Name: 로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개 체외 외상성 뇌 손상 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 뇌 미세혈관 내피 세포에서 스트레치 손상을 이용한 외상성 뇌 손상 체외 모델링 방법을. 이 기술은 혈뇌장벽 손상 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 보조금 협정 제 건강-F2-2009-241778에에서 부여 번호 FO 315/4- 아래 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG, 독일 연구 재단)과 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 지원되었다 CF.

1. 잘 접시에 내피 세포의 파종 <ol><li> 합류에 도달 할 때까지 두 번 배지 (DMEM이 10 % FCS, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민 포함) 주 변화, T75 문화 플라스크에 생쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)을 육성. (. 포스터 등 2005 년 21,19. 뇌 미세 혈관 내피 세포의 생성 및 불멸화를 들어, Burek 외, 2012 참조). </li><li> 인산 세포를 씻으 식염수 (PBS)가 버퍼. PBS를 제거하고 2 ㎖ 따뜻한 트립신-EDTA 용액으로 세포를 trypsinize. </li><li> 세포 층이 분산 될 때까지 5 분 또는 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포에 8 ML 문화 매체를 추가합니다. 세포를 분리 플라스크를 여러 번 누릅니다. </li><li> 플라스크의 완전한 분리를 보장하기 위해 현미경으로 세포를 볼 수 있습니다. </li><li> 분리 된 세포를 위아래로 피펫 매체. 세포 suspensi을 혼합하는 소용돌이 플라스크합니다. </li><li> , 세포 현탁액의 20 μl를 타고 혈구에 넣고 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 세포 밀도와 씨앗 20,000 세포 /도에 cm 2를 확인합니다. </li><li> collagen1에 세포 현탁액을 전송 3 ML / 잘 총량의 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 각각의 잘은 9.62 cm 2의 면적을 가지고 있습니다. </li><li> 합류 할 때까지 일주일 동안 37 ° C에서 세포를 성장. 일주일에 두 번 배양액을 변경합니다. </li></ol> 2. 이전 스트레치에 의한 부상 세포 분화 <ol><li> 분화 배지 (DMEM는 혈청 벗겨 송아지 태아 혈청 (ssFCS) 1 %, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는)와 세포의 배양액을 변경합니다. </li><li> 24 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 3. 내피 세포의 스트레치에 의한 손상 <ol><li> 세포 손상 컨트롤러 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 50 밀리 초까지의 지연 시간을 설정합니다. </li><li> 레귤레이터 압력 15 PSI로 설정하고 등록 된 피크 압력이 안정 될 때까지 트리거 몇 번을 누릅니다. </li><li> 원하는 값으로 조절기 압력을 설정합니다. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기위한 가이드로 표 1을 사용합니다. </li><li> 트레이 홀더에 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)를 놓습니다. 잘 선택이 올바른뿐만 크기 (즉, 큰 우물)로 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 확실히 잘 통해 어댑터 플러그를 놓습니다. 다른 한편으로는 트리거를 밀어 한 손으로 제자리에 플러그를 잡으십시오. </li><li> 생성 된 피크 압력을 기록한다. </li><li> 바로 시간의 원하는 기간 동안 37 ° C 배양기에 다시 접시를 넣어 또는 실험이나 평가를 성공을 즉시 사용합니다. </li></ol> 4. 