Name: 인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 고처리량 유동세포계측법을 이용한 NMDA-R 및 D2R 항체 검출 방법을 통해 면역매개성 신경질환의 진단을 개선하는 효율적인 세포 기반 분석 기술을 익히세요.

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이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 성 과학 재단 (호주), 뚜렛 증후군 협회 (USA)에 의해 지원되었다, 트리샤 다중 경화증 연구 재단 및 다발성 경화증 연구 호주, 페 트레 재단 (호주), 레베카 L. 장수 의료 연구 재단 (호주). 우리는 모든 환자와 연구에 대한 샘플을 제공하는 가족 구성원을 감사드립니다.

<html> 1. 전략 pIRES2-EGFP 벡터 인코딩 D2R 또는 NMDAR을 구성하는 서브 클로닝 <ol><li> 인간 D2R 또는 NMDAR의 서브 유닛 1 (NR1)의 전체 길이의 cDNA 클론을 구하십시오. </li><li> 등의 동시 발현되는 항원 및 GFP를 모두 가능하게하는 강화 된 녹색 형광 단백질 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)의 통제하에 (GFP) 기자와 횡단 단백질의 발현에 적합한 pIRES2-EGFP와 같은 발현 벡터를 선택 별도 세포. </li><li> pIRES2-EGFP 벡터 내에서 인간의 cDNA를 서브 클론. <ol><li> cDNA를 서브 클로닝 적절한 제한 효소를 사용하려면 (인간 D2R cDNA를 예를 들어 NHEI 및 XhoI에 대한). </li><li> 결찰 컷 cDNA를 제한 pIRES2-EGFP 벡터 내에 삽입합니다. </li><li> 순서는 벡터가 올바른 순서로 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위해 pIRES2-EGFP D2R 또는 NMDAR 벡터를 결찰. </li><li> 정화 및 형질에 나중에 사용하기 위해 pIRES2-EGFP의 D2R 또는 NMDAR 벡터를 증폭. </li></ol></li></ol>itle &quot;&gt; 2. 신경 세포 항원의 발현에 대한 HEK293 세포 형질 <ol><li> 신선한 둘 베코 변형 이글 매체 (1X) (DMEM) 4.5 g / L에 D-글루코오스, L-글루타민 및 110 mg의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 / L 피루브산 나트륨 완전한 가진 조직 배양 플라스크에서 배양 HEK293 세포 2 ㎜ 루타, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신. </li><li> 트립신 및 전송을 원뿔 튜브를 사용하여 HEK293 세포를 분리합니다. <ol><li> 6 분 250 XG에서 세포를 원심 분리하여 세척하고 신선한 완전한 DMEM에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol></li><li> 약 8 × 10 5 세포 / 웰과 문화 하룻밤 2 ML DMEM에서 37 ° C에서 5 % 인큐베이터에서 CO 2의 세포와 씨앗 6 웰 플레이트를 계산합니다. </li><li> 그들은 약 70 %의 포화 상태에 도달 한 후, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + 세포), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + 세포)와 HEK293 세포를 형질 및 pIRES2-EGFP (HEK293 CTL 세포, 벡터 제어)은 다음과 같이.나중에 보상에 대한 몇 가지 형질 감염되지 않은 HEK293 세포를 유지합니다. <ol><li> 2.5 μg DNA, 200 ㎕의 0.9 % 염화나트륨 및 4 ㎍ / ml의 폴리에틸렌 이민 / 웰 (각 2 ㎖ 신선한 완전 DMEM을 포함)를 포함하는 형질 전환 혼합물의 필요한 양을 준비한다. </li><li> 즉시 10 초 동안 혼합하고 와동 적절한 웰에 형질 전환 혼합물의 양을 첨가하기 전에, 10 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다. </li><li> , 플레이트를 커버 파라 필름과 측면을 감싸, 세포 형질 전환을 지원하기 위해 5 분 280 XG에 원심 분리기. </li><li> 파라 필름을 제거한 후 37 ℃에서 문화 인큐베이터에 배치 </li><li> 신선한 완전한 DMEM으로 18 시간 후 배양 배지를 교체하고 또 다른 72 시간 동안 문화를 유지한다. </li><li> 선택적 : 72 시간 후 - 형질 감염, 형질 전환 된 세포는 형질 안정한 클론을 얻기 위해, 250 ㎍ / ml의 제 네티 신으로 보충 된 완전 DMEM에 배양하여 선택 될 수있다. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. 신경 세포의 항원을 표면에 항체의 검출을위한 세포 계측법 세포 기반 분석 흐름 <ol><li> 37 ° C에서 약 5 분 동안 500 μL / 잘 센과 배양 HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + 및 HEK293 CTL 세포를 분리 <ol><li> PBS의 2ml/well에 재현 탁 (-CA 2 + / -의 Mg 2 +) 2 % FBS (PBS / FBS) 및 15 ㎖의 50 ML 원뿔 튜브로 전송 보충. </li><li> 6 분 250 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 15 ~ 50 ㎖의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 배를 반복합니다. </li><li> 세포를 계산 한 후 1 × 10 6 세포 / ml에서 PBS / FBS에 재현 탁. </li></ol></li><li> HEK293 D2R + 또는 HEK293 NMDAR + 세포뿐만 아니라, HEK293 CTL 세포가 각각의 환자 샘플 또는 기본 항체와 함께 배양 할 수있을 것이라는 점을 고려하여, 유동 세포 계측법 획득을위한 96 - 웰 템플릿을 디자인합니다. </li><li> 50,000 세포 / 우리의 V-바닥 96 - 웰 플레이트의 씨앗 세포LL 취득 템플릿 유동 세포 계측법에있어서. </li><li> 5 분 450 XG에 96 - 웰 플레이트를 원심 분리하고 부드럽게 전자 또는 수동 멀티 채널 피펫을 사용하여 상층 액을 제거, 각도에 접시를 기울 세포 펠렛을 대기음되지 않도록주의하여 세포 펠렛. </li><li> HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, 그리고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 HEK293 CTL의 세포를 품어 : <ol><li> 항원 표면 발현을 평가하기 위해 차 항체의 희석으로. </li><li> 항체를 검출하기 위해 환자 샘플. </li></ol></li><li> 예를 들어, 보상 컨트롤 세포 계측법 적절한 흐름을 사용합니다. 형질 감염되지 않은 흠 HEK293 세포, GFP + HEK293 세포 (AF647 -) 및 형질 감염되지 않은 AF647 + HEK293 세포 (GFP). </li><li> 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 170 ㎕의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 단계 두 개 더 번 반복합니다. </li><li> 1 시간 동안 세포를 품어(안티 NR1 또는 항 D2R 차 항체 환자의 혈청과 항 - 마우스 IgG 안티 인간 IgG) AF647 - 복합 이차 항체의 1:100 희석 어둠 속에서 실온에서 연구. </li><li> 단계 3.7에서와 같이 세포를 세 번 씻어 셀 획득 유동 세포 계측법에 35 ㎕의 PBS / FBS에 재현 탁. </li><li> (BDLSRII) 흐름 cytometer에 높은 처리량 샘플러 (HTS)을 설정합니다. </li><li> 인수 템플릿 유동 세포 계측법에 따라 10,000 / 잘 취득. </li><li> 수출 다음과 같은 FlowJo의 V7.5와 같은 소프트웨어 패키지 유동 세포 계측법을 사용하여 분석을 위해 데이터를 분석 : <ol><li> 첫째, 앞으로 (크기) 및 측면 (단위)에 따라 게이트 라이브 HEK293 세포를 없앤다. </li><li> 만 형질 전환 세포를 분석 할 수있는 높은 GFP - 양성에 따라 더 게이트 라이브 HEK293 세포. </li><li> 라이브 GFP 양성 세포 내에 AF647 채널의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다. </li><li> 분석을 위해 Excel 또는 프리즘에 데이터 내보내기 : <ol><li> 플롯 CMFI 대 차 항체 (항-NMDAR 또는 항-D2R 항체)의 oncentrations는이 항체와 함께 배양 세포에서 얻은. </li><li> 각 환자 및 컨트롤 샘플은 각각 HEK293 D2R + 또는 HEK293 NMDAR + 세포의 MFI에서 CTL HEK293 세포의 MFI를 감산함으로써 ΔMFI를 결정한다. </li><li> 제어 일대의 평균 ΔMFI 위의 세 가지 표준 편차를 추가하여 항체 양성의 임계 값을 계산합니다. </li><li> 플롯 개별 샘플은 그래프에서 혈청 형에 따라 그룹화하고 라인으로서 임계 값을 나타낸다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
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<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li>
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<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
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<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
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<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

