Name: 관절염에 Progranulin의 보호 역할을 조사하기 위해 마우스의 수술로 유발 된 모델 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 배우세요 마우스에서 DMM 수술 모델을 구축하여 골관절염 연구를 수행하는 방법을. 프로그라눌린 결핍이 관절염 진행을 가중시키는 보호 역할을 확인하고 조직병리학적 분석으로 관절 손상을 평가합니다.

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이 작품은 NIH 연구 보조금 R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210 및 (CJ 리우에) 류마티스 연구 재단 질환 표적 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

동물에 관련된 수술의 모든 통증과 수술로 인한 불편을 최소화하기위한 노력으로 지역 기관의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을 받아야한다. 1. 준비하기 <ol><li> 수술 약 25 g의 체중과 8-12주 세 남성 C57BL / 6 마​​우스를 선택합니다. </li><li> 자일 라진 (5 ㎎ / kg)과 케타민 (40 ㎎ / kg)을 모두 함유하는 칵테일을 복강 내 주사를 통해 동물을 마취. </li><li> 면도칼로 무릎을 면도 후 수술 동물을 드레이프와 베타 딘, 알코올 (3x)로 수술 부위를 소독하고 연고와 마우스의 눈을 포함한다. </li></ol> 2. 수술 과정 <ol><li> 무릎 관절을 노출 1cm 길이 중간 파라 슬개골 절개를합니다. </li><li> 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 부드럽게 무릎 관절을 엽니 다. <ol><li> 길이 방향으로 무릎 관절 캡슐을 잘라2.1 단계에서 중간 파라 슬개골 절개를 통해. </li><li> 집게와 무릎 관절 캡슐을 해부하다. </li><li> 왼손으로 뒷발의 말단 부분을 쥐고, 집게로 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 수행합니다. 부드럽게 뒷다리를 잡고 발에 외상을 방지해야합니다. 공동 캡슐 해부 더 나은, 더 적은 힘은 전위를 만들기 위해 필요합니다. </li></ol></li><li> 연골 표면의 건조를 방지하기 위해 작업 중 관절 연골의 표면에 멸균 식염수 드립. </li><li> 경골 고원에 내측 반월 상 연골을 고정하는 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 내측 반월 상 연골 아래에있는 연골을 손상하지 마십시오. <ol><li> 대퇴골 내측 관절 융기 및 경골의 내측 고원 사이에 위치한다 내측 반월 상 연골을 확인합니다. </li><li> 경골 과간 융기와 내측 반월 상 연골의 측면을 연결하는 meniscotibial 인대를 확인합니다. </li><li> 하이를 잡고ND 손으로 부드럽게 포, 및 제 10 외과 블레이드를 사용하여 조심스럽게 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 연골 및 다른 인대 관절에 해치다가 발생하지 않도록하십시오. 많은 경우에, 커버 지방 패드쪽으로 당길 수 있지만 인대를 식별하기 위해 제거되어야 할 필요는 없다. </li></ol></li><li> 6-0 흡수성 봉합사와 무릎 관절 캡슐을 닫습니다. </li><li> 6-0 실크 봉합사로 피부를 닫습니다. </li></ol> 3. 수술 후 관리 <ol><li> 수술 후 통증을 최소화하기 위해 각 마우스의 수술 부위에 0.25 %의 부피 바카 인의 한 방울을 적용합니다. </li><li> 물과 음식을 무료로 운영 쥐를 둡니다. </li></ol> 4. 외과 DMM 모델의 조직 학적 점수 <ol><li> 지정된 시점에서 쥐를 희생 수술 후 (예를 들어, 사주, 8 주 및 12 주. 여기에 우리가 대표로 팔주의 결과를 보여 주었다). </li><li> 전체 무릎 관절은, 탈회, embe에게 고정되어파라핀으로 dded 다음 5 μm의 간격으로 순차적으로 단면. <ol><li> 10 번 블레이드와 전체 뒷다리를 잘라. </li><li> 조심스럽게 두 다리의 피부와 근육을 해부하고, RT에서 3 일 동안 4 % PFA에 샘플을 고정합니다. </li><li> PFA를 제거하고 물 샘플을 청소합니다. 그 후 2 주 동안 4 ° C에서 EDTA의 샘플을 석회. </li><li> 에탄올 그라데이션의 샘플을 탈수. 구체적으로, 다음 에탄올을 변경 및 O / N. 70 % 에탄올의 새로운 세트에서 샘플을 유지, 1 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플을 계속 그 후, 80 %의 샘플을 넣어 90 %의 에탄올 결과, 및 O / N. 100 % 에탄올 다음에, 각각 1 시간 동안 그들을 유지 </li><li> 에탄올을 제거하십시오. 1 시간 동안 oxylene에 샘플을 유지하고 oxylene의 새로운 세트로 변경합니다. 이 단계의 3 배를 반복합니다. </li><li> 라이카 삽입 센터를 사용하여 파라핀 금형에 샘플을 포함합니다. 그 후, 샘플을 회전 마이크로톰 (Leica의 RM225을 사용하여 5 ㎛의 절편으로 아르5, 독일) 다음 유리 슬라이드에 수집. </li><li> 직렬 시상 부분은 내측 관절 돌기의 중심으로 측면 외과의 중심에서 지역에 걸쳐있는 각각의 샘플에 대해 잘립니다. </li></ol></li><li> Safranin O 염색이 수행 이전 25 설명한대로 OARSI 채점 시스템을 통해 채점 및 통계 분석에 의해 이어진다. <ol><li> 첫째, oxylene에 슬라이드를 deparaffinize, 증류수에 에탄올 구배를 수화. 그 후, 슬라이드는 Weigert의 철은 Hematoxylin 솔루션, 0.05 % 빠른 그린 (FCF) 솔루션, 1 % 아세트산 용액, 0.1 % Safranin O 솔루션을 통해 염색된다. 수지 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다. </li><li> 조직 학적 점수에 대한 통계 분석을 수행, 연골과 연골 구조의 파괴의 비율에 프로테오글리칸 (붉은 색)의 손실에 따라 Safranin O 스테인드 슬라이드를 점수. </li></ol></li></ol>