염료 흡수 분석에 의해 스트레치 손상의 평가 <ol><li> 세포는 STR이었다 직후에칭 (단계 3.7), 생존 얼룩의 1 MG / ML 솔루션의 30 μl를 추가하는 세포 배양 배지 (참고 독성 마커 (재료 및 장비의 보충 표 참조) 역할 : 염료 용액 10 μL ) 세포 배양 배지의 모든 ML을 위해 사용됩니다. </li><li> 세포에 염료를 첨가되면, 즉시 형광 현미경으로 볼 수 있습니다. </li></ol> 5. 젖산 탈수소 효소에 의해 스트레치 상해의 평가 (LDH) 출시 <ol><li> 즉시 세포 (단계 3.7) 스트레칭 후, 우물에서 세포 배양액 200 μl를 제거합니다. 당신은 LDH 방출의 수사에 포함 할 때마다 포인트 이후 부상에 대해 동일한 작업을 수행 (즉, 예를 들어, 30 분, 1 시간, 2 시간, 등.) </li><li> 모든 세포 파편을 제거하는 5 분의 microcentrifuge의 가장 높은 설정으로 세포 배양액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 후속 단계에 대해이 작업을 사용합니다. </li><li> 당신 H 회AVE 단계 5.1를 완료하고 당신이, 조사 LDH 분석 키트 (재료 및 장비의 보충 표 참조)에 포함 된 용해 용액을 사용하여 세포를 용해하고 싶은 다양한 시간 지점에서하고 싶습니다 필요한 샘플을 촬영했습니다. </li><li> 키트에 제공된 96 웰 플레이트의 각 잘 분석 키토에 포함 된 측정 배지 100 μl를 넣습니다. </li><li> 분석 키트에 포함 된 96 웰 플레이트의 두 개의 병렬 우물에 세포 무료 세포 배양액 100 μl를 넣습니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 492 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol>

<ol><li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+traumatic+brain+injuries%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li>
<li>Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li>
<li>Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li>
<li>Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li>
<li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alterations+in+%5BCa2%2B%5Di+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia%3A+an+in+vitro+model+for+neural+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li>
<li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li>
<li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture%3A+characterization+of+the+model+using+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal%2C+glial+and+endothelia+cells+%28Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li>
<li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li>
<li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+voltage-dependent+Mg2%2B+blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li>
<li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li>
<li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li>
<li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells%3A+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li>
<li>Förster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li>
<li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li>
<li>Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li>
