Name: 섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 배우세요 섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 및 섬유 재배열을 시차 현미경으로 관찰하고 디지털 이미지 상관 분석으로 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 세포-기질 상호작용과 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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우리는 조지 Giudice와 스티븐 엘리아슨이 변형 추적 알고리즘에 도움을 준 인간의 진피 섬유아세포와 라메쉬 라구병증을 기부해 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 지원은 국가 필요 펠로우십 분야의 미국 교육부 대학원 지원 (GAANN P200A120071)에 의해제공되었다.

1. 스텐실 준비
파라필름에 스텐실을 준비하여 원하는형상(그림 1A 및1B)에 따라 각 각 각 절제물의 위치를 레이아웃합니다. 공간은 각각 약 1-2mm 떨어져 익스플. 이 거리는 각성 사이의 섬유 정렬을 생성하기위한 이상적인 간격에 해당합니다. 샘플이 테이프로 준비될 커버글래스 영역 아래에 스텐실을 부착합니다.
2. 살균
실험 전에 70% 에탄올을 사용하여 생물 반응기의 모든 성분을 철저히 청소하고 UV 빛 아래에서 2-3 시간 동안 살균하십시오. 대체 용기가 생물 반응기 대신에 사용되는 경우 적절한 살균 기술을 사용해야 합니다. 유리 바닥 페트리 접시사용에 대한 의견은 4.12 단계를 참조하십시오.
3. 피브린 젤 준비
생물 반응기의 성분이 살균 된 후, 커버 글래스의 표면에 피브린 젤의 얇은 층을 캐스팅. 6.6 mg /ml 피브린 젤을 만들기위한 피브리노겐 및 트롬빈 재고 솔루션을 준비하기위한 세부 사항은 Sander 외에서설명된다. 13 Ye 외에의한 유사한 프로토콜. 19 만들기위한 3.3 mg / ml 피브린 젤은 JoVE 웹 사이트에서도 볼 수 있습니다.
<ol><li>1,000만 개의 구슬/ml 농도로 DMEM에서 형광 마이크로비드 의 용액을 준비합니다. 구슬은 젤 변위를 추적하는 데 사용됩니다. 이러한 농도를 달성하기 위해 0.017 ml의 마이크로비드 스톡 용액과 0.149 ml의 DMEM을 마이크로원심분리기 튜브에 결합합니다.</li>
	<li>이 서스펜션을 10분 동안 초음파 처리하여 구슬을 분산시키고 용액을 균질화합니다.</li>
	<li>Fibrin 솔루션 - 15ml c-tube에서 0.22 ml의 피브리노겐 스톡 용액을 20m HEPES 버퍼0.44 ml로 섞습니다. 3.1 단계에서 생성된 마이크로비드와 함께 DMEM0.1667 ml를 추가합니다.</li>
	<li>Thrombin 솔루션 - 별도의 15ml c-tube에서, 함께 혼합 0.0328 혈전 재고 용액의 ml, 20 mM HEPES 버퍼의 0.131 ml, 2 M CaCl2의0.00246 ml.</li>
	<li>혈전 용액(step 3.4)을 피브리노겐 용액(Step 3.3)과 조심스럽게 혼합하여 용액이 균등하게 분배될 때까지 5-10배 위아래로 피펫팅합니다. 가능한 한 거품을 도입하지 마십시오. 생산된 거품의 양을 줄이려면 믹싱 하는 동안 파이펫을 완전히 배출하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>혈소판의 첨가는 신속하게 겔화용액을 유발할 것입니다(~30초). 가능한 한 빨리 커버 글래스에 혼합 된 용액을 피펫. 젤이 RT에서 중합되도록 허용합니다.</li>
	<li>생물 반응기를 밀봉하고, 가열 블록을 삽입하고, 온도 컨트롤러에 열전대를 연결합니다. 젤을 37°C에서 15-30분 동안 배양합니다.</li>
</ol>4. 셀 엑스플랜트 준비
<ol><li>인간 진피 섬유아세포 세포를 함유하는 T-75 플라스크에서 배지를 제거한다.</li>
	<li>조심스럽게 혈청 단백질을 제거하기 위해 약 5 ml의 인산염 완충식염(PBS)으로 표면을 헹구습니다. 트립신-EDTA 1 ml를 넣고 3분 동안 또는 세포가 들어올릴 때까지 배양합니다.</li>
	<li>세포가 들어 올린 후 5 분 동안 200 x g의 원심 분리기에서 서스펜션을 아래로 회전시하십시오. 상체를 제거하고 2천만 개의 세포/ml의 최종 농도를 허용하는 DMEM의 부피로 펠릿을 재놓습니다.</li>
	<li>세포가 원심분리기에서 아래로 회전하는 동안 가열 블록과 열전대에서 생물 반응기를 분리합니다. 생물 반응기를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 회의적인 기술에 따라 뚜껑을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>스텐실의 패턴에 따라 중합된 피브린 젤에 세포 현탁액의 0.3 μl을 배관하여 이질을 만듭니다. 각 식은 약 6,000 개의 세포를 포함해야합니다. 낮은 볼륨 마이크로피펫 팁(0.1-10 μl)이 사용되었는지 확인합니다.</li>