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</ol>

우리는 여기에 우리가 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.

그것은 마우스의 변형이 DMM 모델 유도를 들어, 마우스의 서로 다른 균주 / 다음 C57BL6, 129/SvInJ 및 FVB 다음, 129/SvEv 균주에서 가장 높은 수준으로, DMM 후 OA의 정도를 변화 한 매우 중요하다고보고 N 26. DMM에 상대적으로 민감하다 우리가 본 연구에 사용 된 마우스 - 형질 전환 유전자의 많은 부분은 이러한 PGRN - /로 C57BL6 마우스에 설정됩니다. 유전자가 같은 FVB / N 마우스로 구분 변형을 기반으로하는 경우 그러나, DMM 유도하기 전에 감염 균주이 마우스를 역 교배 할 필요가있다. 연구는 이미 암컷 생쥐 수컷 쥐 27보다 덜 민감한 것으로 나타났습니다으로 DMM 유도에 사용되는 생쥐의 성별도 매우 중요합니다. 또한, DMM 작업에 대한 마우스의 나이는 8 주 오래에서 골관절염의 병인에 중요한 역할을 문학 29 일을 기준으로 이전 12주 다릅니다. 따라서, 동일 연령의 마우스는 이러한 효과를 제거하기 위해 작동...

또한 퇴행성 관절염으로 알려진 골관절염 (OA)는, 세계 인구의 15 %에 영향을 미치는 미국 내에서 46 만 명 이상, 그리고 윤 활막염, 연골의 변성 및 골극 형성 한 것을 특징으로한다. 그것은 유전 대사, 생체 역학, 생화학 적 요인의 복잡한 상호 작용의 결과 일 수있다. OA의 기본 메커니즘은 사회 과학을 회피하는 것을 계속한다. OA 2,3의 병인을 모방 수있는 수많은 동물 모델은 현재이 있습니다. 그것 때문에 다양한 유전자 변형 마우스의 유용성과 실험의 비용 효율성 양쪽의 생쥐 동물 모델을 확립하는 것이 중요하다. 실험 OA 모델의 여러 종류의 사이에, 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델의 수술 유도 불안정 때문에 그것의 좋은 재현성 및 OA를 개발하는 동안 상대적으로 느린 진행의 잘 받아 OA 모델입니다. 이러한 특성은 모두가다른 처리 또는 형질 전환 유전자 3-8 OA 진행의 평가를위한 핵심이었다. 그러나, 수술 OA 모델의 일관성은 수술하는 동안 그 결과 다양한 요인에 의해 영향을받는, 외과 마우스 모델의 적용은 제한된다. Progranulin (PGRN)는 각종 세포에서 발현 다기능 성장 인자이다. 그것은 PGRN 같은 상처 치유 09 종양 10, 11-15 및 염증 등의 각종 생리적 질병 과정에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 연구는 또한 PGRN의 부족이 인간과 생쥐 16-18 모두 신경계의 퇴행성 질환을 일으킬 수있는 것으로 나타났습니다. 그것은 PGRN 인간 관절 연골에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 그 수준은 상당히 OA 및 류마티스 관절염 (19)을 가진 환자의 연골 조직에서 증가된다. 또, PGRN 또한 연골 세포 증식 20, 분화 및 연골 내에서 중요한 역할을 담당개발 (21, 22) 중 성장판의 골화. 최근에, 우리는 PGRN가 TNF 수용체에 결합을 통해 TNF-α를 반감과 염증성 관절염 모델 13,14,23,24의 항 염증 기능을 전시하고 있다고 보도했다. 그러나, OA에 PGRN의 역할은, 특히 생체 내에서, 수수께끼로 남아있다. 생쥐 - 여기서, 우리는 수술 DMM 모델을 유도하고, 및 WT-PGRN / DMM 소재 모델을 확립 통해 OA 개발 PGRN의 역할을 조사하는 과정을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>No. 10 수술 블레이드</td><td>Feather</td><td>25-2976 # 10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 봉합</td>사 <td>응용 치과</td><td>WG-N53133</td><td></td></tr></tbody></table>

관절염에 progranulin의 보호 역할을 조사하기 위해 마우스의 수술로 유발 된 모델 구축

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

내측 반월 상 연골의 불안정은 (DMM) 모델은 생체 내에서 골관절염 (OA)의 병인에 많은 관절염 관련 분자의 병태 생리 학적 역할을 연구하기위한 중요한 도구입니다. 그러나, 세부, 특히 쥐에이 복잡한 모델을 구축하기위한 시각화 한 프로토콜은 사용할 수 없습니다. 여기에서 우리는 야생형 및 progranulin (PGRN) 이용했다 - / - 예 생쥐의 DMM의 모델을 유도하기위한 프로토콜,이 수술 유도 모델의 설립 다음 OA의 비교 발병을 소개하는대로 마우스. 생쥐에서 수행 된 작업은 menisco 경골 인대를 잘라 내측 반월 상 연골의 불안정을 야기 관절낭, 또는 DMM 작업을 개설 가짜 운전, 하나 있었다. 관절염의 심각도는 조직 학적 분석 (예 : Safranin O 염색), OA 관련 유전자의 표현, 연골 세포 외 기질 분자의 분해 및 골극 양식을 사용하여 평가 하였다ATION. 마우스,이 수술 유발 모델에서 더 심한 OA 표현형을 주도 PGNR 성장 인자의 손실 - DMM 작업이 성공적으로 야생형 및 PGRN - / 모두 OA의 개시 및 진행을 유도.