<li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li>
<li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li>
<li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat%3A+Part+2%3A+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 8, 9, 22 체외에서 기계적 손상의 효과는 연구되어왔다 및 방법이 확립되었다. 여전히 배양 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 알려진 최신하지 않도록, 그러나,있다. 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델에 중요한 이점을 제공합니다. 따라서 배양 된 내피 뇌 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델에서 그러한 우리의 프로토콜 선물이 유용하다는 것을 증명 할 수있는 것과 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 모델 역할을합니다. 이 프로토콜은 CEnd를 세포의 사용, 우리의 실험실에서 설립 BBB 모델을 만든다. BBB 고장이 자주 TBI 환자에 문서화하고 TBI는 종종 부종 형성 23, 24 발생할 수 있습니다 BBB의 중단에 연결되어 있기 때문에,이 메소드는 PRES여기 성향의 구체적 TBI에 관하여 BBB 연구를 수행에 사용할 수 있습니다. 이 모델에서, 그것은 스트레치 부상의 정도가 세포에 적용되는 방법을 많이 돌봐 것이 중요합니다. 세포가 어떤 경우에, 그리고 적용되는 압력의 어떤 금액으로 부상하는만큼의 내피 세포에 영향을 미칠 수있는 손상의 정도가 다른 세포 유형에서 크게 많이 다릅니다. 대동맥 내피 세포는 성상 세포 또는 혼합 glial 세포 9보다 부상을 스트레칭하는 것이 더 저항. 다른 세포 유형에 비해 또한, 그들은 부상 후보다 신속하게 복구 할 수 있습니다. 따라서 뇌 혈관 내피 세포, 특히 CEnd를 세포 스트레칭 손상의 큰 금액에 대한 부상의 높은 수준을 생산하기 위해 필요합니다. 하나는 표 1의 해당하는 압력을 적용하여 부상의 원하는 수준을 달성 할 수 있습니다. CEnd를 셀, 그러나 심각한 부상은 긴장하는 그들의 저항에 따른 선호합니다. 실시 LDH 분석 실험 하였다스트레치 증가의 정도를 더 LDH는 상층으로 분비되어 있는지 확인합니다. 대조적으로, 스트레치 부상의 낮은 양을 주어진 세포는 세포를 제어 유사한 양 LDH를 생산. 프로토콜에서 언급했듯이, 하나는 매체의 적절한 양 매체의 양을 증가 또는 감소가 우물에 적용되는 피크 압력의 차이가 발생할 수 있으므로 사용되는주의해야합니다. 45 PSI 압력이 가해질 때 빈도 3.8 PSI의 평균을 등록 예를 들어, 유체의 잘 포함 5 ML 4.0 PSI의 평균에서 피크 압력을 등록합니다. 따라서 생성 될 최대 압력이 원하는 양에 해당되도록 잘 컨트롤에 트리거를 여러 번 밀어 좋습니다. 우리의 실험에서 우리는 생존이 세포막의 투과성을 스트레칭의 효과를 결정하는 얼룩 사용됩니다. 우리가 사용하는 유연한 바닥 문화 판의 광학은 우리가 vi를 할 수 있습니다EW 직접 현미경으로 스테인드 세포. 그러나 한 직접 스트레치 부상 후 immunolabelling 연구를 수행하고자 할 때, 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 접시의 크기와 두께는 약간의 현미경보기 플랫폼과 문제를 일으킬 수 있습니다. 둘째, 잘 유연한 막 광학 감상을 취소 장애가있을 수 있습니다. 앞서 언급 한 한계에도 불구하고, 설명 절차는 BBB의 생체 기계 부상의 모델로 사용할 수 있습니다. 외상성 뇌 부상 (TBI) 두 가지, 즉 구성 요소, 허혈 및 외상을 포함한다. 빈혈은 저혈압이나 뇌의 결과로 인한 심각한 혈액 손실이있을 때 경우에 TBI에 따라 뇌에 제한 산소 공급을 붓기 보조 부상으로 발생할 수 있습니다. 그것은 부상 (25)의 순간에 시작된 연속 병적 인 과정을 나타내는 지연, nonmechanical 피해로 간주됩니다. 저산소증의 발생따고 심각한 외상성 뇌 손상은 일반적으로 26이다. 산소 포도당 박탈 (OGD)는 현재 체외에서 모델 허혈에 사용되는 방법입니다. 따라서, 스트레칭 후 세포에 보조 모욕으로 OGD하는 세포를 가하면 국소 빈혈 다음 TBI의 발생을 모방 할 수 있습니다. 따라서 체외 모델에서 우리의 현재를 개선하는 TBI와 최대한 가까이 실제 TBI로는 생체 내에서 발생으로 패턴을, 미래에 우리는 또한 스트레치 부상과 함께 OGD 채용합니다.