	<li>세포가 37°C에서 1시간 동안 피브린 매트릭스에 정착하고 부착하도록 허용한다.</li>
	<li>생물 반응기는 여전히 열려, 10% 태아 소 혈청으로 보충 DMEM의 약 5 ml를 추가 (FBS), 1% 페니실린-연쇄 상 감신, 0.1% 암포테리신 B, 그리고 10 mg/ml aprotinin 생물 반응기 챔버에 직접. DMEM은 중탄산염 버퍼링되어 있으며 중립 pH를 유지하기 위해 5% CO2가 필요합니다. 바이오액터는CO2와함께 공급되지 않기 때문에, 사용 전에 2-3 시간 동안 5%CO2를 가진 인큐베이터에서 배지를 조건화한다. Aprotinin은 널리 피브린 분해의 속도를 감소시키기 위해 사용되는 세린 프로테아제억제제이다(20).</li>
	<li>생물 반응기를 다시 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 인렛 포트의 가시 피팅을 통해 CO2 조건 배지 5ml를 추가로 전달합니다. 매체를 천천히 분배하고 생물 반응기 챔버의 전체 부피가 채워졌는지 확인합니다. 생체 반응기에서 형성되는 기포를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>pH를 유지하고 영양분을 공급하며 폐기물을 제거하기 위해 실험 전반에 걸쳐 생물 반응기에 5%CO2 의 조건배지를 공급한다. 주사기 펌프에 10ml 또는 30ml 주사기가 5% CO2 조절 매체로 채워진 펌프를 설치합니다. 주사기를 생물 반응기 뚜껑의 입구 포트에 직접 연결하여 Luer-lock 장착 멸균 튜브를 장착합니다. 남성 피팅을 제거하고 생물 반응기의 가시 피팅에 튜브를 부착합니다(그림 1C참조).</li>
	<li>관류 속도를 0.01 ml/min으로 설정합니다. 수정된 튜브 조각을 콘센트 포트에 연결하고 끝을 100ml 비커에 넣고 폐기물을 수거합니다.</li>
	<li>실험실 잭을 사용하여 인렛 및 콘센트 피드의 높이를 설정하여 생체 반응기에서 압력 차가 발생하지 않도록 합니다(참조를 위해 도 1D참조).</li>
	<li>생물 반응기를 사용할 수없는 경우 유리 상판35mm 유리 바닥 페트리 접시에 샘플을 준비합니다. 사용할 특정 목표 집합에 최적화된 커버슬립 크기를 사용하십시오. 페트리 접시에 제조 된 샘플은 37 ° C 및 5 % CO2에서인큐베이터에서 유지되어야한다. 참고: 폴리스티렌은 빛을 탈극화하고 DIC 이미징을 방해하므로 DIC 이미징이 수행될 경우 유리 상판을 사용해야 합니다. 위상 콘트라스트는 적합한 대체 이미징 양식입니다. 인큐베이터와 현미경 사이의 접시를 옮기면 이미지 등록이 어려워집니다. 이미지가 제대로 등록되지 않은 경우 섹션 6에서 계산된 변형이 정확하지 않습니다.</li>
</ol>5. 타임랩스 이미징
<ol><li>시료가 준비되면, 생물 반응기를 다시 밀봉하고, 가열 블록과 열전대를 다시 연결하고, 생물 반응기 온도를 37 °C로 설정합니다.</li>
	<li>생체 반응기를 현미경 장착 동력 단계에 설정합니다. 뷰 포트 아래에 20배 DIC 목표를 배치합니다. 낮은 배율 목표는 특히 정밀 동력 단계를 사용할 수 없는 경우에 허용됩니다. 편광기, 분석기 및 프리즘이 모두 제자리에 있는지 확인합니다. 또는 위상 대비를 사용하여 샘플을 이미지화할 수도 있습니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>세 가지 구역 사이의 영역에 목표를 집중합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어에 이 위치의 좌표(x, y 및 z)를 저장합니다.</li>
	<li>확장 사이와 주변의 전체 영역을 이미지화하기 위해 큰 이미지를 획득하고 영역의 크기를 지정하는 옵션을 선택합니다. 이렇게 하면 지정된 영역 주위에 여러 이미지를 수집하고 샘플의 더 큰 영역을 나타내는 타일 이미지가 생성됩니다.</li>
	<li>노출 시간과 광 강도를 가능한 가장 낮은 값으로 설정하여 광독성으로 인한 세포 사멸을 방지하면서 세포, 마이크로비드 및 피브린 섬유를 구별하기에 충분한 해상도를 제공합니다.</li>
</ol>6. 스트레인 트래킹
변형 추적 소프트웨어에 대한 자세한 내용 및 지침(그림 2)사용 은 Raghupathy 등을 참조하십시오. 21 알고리즘은 <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>다운로드 할 수있는 사용자 정의 MATLAB 코드입니다. DIC 이미지는 종종 변형 추적에 충분한 텍스처를 가지고 있습니다. 마이크로비드는 계산된 변형 필드에 대한 검사 역할을 하기 위해 포함되어 있습니다. 변형 추적이 수행될 경우 얻은 이미지가 동일한 위치에서 촬영되어 이미지가 등록되는 것이 중요합니다. 등록되지 않은 이미지는 가짜 균주를 생성합니다.

