 3시간 동안 3분마다 20개의 대물렌즈를 사용하면 재생 속도는 초당 10프레임입니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험을 시작하기 전에 전기천공법을 연습하고 가능한 한 최단 시간에 급성 뇌 절편 배양을 신중하게 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 출생 후 쥐의 뇌에서 신경아세포 이동을 시각화하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 중요한 단계입니다. 여기에 설명되는 프로토콜은 DNA / 작은 머리핀 RNA (shRNA를) nucleofection 및 설치류 출생 주동이의 철새 스트림에서 격리 neuroblasts와 3D 마이그레이션 분석을 사용하여 neuroblast 마이그레이션 후보 규제 기관의 역할을 조사 할 수 있습니다.

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

학습하세요 마우스 출생 후 뇌에서 신경아세포 이동을 GFP 전기천공과 시간 경과 영상으로 분석하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 뇌 발달 연구에 활용됩니다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

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