외상성 뇌 부상 (TBI) 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 만 10 사람들이 그 주요 건강 및 의료 문제 1하고 TBI에 의해 매년 영향을받습니다. 이로 인해 생체 내 및 TBI의 체외 모델에서 다양한이 확립 및 메커니즘 2,3,4을 연구하기 위해 개발. TBI의 더 나은 이해는 환자 치료를 개선하고 관련 사망률, 이환율과 비용을 감소 할 수있다. 생체 내 및 생체 방법 모두에서 사용 뇌 손상에 대한 많은 모델이 존재합니다. 생체 내 모델 머리 부상의 실제 이벤트를 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 내 상황의 복잡성, 관심의 조직에 접근성으로 인해이 제한됩니다. 입은 부상의 결과로 각각의 세포의 생리적 반응을 이해, 그것은 세포가 고립되는 것이 중요하다 전신 효과에서 어떤개별 응답 5를 억제하거나 변경할 수 있습니다. 이러한 이유 때문에, 외상의 휴대 전화 모델은 세포의 기계적 환경을 정확하게 6 제어 할 수 있기 때문에 동물 모델을 통해 중요한 이점을 제공합니다. 부상 등의 방법에 의한 변경을 결정하기 위해 세포 나 조직에 기계적인 부하의 사용을 고용 생체 시스템에서 개발되었다. 예를 들어, 세포에 기계적 손상의 효과를 연구하기위한 방법은 성상 세포, 신경 glial 세포 및 대동맥 내피 세포 7,8,9 설립되었습니다. 설치류 우리가 우리의 모델에 사용할 것과 동일한 압력 제어 장치를 채용 인간의 성상 세포 반응 (10)의 연구를 위해 설립 된 체외 외상 모델. 같은 방법은 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포 (bEnd3) 11 대뇌 피질의 뉴런으로 12,13뿐만 아니라, 대뇌 endoth에 스트레칭을 통해 부상을 유도하기 위해 적용신생 자돈 14 일부터 elial 세포. 장치하여 기계 스트레치 부상 10를 생산 아니라 문화의 바닥을 변형. 그것은 세포 위의 공기 압력의 응용 프로그램에 의해 배양 세포에 손상을 입 힙니다. 이 압력은 그로 인하여 세포를 스트레칭, 세포가 성장하는에 막 편향 수 있습니다. 스트레칭의 여러도 ( &quot;즉,&quot;낮은 &quot;보통&quot;또는 &quot;중증)을 따라 공기 압력 펄스 지속 시간과 강도를 설정하여 달성 할 수있다. 스트레치에 의한 손상이 방법은 생체 내 7에 외상과 연관되어 있습니다. 또한 부상이 방법은 세포 환경의 정확한 제어가 가능하고 쉽게 재현 할 수 있습니다. 비슷한 방법이 bEnd3 포함하여 많은 다른 뇌 세포 유형에 사용되었지만, 우리의 모델은 쥐 뇌 미세 혈관 내피 세포의 사용 (CEnd를)이 발생하게된다는 점에서 장점입니다우리 연구실합니다. 이 셀 라인은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 잘 적합 모델입니다. BBB 모델로 사용되는 체외 세포 배양에서 그들을 투과성 화면 역할을 할 수있는 것이 특징을 가지고해야합니다. BBB 투과성 예측 될 체외 세포 모델에서 하나의 중요한 기준은 생리적으로 실제 세포 구조에 15을 소유해야한다는 것입니다. bEnd3 세포가 표시에도 불구하고 특유의 스핀들과 같은 그들은 오히려 섬유소 젤 17 일반 관 구조보다 낭종과 같은 구멍을 형성 그것에 문화 16 편평 형태, 그들은 체외에서 불규칙한 형태 형성의 동작을 나타냅니다. 또한, 세포가 배아 및 신생아 생쥐에 주입했을 때, 그들은 있지만 신생아와 젊은 생쥐의 배아 생쥐에 치명적인 빠르게 성장하는 종양을 유도. 그것은 따라서 정상적인 내피 성장, 이동, 분화를 지배하는 하나 이상의 프로세스가 변경되거나 eliminat되었다는 것을 권장합니다이 셀 라인 18 ED. 반면에, 내피와 BBB 마커의 발현, 생체 및 paracellular 플럭스 측정의 형태 학적, 면역 세포 평가는 우리의 BBB 모델 CEnd를 실제로 BBB 19 적합한 모델이라고 보여줍니다. 생체 뇌 내피 세포는 횡단 내피 전기 저항 (티이)가 Ωcm 2 2,000-5,000 이르기까지와 매우 긴밀한 투과성이 특징입니다. 의약품에 대한 뇌 미세 혈관 장벽 특성 연구를 위해, 세포의 paracellular 제한성 및 견고이 고려되어야한다. 대부분의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (BCEC)에서이 세포 전시 봉사자는 50 ~ 100 Ωcm 2에서 20까지로 유지되지 않습니다. 불후의 뇌 내피 세포 라인 bEnd3가없는 큰 15 2 Ωcm 60 이상의 봉사자 값을 생성합니다. 