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 프로토콜은 세포 매개 ECM 리모델링과 관련된 역학을 관찰하고 정량화하기 위한 목적으로 개발되었다. 이러한 과정은 다수의 생물학적 현상의 기초와 엔지니어링 조직에 대한 중요한 의미를 갖는다2,22,흉터1,23을감소시키고, 병리학 조직을 리모델링12,24. 시간 경과 DIC 현미경 검사법의 사용은 세포 견인력의 결과로 발생하는 피브린 섬유의 변위와 정렬을 해결하고 정량화 할 수 있습니다. 여기서 관찰된 재구성은 리모델링 과정의 첫 번째 단계이며, 콜라겐11에서관찰된 조직 패턴을 따른다. 개편은 피브린 분해와 ECM 합성의 조합이 뒤따릅니다. 리모델링의 재구성 단계는 몇 시간에서 며칠 동안 일어나는 반면, 리모델링 과정의 합성 단계는13을전개하는 데 몇 주가 걸립니다. 여기에 설명된 시스템은 몇 주 동안 작동할 수 있으므로 이러한 후기 이벤트를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.
이...

세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구는 세포 채워진 콜라겐 젤1,2이다. 겔은 조직의 생체 내 특성에 더 가깝고 전통적인 2D 배양3에서제공하는 것보다 세포 행동을 이해하는 데 더 적합한 3D 환경을 제공한다. 섬유아세포가 콜라겐 젤 내에서 균질하게 분포된 초기 연구에 따르면 세포는 콜라겐 섬유를 빠르게 통합하고 겔4,5을압축하는 것으로 나타났다. 자유 부동 젤의 수축 섬유 아세포는 겔이 완전히 다짐1,6,7에도달 한 직후 정지 상태로 전환한다. 경계에 제약이 있는 겔의 섬유아세포는 활성, 합성 상태8에 남아 있으며 겔 형상 및 외부 제약 에 의존하는 방식으로 섬유 정렬을 생성합니다5,9. 세포 활동의 차이는 세포가 젤의 콜라겐 섬유에 대한 통합을 통해 견인력을 발휘함에 따라 발생하는 내부 장력(또는 그 부족)의 결과로 나타난다.
이 기술의 변이체는 콜라겐 젤 내에서 떨어져 섬유아세포 이질(즉, 세포의 덩어리)을 배치하고 세포 매트릭스 상호 작용을 관찰하고 각기 (때로는 인대 와 같은 스트랩이라고도 함)10-12사이의 섬유 정렬의 점진적 개발을 포함한다. 각기 시스템의 주요 장점은 세포를 간단한 기하학적 패턴으로 배열할 수 있게 해주므로 세포 중심의 섬유 재조정의 메커니즘을 쉽게 시각화하고 조사할 수 있다는 것입니다. 이러한 정렬 패턴은 주로 세포 견인력, 세포 공간 분포, 겔 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 의존하며 글로벌 조직, 기계적 기능 및 국소 기계환경에서중심적인 역할을 하기 때문에 이해하는 것이 중요하다.
조직 공학 분야에서, 기계적으로 기능적, 엔지니어링 조직을 생산하기위한 하나의 전략은 엔지니어링 조직이 네이티브 조직의 것을 모방 섬유 정렬을 소유할 수 있도록 세포 다짐에서 발생하는 섬유 정렬 패턴을 제어하는 것을 포함한다14,15. 이러한 정렬은 엔지니어링 된 조직이 네이티브 조직의 복잡한 기계적 행동을 복제하는 데 필요하다고 믿습니다. 이 전략의 변형은 콜라겐 젤을 피브린젤(16)으로대체하는 것이다. 피브린 젤은 다짐 시 콜라겐 젤과 유사한 정렬 패턴을 개발합니다. 시간이 지남에 따라 피브린은 분해되고 초기 피브린 섬유 정렬 패턴을 따르는 세포 합성 ECM로 대체됩니다. 그 결과 엔지니어링 된 구조는 콜라겐 젤 유래 구문(17)에비해 기계적 특성을 크게 향상시켰다.
피브린 젤의 정렬 프로세스 및 후속 리모델링 이벤트는 복잡하고 제대로 이해되지 않은 방식으로 진행됩니다. 이러한 상호 작용과 세포 거동 및 ECM 리모델링에 미치는 영향을 더 잘 특성화하기 위해, 우리는 각성 방법에 기초한 절차를 개발했습니다. 이 방법에서, 섬유아세포 각질은 다른 기하학적 패턴의 피브린 젤에 위치한다. 젤은 환경 제어, 현미경 장착 바이오 반응기(18)에서유지되며, 압축 및 섬유 재정렬 과정은 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경 검사법으로 모니터링됩니다. 변위 필드는 사용자 지정 알고리즘으로 정량화됩니다. 이러한 실험에서 얻은 데이터는 조직 엔지니어링 전략 최적화, 상처 치유 개선 및 병리학 조직 리모델링 을 포함하여 여러 과정에 광범위한 영향을 미칩니다.

<table><tbody><tr><td>시그마-알드리치</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>시그마-알드리치</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>시그마-알드리치</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>시그마-알드리치</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>시그마-알드리치</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분자 프로브</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotense 생물 반응기</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti-Eclipe 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td># 0 35mm 유리 바닥 페트리 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td># 0 35mm 유리 상단 페트리 접시</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 Luer 피팅, Luer 끝이 있는 PVC 튜브</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

콜라겐과 피브린 젤에 내장된 세포는 겔 섬유에 견인력을 부착하고 발휘합니다. 이러한 힘은 젤 미세 구조의 로컬 및 글로벌 재구성 및 재조정으로 이어질 수 있습니다. 이 과정은 세포의 위치, 젤의 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 부분적으로 의존하는 복잡한 방식으로 진행됩니다. 이러한 변수가 글로벌 섬유 정렬 패턴을 생성하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 기하학적으로 간격이 있는 각질(섬유아세포의 클러스터) 사이의 압축 공정을 관찰하기 위해 환경 제어 생물 반응기와 결합된 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 현미경 을 사용합니다. 그런 다음 이미지를 사용자 지정 이미지 처리 알고리즘으로 분석하여 변형맵을 가져옵니다. 이 기술에서 얻은 정보는 상처 치유, 질병 개발 및 조직 공학 응용 분야의 프로세스를 이해하는 데 중요한 영향을 미치는 다양한 세포 매트릭스 상호 작용의 기계생물학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

