로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개

이 실험 절차의 전반적인 목적은 외상성 뇌손상 모델로서 신전 손상(stretch injury)의 활용 방법을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유연한 바닥면의 웰(flexible bottoms wells)에서 미세혈관 내피세포를 배양합니다. 두 번째 단계는 배양액 내의 송아지 태아 혈청(fetal calf serum) 농도를 낮추어 세포를 분화시키는 것입니다.

다음으로, 셀 스트레처(cell stretcher) 장치를 사용하여 세포에 손상을 줍니다. 마지막 단계는 세포의 손상 정도를 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 뇌 혈관 내피 세포에서 신전으로 유도된 손상은 인비트로(in vitro) 환경에서 혈뇌장벽의 손상을 보여주는 데 사용됩니다.

이 기술의 영향은 외상성 뇌 손상(TBI) 치료로까지 확장되는데, 이는 해양 뇌 내피 세포의 신전 손상을 이용하여 혈액-뇌 장벽에서 TBI 동안 발생하는 실제 충격을 모델링하기 때문입니다. 실험 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Elaine Salvador 박사가 시연하겠습니다. T 75 배양 플라스크에서 해양 뇌 미세혈관 내피 세포를 배양하며 이 절차를 시작하십시오.

세포가 합류(confluence) 상태에 도달할 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 그다음, PBS로 세포를 세척합니다. 이후 PBS와 tryps를 제거합니다.

2 mL의 따뜻한 trypsin EDTA 용액으로 세포를 처리합니다. 37 °C에서 5분 동안 또는 세포층이 분산될 때까지 세포를 배양합니다. 그 후, 세포에 8 mL의 배양액을 첨가하고 플라스크를 여러 번 쳐서 세포를 분리합니다.

현미경으로 세포를 관찰하여 플라스크에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오. 그 후, 분리된 세포가 포함된 배지를 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 이후 플라스크를 돌려 세포 현탁액을 혼합하십시오.

세포 현탁액 20 µL를 혈구계(hemo cytometer)에 넣고 세포 수를 측정합니다. 세포 밀도를 결정하여 웰당 20,000 cells/cm²가 되도록 합니다. 그 다음, 세포 현탁액을 콜라겐으로 옮깁니다.

사전 코팅된 6-웰 유연 바닥 배양 플레이트에 웰당 총 3 mL의 부피로 분주합니다. 배양액을 일주일에 두 번 교체하고, 세포가 단층을 형성할 때까지 37 °C에서 일주일 동안 배양합니다.

세포 분화를 위해 세포의 배양액을 분화 배지로 교체하고, 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 이 과정에서 세포 손상 제어 장치를 켜고, 지연 시간을 50 milliseconds로 설정합니다. 그다음, 조절기 압력을 15 PSI로 설정하고 기록된 최대 압력이 안정될 때까지 트리거를 몇 번 누릅니다.

그 다음 조절기 압력을 원하는 값으로 설정하십시오. 이후, 6웰 유연한 바닥 배양 플레이트를 트레이 홀더에 넣으십시오. 웰 선택기가 올바른 웰 크기로 설정되었는지 확인하십시오.

그런 다음 어댑터 플러그를 단단히 끼우고, 한 손으로 플러그를 고정한 채 다른 손으로 트리거를 눌러 이후 발생하는 최대 압력을 기록합니다. 플레이트를 즉시 37 °C 인큐베이터에 넣고 원하는 시간 동안 배양하거나, DI uptake assay를 통해 신장 손상을 평가하기 위한 후속 실험 또는 분석에 즉시 사용합니다. 세포를 신장시킨 직후, 세포 독성 마커로 작용하는 생존능 염색 시약 1 mg/mL 용액 30 µL를 세포 배양 배지에 첨가합니다.

젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase) 방출을 통해 신장 손상을 평가합니다. 신장 후, 즉시 세포 배양 배지 200 µL를 웰에서 제거하며, LDH 방출 조사에 포함하고자 하는 손상 후 모든 시점에서도 동일하게 수행합니다. 그다음, 마이크로 원심분리기의 최고 설정으로 세포 배양 배지를 5분 동안 원심분리합니다.

세포 잔해물을 제거하기 위해 상층액을 분리하여 이후 단계에 사용하십시오. 다양한 시점별로 필요한 샘플 채취가 완료되면, LDH assay kit에 포함된 용해액(lysis solution)을 사용하여 세포를 용해하십시오. 그 후, 키트에 제공된 96 well plate의 모든 웰에 키트에 포함된 assay medium 100 µL를 첨가하십시오.

그 다음, 96-웰 플레이트의 두 병렬 웰에 세포가 없는 세포 배양 배지 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양한 후, 492 nm에서 흡광도를 측정합니다. 여기에는 정상 세포와 손상된 세포의 광학 현미경 검사 결과가 나와 있습니다.

정상적인 신장되지 않은 합류 세포 단층은 촘촘하게 밀집되어 있으며, 1.8에서 2.0 PSI의 최대 압력 펄스를 가하여 세포를 신장시키면 덜 조밀하게 보입니다. 2.5에서 3.0의 최대 압력 펄스로 세포에 중등도의 손상을 주면, 일부 세포가 부어오르고 변형된 모습이 나타납니다. 3.5에서 4.5 PSI의 심한 신장이 가해지면 세포는 수축됩니다.

정상 세포와 손상된 세포의 형광 현미경 검사 결과입니다. 세포들은 손상 2시간 후에 생존능 염색을 처리하였습니다. 여기 보이는 것들은 대조군인 비신장 세포, 중등도 신장 세포, 그리고 심하게 신장된 세포들입니다.

이 그림은 신전 손상 후 상층액으로 방출된 LDH 효소의 양을 보여줍니다. 배양액으로 방출된 LDH는 신전 유도 손상 후 다양한 시간 간격으로 측정되었으며, 저강도 및 중강도 신전이 가해진 세포에서 방출될 수 있는 총 LDH 양의 백분율로 표시되었습니다. 이는 신전되지 않은 대조군 및 상호 간에 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.

심하게 신전된 세포는 발생 1시간 후의 중등도 신전 샘플을 제외한 다른 모든 샘플과 비교했을 때 유의미하게 더 많은 양의 LDH를 방출했습니다. 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 시험관 내 해양 뇌 내피세포에서 외상성 뇌 손상을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.