포함하는 배지로 CEnd를 세포의 대비 차별화 혈청 디스플레이를 감소300-500 Ωcm 2 19,21 이르기까지 티이 값. 지금까지 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 스트레칭 부상의 체외 모델에서 부족합니다. 따라서, BBB의 모델로 역할을 배양 뇌 혈관 내피 세포를 사용하여 스트레치 부상을 통해 외상 체외 모델이 유용하다는 것을 증명하기 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 뇌 세포 BBB 구체적으로 뇌 미세 혈관 내피 세포, TBI 동안받는 실제적인 영향을 모방 할 수있는 체외 모델을 제시한다. 이 모델의 가장 큰 장점은 부상의 양이 세포뿐만 아니라 세포 환경이 쉽게 실험 셋업을 쉽게 재현성을 가능하게하는 정확한 방식으로 제어 할 수 있습니다에 적용되는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Cell Injury Controller II</td><td>맞춤형 설계 및 제작, 미국</td><td></td> 버지니아<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioflex 배양 플레이트 - 콜라겐 타입 I</td><td>플렉스셀, 던 Labortechnik</td><td>BF - 3001C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>최종 농도 10%, 열 비활성화(56°C에서 30분; C)</td></tr> <tr><td>L-글루타민</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>저장: &le; -15 > C</td></tr><tr><td>MEM 비타민</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>저장: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Na-피루브산</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>4°C 저장; C</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>저장: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청, 숯 벗겨짐 (ssFCS)</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>저장: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>저장: &le; -15 &deg; C, 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>세포 독성 검출 키트 PLUS (LDH)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td>저장: &le; -15 &deg; 씨</td></tr></tbody></table>

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (cend를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

외상성 뇌 손상 (TBI), 하나 더 그것에 관련된 기본 메커니즘을 이해 할 수있는 메소드가 낳은 높은 사망 사고로 인해 치료에 유용합니다. 생체 내에서 이러한 목적에 사용할 체외 방법에서 모두있다. 그것이 TBI 중에 발생으로 생체 내 모델은 실제 머리 부상을 모방 할 수 있습니다. 그러나 생체 기술에 세포 생리학 수준에서 연구에 악용 될 수 없습니다. 그들이 조작 세포와 세포 외 환경에 쉽게 액세스 할 수 있기 때문에, 따라서 체외 방법이 목적을 위해 더 유리하다. 우리의 프로토콜은 뇌 미세 혈관 내피 세포의 TBI 사용하여 스트레치 부상의 체외 모델을 제공합니다. 유연 바닥 우물에서 배양 세포에 적용되는 압력을 사용합니다. 압력은 쉽게 제어 할 수 있습니다 적용과 낮은에서 심한 범위하는 부상을 생성 할 수 있습니다. 쥐우리의 실험실에서 생성 된 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)는 이렇게 유사한 기술을 채택 다른 시스템에 이점을 제공하는 혈액 뇌 장벽 (BBB)​​에 대한 잘 적합 모델입니다. 또한, 방법의 단순성으로 인해, 실험 셋업을 쉽게 복제됩니다. 따라서,이 모델은 BBB에서 TBI에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 연구에 사용할 수 있습니다.

