섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

본 절차의 전체적인 목표는 피브린 겔 시스템에서 세포-매트릭스 상호작용이 섬유 재정렬 및 매트릭스 리모델링 활동에 미치는 영향을 관찰하고 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 환경 제어 바이오리액터 내의 커버 글라스 위에 마이크로비즈를 포함하는 3차원 피브린 겔을 중합합니다. 두 번째 단계로는 고농도의 세포 현탁액을 준비하여 섬유아세포 클러스터 또는 X explant를 겔 표면에 기하학적 패턴으로 배치합니다.

다음으로, 48시간 동안 15분 간격으로 미분 간섭 대비 현미경(differential interference contrast microscopy)을 사용하여 샘플을 촬영합니다. 마지막 단계는 디지털 이미지 상관법(digital image correlation)을 통해 겔의 서로 다른 영역에서 발생하는 변형(strain) 형태로 피브린의 재구성과 리모델링 정도를 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 이 외식편 시스템을 통해 세포를 단순한 기하학적 패턴으로 배치할 수 있으며, 이를 통해 세포 주도의 매트릭스 리모델링 및 섬유 재정렬의 기저 메커니즘을 더 쉽게 시각화하고 탐구할 수 있습니다.

이 방법은 매우 공간적이고 시간적인 기계적 신호가 세포 행동에 미치는 영향과 그로 인해 주변 조직 매트릭스에 발생하는 변화는 무엇인지와 같은 기계 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생인 Arabic de Jesus가 진행하겠습니다. 37°C로 예열된 식염수에 피브리노겐을 하룻밤 동안 천천히 용해시켜 33.3 mg/mL의 스톡 용액을 만듭니다. 원하는 기하학적 간격에 따라 각 x 이식편의 위치를 배치하기 위해 필터 위에 스텐실을 준비합니다.

각 점의 간격은 약 1~2 mm가 되도록 합니다. 이 거리는 외식편 간의 섬유 정렬을 생성하기 위한 이상적인 간격에 해당합니다. 다음으로, 70% ethanol을 사용하여 바이오리액터의 모든 구성 요소를 철저히 세척하고, 세척된 구성 요소를 배양 시작 전 2~3시간 동안 조직 배양 후드의 UV 램프 아래에 둡니다.

바이오리액터 구성품의 멸균이 완료되면, 테이프를 사용하여 샘플이 준비될 60 millimeter 직경 커버 글라스 영역 아래에 스텐실을 부착합니다. 다음으로 마이크로비드 현탁액을 준비하고, 이어서 피브리노젠과 트롬빈을 준비합니다. 스톡 솔루션의 경우, 마이크로 원심분리 튜브에 Microbead 스톡 솔루션 0.017 milliliters와 DMEM 0.149 milliliters를 혼합하여 밀리리터당 1,000만 개의 비드 농도로 맞춥니다.

그 다음, 비드를 분산시키고 용액을 균질화하기 위해 현탁액을 10분 동안 초음파 처리합니다. 15 mL 원심분리 튜브에 0.22 mL의 피브리노겐 스톡 용액, 0.44 mL의 20 mM HEPES 버퍼, 그리고 0.1667 mL의 마이크로비드 용액을 넣습니다. 성분들을 부드럽게 혼합한 후, 튜브를 별도의 15 mL 원심분리 튜브를 이용해 얼음 위에 놓습니다.

다음 성분을 함께 혼합합니다. 25 units/mL의 식염수에 용해된 thrombin 32.8 µL, 20 mM HEPES buffer 131 µL, 그리고 2 M calcium chloride 2.46 µL입니다.

다음으로, 준비된 트롬빈과 피브리노겐 용액을 피펫으로 5~10회 정도 위아래로 섞어 용액이 균일하게 분포되도록 주의 깊게 혼합합니다. 혼합 시 피펫의 액체를 완전히 배출하지 않음으로써 혼합물에 기포가 유입되는 것을 최소화하십시오. 혼합된 용액을 커버 글라스 위의 8mm 정사각형 PDMS 몰드에 가능한 한 빨리 피펫팅하고, 실온에서 겔이 중합되도록 둡니다.

트롬빈을 첨가하면 중합 후 약 30초 이내에 용액이 빠르게 겔화됩니다. 바이오리액터를 밀폐하고 세포 설명편(explant)을 준비하십시오. T 75 플라스크에서 70~90% 합류(confluent)된 인간 진피 섬유아세포를 트립신을 사용하여 수확한 후, 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 바이오리액터를 생물 안전 작업대(biosafety cabinet)로 옮기고 무균 조건에 따라 뚜껑을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 배지를 흡입하여 제거하고, 10% FBS가 포함된 DMEM에서 세포 펠릿을 최종 농도 20 million cells/mL가 되도록 재현탁합니다.