조직 리모델링은 세포와 주변 매트릭스 사이의 상호 물리적 상호 작용에 의해 부분적으로 구동되는 복잡한 과정입니다. 세포는 주변 섬유를 재구성하고 섬유 네트워크에서 장력을 생성합니다. 섬유와 기계적 환경의 정렬은 차례로 세포 행동을 제어하므로 세포와 매트릭스 가 전 세계적으로 재구성되어 리모델링 된 조직을 생성합니다. 본 실험에서, 항종의 세포는, 처음에 형태학에서 둥근, 겔로 확장하고 피브린 섬유에 부착하기 시작했다(도 3). 세포는 겔을 통해 전파되는 견인력을 발휘하고, 결합 사이의 축에 평행하게 유도된 섬유 정렬을 유도하였다. 몇 시간 내에 "스트랩"이 보이게되었습니다(그림 3A). 스트레인 측정은 또한 가장 큰 균주가 축으로 횡단되는 것을 나타내었습니다(그림3D 및 3E). 이 지역의 섬유는 축쪽으로 자유롭게 변환할 수 있기 때문에 균주는 이 지역에서 가장 높습니다.
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시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

본 절차의 전체적인 목표는 피브린 겔 시스템에서 세포-매트릭스 상호작용이 섬유 재정렬 및 매트릭스 리모델링 활동에 미치는 영향을 관찰하고 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 환경 제어 바이오리액터 내의 커버 글라스 위에 마이크로비즈를 포함하는 3차원 피브린 겔을 중합합니다. 두 번째 단계로는 고농도의 세포 현탁액을 준비하여 섬유아세포 클러스터 또는 X explant를 겔 표면에 기하학적 패턴으로 배치합니다.다음으로, 48시간 동안 15분 간격으로 미분 간섭 대비 현미경(differential interference contrast microscopy)을 사용하여 샘플을 촬영합니다. 마지막 단계는 디지털 이미지 상관법(digital image correlation)을 통해 겔의 서로 다른 영역에서 발생하는 변형(strain) 형태로 피브린의 재구성과 리모델링 정도를 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 이 외식편 시스템을 통해 세포를 단순한 기하학적 패턴으로 배치할 수 있으며, 이를 통해 세포 주도의 매트릭스 리모델링 및 섬유 재정렬의 기저 메커니즘을 더 쉽게 시각화하고 탐구할 수 있습니다.이 방법은 매우 공간적이고 시간적인 기계적 신호가 세포 행동에 미치는 영향과 그로 인해 주변 조직 매트릭스에 발생하는 변화는 무엇인지와 같은 기계 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생인 Arabic de Jesus가 진행하겠습니다. 37°C로 예열된 식염수에 피브리노겐을 하룻밤 동안 천천히 용해시켜 33.3 mg/mL의 스톡 용액을 만듭니다. 원하는 기하학적 간격에 따라 각 x 이식편의 위치를 배치하기 위해 필터 위에 스텐실을 준비합니다.각 점의 간격은 약 1~2 mm가 되도록 합니다. 이 거리는 외식편 간의 섬유 정렬을 생성하기 위한 이상적인 간격에 해당합니다. 다음으로, 70% ethanol을 사용하여 바이오리액터의 모든 구성 요소를 철저히 세척하고, 세척된 구성 요소를 배양 시작 전 2~3시간 동안 조직 배양 후드의 UV 램프 아래에 둡니다.