콜라겐에 배양 세포 나 세포 들것 장치를 사용하여 스트레치 부상의 다양한 학위를 받게 된 6 자 유연한 바닥 배양 플레이트 (63,525 cm 2)로 코팅. 부상 세포를 복종 후에는 세포 형태에 스트레치에 의한 부상의 효과를 현미경으로 관찰 하였다. 그것은 스트레칭으로 큰 정도가 세포 왜곡의 큰 정도도 관찰 할 수있는 세포 (그림 1)에 적용되었는지 관찰되었다. 그림 1A와 같이 부상에 노출되지 않은 컨트롤 세포는 세포의 팽창이나 왜곡의 표시없이 정기적으로 모양의 뇌 혈관 내피 세포 (CEnd를)를 나타납니다. 스트레치 부상이 적용되었을 때 (그림은 1B-D), 변형 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 3.5-4.5 PSI 사이의 최대 압력을 심각하게 세포를 스트레칭 후 CEnd를 세포는 크게, 수축 팽창이 아닌로 변형 등장<html> 수 간 공간. 또한, 얼룩 생존 (100 nm의 최종 농도)의 섭취는 스트레치 부상의 정도 (그림 2) 증가로 증가했다. 가능성은 사용 염색은 세포의 세포막의 무결성이 손상 될 때 투과되고 건강한 세포에 염색 impermeant입니다. 염료 뻗어 세포 (그림 2B-D)에 비해 따라서, 세포의 단지 몇 (그림 2A) 염색 하였다, 제어 세포의 대부분에서 제외되었다. 많은 셀 스트레치 부상의 증가도 녹색 fluoresced. 젖산 탈수소 효소의 부상 릴리스 (LDH)의 생화학 적 마커로 효소는 제조업체의 지침에 따라 조사 하였다. 그림 증가 세포 스트레칭 부상 증가 LDH 방출을 야기하는 3 보여줍니다. &quot;928/50928fig1.jpg&quot;폭 = &quot;500px /&gt; 그림 1. 정상 대 손상된 세포의 광학 현미경 검사. (A) 일반 늘어나지 합류 세포 단층이 istightly 포장 길쭉한. 세포들은 적은 소형 표시 1.8-2.0 PSI (즉, 낮은 뻗기)의 피크 압력 펄스를 적용하여 뻗어 때, 공간은 화살표 (B)로 표시. 세포가 적당히 2.5-3.0 피크 압력 펄스로 부상했을 때, 그들 중 일부는 부어 (C) 변형 나타났다. 세포는 화살표 (D)로 표시 3.5-4.5 PSI, 심한 스트레칭으로 철회된다. 100X 배율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 형석정상 대 손상된 세포의 escence 현미경 검사 손상 후 생존 얼룩 2 시간 치료 세포 : 제어 늘어나지 세포 BD : 기지개 세포 (B - 낮은 C - 중간, D - 심한 경우도 있음).... 100X 배율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> 그림 3. 스트레치 부상 후 상층 액에 젖산 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 효소 릴리스. LDH 배양액으로 방출이 스트레치에 의한 손상 후 다양한 시간 간격으로 측정 하였다. LDH는 총 박리 LDH (미디어 플러스 세포의 LDH)의 백분율로 표시 하였다. 값은 ± SEM 있습니다. 마다 포인트 n은 0 시간 V를 제외하고 5입니다alue n은 = 3 심한 스트레칭을 실시. 낮은 중간 스트레칭을 실시 하였다 세포 LDH 방출이 늘어나지 컨트롤의 그것과 서로 유의 한 차이가 없었다. 심각하게 뻗어 된 세포는 1 시간에 적당히 늘어 샘플을 제외한 모든 다른 시료에 비해 LDH의 상당히 큰 금액을 발표했다. (p &lt;0.05, 하나의 요인 ANOVA, 홀름 - Sidak 방식). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 표 1. 스트레치 부상의 다양한 학위를 생성하기 위해 안내합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 레귤레이터 압력 </th><th> 최대 압력 </th><th> 부상의 정도 </th></tr><tr><td> 15 PSI </td><td> 1.2-1.5 PSI </td><td> &lt;저 </td></tr><tr><td> 20-25 PSI </td><td> 1.8-2.0 PSI </td><td> 낮은 </td></tr><tr><td> 30-35 PSI </td><td> 2.5-3.0 PSI </td><td> 중간 </tD&gt; </tr><tr><td> 40-50 PSI </td><td> 3.5-4.5 PSI </td><td> 심한 </td></tr><tr><td> 60 PSI </td><td> 4.8-6.0 PSI </td><td> &gt; 심한 </td></tr></tbody></table>