DMM의 모델은 성공적으로 생쥐에서 설립 PGRN의 결핍은 수술에 의한 OA 개발을 과장했다. 쥐 - 가짜와 DMM 작업 (그림 1) WT 및 PGRN - / 수행되었다. 8주 동작 후에, 마우스를 희생시키고, Safranin O 염색은 무릎 관절의 부분에서 수행 된, 조직학에 근거 관절염 점수의 통계적 분석 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 유사한 초기 조건 (상부 패널) 내재 Safranin O 염색에 기초 모의 운전 그룹의 두 유전자형 연골 명백한 퇴행이 없었다. 마우스 (빨간색 화살표) - 팔주 DMM 작업 (아래 패널) 후, WT 및 PGRN - / 모두 테오와 연골 구조의 파괴의 손실이 있었다. 두 프로테오글리칸 및 연골의 저하의 손실은 OA 표현형의 성공적인 유도를 제안한다. indicat 열 바DMM 작업 다음 내 그룹 구성원 사이의 변화를 에드. 그러나, 바는 상...

우리는 생쥐의 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델, 골관절염 (OA) 연구를위한 효과적인 도구의 불안정에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 progranulin가 OA의 병인에 보호 역할을한다는 것을 나타내는,이 모델을 사용하여 progranulincan 과장 OA 개발 및 진행의​​ 부족을 증명하고있다.