바이오리액터 구성품의 멸균이 완료되면, 테이프를 사용하여 샘플이 준비될 60 millimeter 직경 커버 글라스 영역 아래에 스텐실을 부착합니다. 다음으로 마이크로비드 현탁액을 준비하고, 이어서 피브리노젠과 트롬빈을 준비합니다. 스톡 솔루션의 경우, 마이크로 원심분리 튜브에 Microbead 스톡 솔루션 0.017 milliliters와 DMEM 0.149 milliliters를 혼합하여 밀리리터당 1,000만 개의 비드 농도로 맞춥니다.그 다음, 비드를 분산시키고 용액을 균질화하기 위해 현탁액을 10분 동안 초음파 처리합니다. 15 mL 원심분리 튜브에 0.22 mL의 피브리노겐 스톡 용액, 0.44 mL의 20 mM HEPES 버퍼, 그리고 0.1667 mL의 마이크로비드 용액을 넣습니다. 성분들을 부드럽게 혼합한 후, 튜브를 별도의 15 mL 원심분리 튜브를 이용해 얼음 위에 놓습니다.다음 성분을 함께 혼합합니다. 25 units/mL의 식염수에 용해된 thrombin 32.8 µL, 20 mM HEPES buffer 131 µL, 그리고 2 M calcium chloride 2.46 µL입니다.다음으로, 준비된 트롬빈과 피브리노겐 용액을 피펫으로 5~10회 정도 위아래로 섞어 용액이 균일하게 분포되도록 주의 깊게 혼합합니다. 혼합 시 피펫의 액체를 완전히 배출하지 않음으로써 혼합물에 기포가 유입되는 것을 최소화하십시오. 혼합된 용액을 커버 글라스 위의 8mm 정사각형 PDMS 몰드에 가능한 한 빨리 피펫팅하고, 실온에서 겔이 중합되도록 둡니다.트롬빈을 첨가하면 중합 후 약 30초 이내에 용액이 빠르게 겔화됩니다. 바이오리액터를 밀폐하고 세포 설명편(explant)을 준비하십시오. T 75 플라스크에서 70~90% 합류(confluent)된 인간 진피 섬유아세포를 트립신을 사용하여 수확한 후, 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 바이오리액터를 생물 안전 작업대(biosafety cabinet)로 옮기고 무균 조건에 따라 뚜껑을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 배지를 흡입하여 제거하고, 10% FBS가 포함된 DMEM에서 세포 펠릿을 최종 농도 20 million cells/mL가 되도록 재현탁합니다.다음으로, 마이크로 피펫에 세포를 채운 후 중합된 피브린 겔에 세포 현탁액 0.3 µL를 주입하여 엑스플랜트(explants)를 생성합니다. 스텐실의 패턴에 따라, 각 엑스플랜트는 약 6,000개의 세포를 포함해야 합니다. 겔 위에 엑스플랜트 배치를 완료하면 바이오리액터를 밀봉합니다.다음으로, 가열 블록을 삽입하고 온도 조절기에 열전대를 연결합니다. 온도 조절기를 37 °C로 설정하고 겔을 1시간 동안 배양하여 세포가 가라앉아 피브린 매트릭스에 부착되도록 합니다. 그 후 5% CO2 환경에서 2~3시간 동안 배양하고 10% fetal bovine serum, 1% penicillin streptomycin, 0.1% amphotericin B 및 10 µg/mL aprotinin이 첨가된 DMEM 약 5 mL를 바이오리액터 챔버에 직접 넣습니다.그런 다음 바이오리액터를 다시 밀봉합니다. 