체외에서 외상성 뇌 손상 모델은 생체 뇌의 변형으로 재현하기 위해 개발되고있다. 스트레치에 의한 손상은 성상 세포, 뉴런, glial 세포, 대동맥, 뇌 혈관 내피 세포에 대한 고용되었습니다. 그러나 우리의 시스템은 체외 TBI 모델을 설정하는 BBB의 합법적 인 모델을 구성하는 속성을 가지고 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​모델을 사용합니다.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 외상성 뇌손상 모델로서 신전 손상(stretch injury)의 활용 방법을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유연한 바닥면의 웰(flexible bottoms wells)에서 미세혈관 내피세포를 배양합니다. 두 번째 단계는 배양액 내의 송아지 태아 혈청(fetal calf serum) 농도를 낮추어 세포를 분화시키는 것입니다.다음으로, 셀 스트레처(cell stretcher) 장치를 사용하여 세포에 손상을 줍니다. 마지막 단계는 세포의 손상 정도를 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 뇌 혈관 내피 세포에서 신전으로 유도된 손상은 인비트로(in vitro) 환경에서 혈뇌장벽의 손상을 보여주는 데 사용됩니다.이 기술의 영향은 외상성 뇌 손상(TBI) 치료로까지 확장되는데, 이는 해양 뇌 내피 세포의 신전 손상을 이용하여 혈액-뇌 장벽에서 TBI 동안 발생하는 실제 충격을 모델링하기 때문입니다. 실험 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Elaine Salvador 박사가 시연하겠습니다. T 75 배양 플라스크에서 해양 뇌 미세혈관 내피 세포를 배양하며 이 절차를 시작하십시오.세포가 합류(confluence) 상태에 도달할 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 그다음, PBS로 세포를 세척합니다. 이후 PBS와 tryps를 제거합니다.2 mL의 따뜻한 trypsin EDTA 용액으로 세포를 처리합니다. 37 °C에서 5분 동안 또는 세포층이 분산될 때까지 세포를 배양합니다. 그 후, 세포에 8 mL의 배양액을 첨가하고 플라스크를 여러 번 쳐서 세포를 분리합니다.현미경으로 세포를 관찰하여 플라스크에서 완전히 분리되었는지 확인하십시오. 그 후, 분리된 세포가 포함된 배지를 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 이후 플라스크를 돌려 세포 현탁액을 혼합하십시오.세포 현탁액 20 µL를 혈구계(hemo cytometer)에 넣고 세포 수를 측정합니다. 세포 밀도를 결정하여 웰당 20,000 cells/cm²가 되도록 합니다. 그 다음, 세포 현탁액을 콜라겐으로 옮깁니다.사전 코팅된 6-웰 유연 바닥 배양 플레이트에 웰당 총 3 mL의 부피로 분주합니다. 배양액을 일주일에 두 번 교체하고, 세포가 단층을 형성할 때까지 37 °C에서 일주일 동안 배양합니다.세포 분화를 위해 세포의 배양액을 분화 배지로 교체하고, 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 이 과정에서 세포 손상 제어 장치를 켜고, 지연 시간을 50 milliseconds로 설정합니다. 그다음, 조절기 압력을 15 PSI로 설정하고 기록된 최대 압력이 안정될 때까지 트리거를 몇 번 누릅니다.그 다음 조절기 압력을 원하는 값으로 설정하십시오. 이후, 6웰 유연한 바닥 배양 플레이트를 트레이 홀더에 넣으십시오. 웰 선택기가 올바른 웰 크기로 설정되었는지 확인하십시오.