관절염에 Progranulin의 보호 역할을 조사하기 위해 마우스의 수술로 유발 된 모델 구축

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스에서 DMM 모델을 구축하고 DMM 수술 후 골관절염의 발병을 연구하는 것입니다. 동물 준비를 마친 후, 무릎 관절을 노출시키기 위해 무릎뼈 내측을 따라 1cm 길이의 종적 절개를 실시합니다. 다음으로 무릎 관절낭을 절개하고 무릎의 내측 탈구를 수행합니다.마지막 단계는 내측 반월상 연골 경골 인대를 절단하고 무릎을 봉합하는 것입니다. 최종적으로, 관절 구조의 파괴뿐만 아니라 단백질, 글리칸의 소실 및 골관절염을 확인하기 위해 조직병리학적 분석을 수행합니다. 중증도는 saffron O 염색의 MANKIN 점수를 사용하여 평가합니다.일반적으로, 이 방법을 처음 접하는 연구자는 생쥐를 대상으로 한 수술 과정을 직접 보지 않았다면 어려움을 겪을 가능성이 큽니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 세부 단계들을 학습하기 어렵고 현재는 현미경 하에서 수행되므로, 무릎 관절의 모든 구조를 명확하게 인식해야 합니다.이 모델을 확립하기 위해, 체중이 약 25g인 8~12주령의 수컷 C 57 black six 마우스에 마취를 실시하여 내측 반월상 연골 불안정화 또는 DMM 수술을 준비합니다. 그 다음 무릎 주변 부위를 제모한 후 안구에 안연고를 도포합니다. Betadine과 알코올로 해당 부위를 3회 멸균하고 수술용 포를 덮습니다.무릎 관절을 노출시키기 위해 1cm 길이의 종방향 내측 슬개旁 절개를 가하여 수술을 시작합니다. 그다음, 대퇴골이 노출될 때까지 내측 슬개旁 절개창을 통해 무릎 관절낭을 종방향으로 조심스럽게 절개합니다. 이어 포셉을 사용하여 절개 부위를 더 넓고 깊게 만들어 관절낭 구조를 느슨하게 합니다.한 손으로 뒷발의 말단 부위를 부드럽게 잡습니다. 포셉을 사용하여 슬개골과 슬개 인대를 외측으로 탈구시킵니다. 관절낭이 세로 방향으로 절개되었다면 탈구 시 큰 힘이 필요하지 않습니다. 수술의 남은 과정 동안 관절 연골 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 멸균 생리식염수를 계속 떨어뜨려 줍니다.이제 대퇴골의 내측 과와 경골의 내측 고원 사이에 위치한 내측 반월판을 식별하십시오. 필요한 경우, 반월판 경골 인대를 덮고 있는 지방 패드를 옆으로 밀어 내측 반월판의 외측과 경골의 과간융기를 연결하는 반월판 경골 인대를 노출시키십시오. 한 손으로 뒷발을 부드럽게 잡습니다.10번 수술용 칼날을 사용하여 내측 반월상 연골 경골 인대를 조심스럽게 절단하여 DMM 수술을 수행합니다. 관절 연골이나 다른 인대가 손상되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 6-0 흡수성 봉합사로 무릎 관절낭을 봉합하고, 6-0 실크 봉합사로 피부를 봉합합니다.수술 후 통증을 최소화하기 위해 meloxicam 10 milligrams per kilogram을 피하 주사하고, 마취가 풀린 후 마우스를 케이지로 돌려보냅니다. 수술 수주 후, 마우스를 희생시키고 10번 메스 날을 사용하여 양쪽 뒷다리를 제거합니다. 그 다음 뒷다리에서 피부와 근육을 조심스럽게 박리하고, 샘플을 4% Paraform aldehyde에 넣어 상온에서 3일 동안 고정합니다.3일 후, 파라포름알데히드를 제거하고 증류수로 3분 동안 샘플을 세척합니다. 