주사기를 사용하여 유입구 포트의 바브 피팅(barbed fitting)을 통해 5 mL의 이산화탄소 조건 배지를 추가로 주입하여 바이오리액터를 완전히 채우고, 형성된 기포를 조심스럽게 제거합니다. 추가적인 5% 이산화탄소 조건 배지가 채워진 10 mL 또는 30 mL 주사기를 사용하여 주사기 펌프를 설정합니다. 루어 락(lure lock)이 장착된 멸균 튜브를 사용하여 주사기를 바이오리액터 덮개의 유입구 포트에 직접 연결합니다.시린지 펌프의 관류 속도를 0.01 milliliters per minute로 설정합니다. 그 다음, 수정된 튜브 조각들을 두 배출구 포트에 연결하고 끝부분을 100 milliliter 비커에 넣습니다. 폐액을 수집하려면, 실험실 잭을 사용하여 유입구와 유출구 공급 장치의 높이를 조절해 바이오리액터 공급 장치 내에 압력 차이가 발생하지 않도록 합니다.실험 전 과정 동안 5% 이산화탄소로 조건화된 신선한 배지를 바이오리액터에 공급합니다. pH를 유지하고 영양분을 공급하며 노폐물을 제거하기 위해, 배지가 채워진 10 milliliter 주사기 하나로 약 16시간 동안 유지할 수 있습니다. 20 XDIC 대물렌즈를 현미경 뷰포트 아래에 배치하고 편광판, 분석기와 프리즘이 모두 제대로 설치되었는지 확인하십시오.그 다음 이미징 소프트웨어를 엽니다. 대물렌즈의 초점을 세 개의 x explan 사이 영역에 맞추고, 이미징 소프트웨어에 이 위치의 X, Y, Z 좌표를 저장합니다. x explan 사이와 주변의 전체 영역을 촬영하려면, 대형 이미지 획득 옵션을 선택하고 촬영 영역의 크기를 지정합니다.이를 통해 지정된 영역 주변의 여러 이미지를 획득하여 커다란 타일형 이미지를 생성할 수 있으며, 광강도와 노출 시간을 가능한 최저값으로 설정하십시오. 이는 세포, 마이크로비드 및 피브린 섬유를 구별할 수 있는 충분한 해상도를 유지하면서 광독성으로 인한 세포 사멸을 방지하는 데 도움이 됩니다. 본 실험에서는 겔 내 광산란 비드의 밀도가 높아 피브린 섬유가 보이지 않으므로, 피브린 섬유를 관찰하려면 비드 밀도나 겔 두께를 줄이십시오.다음으로, 변형 추적(strain tracking)을 시작합니다. 먼저 사용자 정의 MATLAB 코드를 생성하거나 다운로드한 후, 겔 전체에 분포된 마이크로비즈를 참조점으로 사용하여 이미지를 정렬(register)합니다. 이미지 정렬을 통해 매회 정확히 동일한 위치에서 이미지가 획득되도록 합니다.15분마다 타일형 이미지를 캡처하여 설명된 샘플 간의 섬유 재정렬을 관찰하였습니다. 48시간 동안 타일형 이미지에서 개별 영역을 추출하고 변형 추적 알고리즘으로 분석하였습니다. 마이크로비드 변위로부터 국소 변형을 측정하기 위해, 스트랩에 해당하는 섬유 재정렬 영역의 최대 주변형 분포를 등고선도(contour plot)로 나타내었습니다.숙련된 경우, 이 기술은 적절히 수행되었을 때 약 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 콜라겐 및 세포골격 단백질의 형광 표지와 세포 이동의 정량화와 같은 다른 방법들을 수행하여, 조직 리모델링에 어떤 기계생물학적 경로가 관여하는지, 그리고 이러한 과정들이 다양한 생화학 물질에 의해 어떻게 조절되는지와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