그런 다음 어댑터 플러그를 단단히 끼우고, 한 손으로 플러그를 고정한 채 다른 손으로 트리거를 눌러 이후 발생하는 최대 압력을 기록합니다. 플레이트를 즉시 37 °C 인큐베이터에 넣고 원하는 시간 동안 배양하거나, DI uptake assay를 통해 신장 손상을 평가하기 위한 후속 실험 또는 분석에 즉시 사용합니다. 세포를 신장시킨 직후, 세포 독성 마커로 작용하는 생존능 염색 시약 1 mg/mL 용액 30 µL를 세포 배양 배지에 첨가합니다.젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase) 방출을 통해 신장 손상을 평가합니다. 신장 후, 즉시 세포 배양 배지 200 µL를 웰에서 제거하며, LDH 방출 조사에 포함하고자 하는 손상 후 모든 시점에서도 동일하게 수행합니다. 그다음, 마이크로 원심분리기의 최고 설정으로 세포 배양 배지를 5분 동안 원심분리합니다.세포 잔해물을 제거하기 위해 상층액을 분리하여 이후 단계에 사용하십시오. 다양한 시점별로 필요한 샘플 채취가 완료되면, LDH assay kit에 포함된 용해액(lysis solution)을 사용하여 세포를 용해하십시오. 그 후, 키트에 제공된 96 well plate의 모든 웰에 키트에 포함된 assay medium 100 µL를 첨가하십시오.그 다음, 96-웰 플레이트의 두 병렬 웰에 세포가 없는 세포 배양 배지 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양한 후, 492 nm에서 흡광도를 측정합니다. 여기에는 정상 세포와 손상된 세포의 광학 현미경 검사 결과가 나와 있습니다.정상적인 신장되지 않은 합류 세포 단층은 촘촘하게 밀집되어 있으며, 1.8에서 2.0 PSI의 최대 압력 펄스를 가하여 세포를 신장시키면 덜 조밀하게 보입니다. 2.5에서 3.0의 최대 압력 펄스로 세포에 중등도의 손상을 주면, 일부 세포가 부어오르고 변형된 모습이 나타납니다. 3.5에서 4.5 PSI의 심한 신장이 가해지면 세포는 수축됩니다.정상 세포와 손상된 세포의 형광 현미경 검사 결과입니다. 세포들은 손상 2시간 후에 생존능 염색을 처리하였습니다. 여기 보이는 것들은 대조군인 비신장 세포, 중등도 신장 세포, 그리고 심하게 신장된 세포들입니다.이 그림은 신전 손상 후 상층액으로 방출된 LDH 효소의 양을 보여줍니다. 배양액으로 방출된 LDH는 신전 유도 손상 후 다양한 시간 간격으로 측정되었으며, 저강도 및 중강도 신전이 가해진 세포에서 방출될 수 있는 총 LDH 양의 백분율로 표시되었습니다. 이는 신전되지 않은 대조군 및 상호 간에 유의미한 차이를 보이지 않았습니다.심하게 신전된 세포는 발생 1시간 후의 중등도 신전 샘플을 제외한 다른 모든 샘플과 비교했을 때 유의미하게 더 많은 양의 LDH를 방출했습니다. 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 시험관 내 해양 뇌 내피세포에서 외상성 뇌 손상을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

이 절차의 전반적인 목표는 비보에 허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 평가 대 한 높은 재현 기법을 제공 하는입니다.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

서로 다른 시점의 마우스에 두 개의 형광 염료를 투여하여 혈액뇌장벽(BBB) 파괴로 인한 염료 유출을 시각화하는 방법이 개발되었습니다. 동결 보호제로서 글리세롤을 사용함으로써 동일한 샘플에 대한 면역조직화학이 촉진되었습니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

배우세요 뇌 미세혈관 내피 세포에서 스트레치 손상을 이용한 외상성 뇌 손상 체외 모델링 방법을. 이 기술은 혈뇌장벽 손상 메커니즘 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개

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