그 후, 4°C의 EDTA에서 2주 동안 샘플을 탈칼슘화합니다. 2주가 지나면, 에탄올 구배를 이용하여 샘플을 탈수시킵니다.마지막 에탄올을 제거한 후, 샘플을 세 개의 Lene bath에 각각 1시간씩 담급니다. 다음으로, 샘플을 파라핀 몰드에 매립합니다. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5 µm 두께로 절편을 만들고, 이를 유리 슬라이드 위에 수집합니다.외측 과(lateral condyle) 중심에서 내측 과(medial condyle) 중심까지 연속 시상 절편을 계속 제작하여 사프라닌 O(saffron and o) 염색을 수행합니다. 먼저 슬라이드를 자일렌(Celine)에 3~5분 동안 담가 탈파라핀화합니다. 자일렌 조(bath) 과정을 두 번 반복합니다.그런 다음 증류수로 끝나는 에탄올 구배를 통해 슬라이드를 친수화합니다. 이어서 슬라이드를 Weigert's iron hematin 용액, 0.05% fast green 용액, 1% acetic acid 용액, 그리고 0.1% saffron 및 O 용액에 순차적으로 담급니다. 이제 수지성 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅하고, 연골 내 적색 프로테오글리칸 색상의 소실 정도와 연골 구조의 파괴 백분율을 기준으로 saffron 및 O 염색 슬라이드를 점수화합니다.그 다음 O-A-R-S-I 조직학적 점수 산정 시스템을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 이 이미지들은 가짜 수술 또는 DMM 수술 8주 후, 야생형 및 PG rrn knockout 마우스의 사프라닌-O 염색된 무릎 관절을 보여줍니다. 가짜 수술 후에는 두 유전자형 모두에서 연골의 뚜렷한 퇴행이 나타나지 않습니다.하지만 DMM 수술 8주 후, 야생형 및 PGRN 녹아웃 마우스 모두에서 연골의 붉은색 소실로 나타나는 프로테오글리칸의 손실과 붉은색 화살표로 표시된 연골 구조의 파괴가 관찰되었으며, 이는 골관절염 표현형이 성공적으로 유도되었음을 나타냅니다. DMM 수술 후 야생형과 PGRN 녹아웃 마우스 간의 골관절염 점수를 비교한 결과, 녹아웃 마우스에서 유의하게 더 높은 점수가 나타났으며, 이는 PGRN의 손실이 더 심각한 골관절염 표현형을 초래했음을 입증합니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우 10분에서 15분 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 대량의 DMM 조작 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

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정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델

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단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

배우세요 마우스에서 DMM 수술 모델을 구축하여 골관절염 연구를 수행하는 방법을. 프로그라눌린 결핍이 관절염 진행을 가중시키는 보호 역할을 확인하고 조직병리학적 분석으로 관절 손상을 평가합니다.

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