이 모델 시스템은 비파괴 방식으로 내생 콜라겐 (재) 조직 리얼 타임으로 공부하는 데 사용할 수있는 근섬유 채워진 섬유소 젤에서 시작됩니다. 모델 시스템은 서로 다른 세포 소스, 중간 첨가제와 함께 사용할 수있는, 매우 조정할 수 있으며, 특정 요구에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

엔지니어링 섬유소 기반 조직의 면역 조직 및 제약 조건의 적용에서 생성하고 세포와 콜라겐 (재) 조직을 유도하는 스트레인

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

피브린 하이드로겔과 함께 기계적으로 분리된 기질 혈관 분획(SVF)은 조직 공학 및/또는 상처 치유 목적을 포함한 다양한 적응증에 대해 생존 가능한 지방 유래 기질 세포를 위한 쉽고 효율적인 운반체를 제공합니다. 여기에서는 중개 연구 및 임상 응용을 위한 기계적 SVF(mSVF)-피브린 하이드로겔 구조체의 준비를 제시합니다.

기계적으로 분리된 Stromal Vascular Fraction과 Fibrin Hydrogel의 조합: 처리 프로토콜

배우세요 섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 및 섬유 재배열을 시차 현미경으로 관찰하고 디지털 이미지 상관 분석으로 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 세포-기질 상호작용과 조직 공학 연구에 활용됩니다.

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

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