다음으로, 마이크로 피펫에 세포를 채운 후 중합된 피브린 겔에 세포 현탁액 0.3 µL를 주입하여 엑스플랜트(explants)를 생성합니다. 스텐실의 패턴에 따라, 각 엑스플랜트는 약 6,000개의 세포를 포함해야 합니다. 겔 위에 엑스플랜트 배치를 완료하면 바이오리액터를 밀봉합니다.

다음으로, 가열 블록을 삽입하고 온도 조절기에 열전대를 연결합니다. 온도 조절기를 37 °C로 설정하고 겔을 1시간 동안 배양하여 세포가 가라앉아 피브린 매트릭스에 부착되도록 합니다. 그 후 5% CO2 환경에서 2~3시간 동안 배양하고 10% fetal bovine serum, 1% penicillin streptomycin, 0.1% amphotericin B 및 10 µg/mL aprotinin이 첨가된 DMEM 약 5 mL를 바이오리액터 챔버에 직접 넣습니다.

그런 다음 바이오리액터를 다시 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 유입구 포트의 바브 피팅(barbed fitting)을 통해 5 mL의 이산화탄소 조건 배지를 추가로 주입하여 바이오리액터를 완전히 채우고, 형성된 기포를 조심스럽게 제거합니다. 추가적인 5% 이산화탄소 조건 배지가 채워진 10 mL 또는 30 mL 주사기를 사용하여 주사기 펌프를 설정합니다. 루어 락(lure lock)이 장착된 멸균 튜브를 사용하여 주사기를 바이오리액터 덮개의 유입구 포트에 직접 연결합니다.

시린지 펌프의 관류 속도를 0.01 milliliters per minute로 설정합니다. 그 다음, 수정된 튜브 조각들을 두 배출구 포트에 연결하고 끝부분을 100 milliliter 비커에 넣습니다. 폐액을 수집하려면, 실험실 잭을 사용하여 유입구와 유출구 공급 장치의 높이를 조절해 바이오리액터 공급 장치 내에 압력 차이가 발생하지 않도록 합니다.

실험 전 과정 동안 5% 이산화탄소로 조건화된 신선한 배지를 바이오리액터에 공급합니다. pH를 유지하고 영양분을 공급하며 노폐물을 제거하기 위해, 배지가 채워진 10 milliliter 주사기 하나로 약 16시간 동안 유지할 수 있습니다. 20 XDIC 대물렌즈를 현미경 뷰포트 아래에 배치하고 편광판, 분석기와 프리즘이 모두 제대로 설치되었는지 확인하십시오.

그 다음 이미징 소프트웨어를 엽니다. 대물렌즈의 초점을 세 개의 x explan 사이 영역에 맞추고, 이미징 소프트웨어에 이 위치의 X, Y, Z 좌표를 저장합니다. x explan 사이와 주변의 전체 영역을 촬영하려면, 대형 이미지 획득 옵션을 선택하고 촬영 영역의 크기를 지정합니다.

이를 통해 지정된 영역 주변의 여러 이미지를 획득하여 커다란 타일형 이미지를 생성할 수 있으며, 광강도와 노출 시간을 가능한 최저값으로 설정하십시오. 이는 세포, 마이크로비드 및 피브린 섬유를 구별할 수 있는 충분한 해상도를 유지하면서 광독성으로 인한 세포 사멸을 방지하는 데 도움이 됩니다. 본 실험에서는 겔 내 광산란 비드의 밀도가 높아 피브린 섬유가 보이지 않으므로, 피브린 섬유를 관찰하려면 비드 밀도나 겔 두께를 줄이십시오.

다음으로, 변형 추적(strain tracking)을 시작합니다. 먼저 사용자 정의 MATLAB 코드를 생성하거나 다운로드한 후, 겔 전체에 분포된 마이크로비즈를 참조점으로 사용하여 이미지를 정렬(register)합니다. 이미지 정렬을 통해 매회 정확히 동일한 위치에서 이미지가 획득되도록 합니다.

15분마다 타일형 이미지를 캡처하여 설명된 샘플 간의 섬유 재정렬을 관찰하였습니다. 48시간 동안 타일형 이미지에서 개별 영역을 추출하고 변형 추적 알고리즘으로 분석하였습니다. 마이크로비드 변위로부터 국소 변형을 측정하기 위해, 스트랩에 해당하는 섬유 재정렬 영역의 최대 주변형 분포를 등고선도(contour plot)로 나타내었습니다.

숙련된 경우, 이 기술은 적절히 수행되었을 때 약 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 콜라겐 및 세포골격 단백질의 형광 표지와 세포 이동의 정량화와 같은 다른 방법들을 수행하여, 조직 리모델링에 어떤 기계생물학적 경로가 관여하는지, 그리고 이러한 과정들이 다양한 생화학 물질에 의해 어떻게 조절되는지와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.