관심의 충돌 : 특허는자가 항체에 대한 대상으로 D2R을 주장 FB와 RCD (시드니 대학)에 의해 제기되었다.

본 논문은 높은 처리량 샘플러를 사용하여 특정 세포 표면의 연결 단백질을 표적으로하는 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 유동 세포 계측법의 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 CNS 질환으로 영향을 환자의 서브 그룹 NMDAR으로 표면 또는 표면 D2R하는 혈청 항체를 가지고 있음을보고한다. 살아있는 세포 기반 분석법 계측법이 높은 처리량의 흐름을 이용하여 최적의 항체 검출을위한 필수 단계는 건강한 형질 감염된 세포의 높은 수율을 얻는) 1 마련되어, 또한 항원이) 검증 높은 세포 표면 발현, 3) 항체의 임계치를 설정하는 양성 컨트롤의 코호트를 사용하여, 4)와 데이터의 재현성을 확인하기. 건강한 세포의 배양이 기술의 성공에 필수적입니다. HEK293 세포 배양, 높은 형질 효율성 및 신경원의 표현의 부족의 용이성을 위해 잘 알려진단백질, 이는 그들이 일반적으로 특정 신경 세포의 항...

최근 몇 년 동안, 중추 신경계 (CNS) 질병의 면역 형태가 확인되었다. 이들 질환과 연관된자가 항체의 존재에 의해 정의되는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 신경 세포의 수용체 나 신경 전달의 1,2에 관련된 시냅스 단백질에 결합한다. 다른 항원은 N-메틸-D-아스파 테이트 수용체 (NMDAR) 3-5, γ-아미노 낙산의 B 수용체 (GABA의 B) 수용체 6, α-아미노 -3 - 히드 록시 -5 - 메틸 -4 -로서, 탐지 된 isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 7, 전압 - 문이 칼륨 채널 (VGKC) 관련 단백질 : 류신이 풍부한 신경 교종 활성 단백질 1 (LGL-1) contactin 관련 단백질 2 (capsr2) 8,9, 글루타민산 염 수용체 5,10 , 그리고 도파민 2 수용체 (D2R) 11. 과거에는 (주로 뇌염이라는) 이러한자가 면역 CNS 장애는 종종 진단되지 및 치료했다. 이 소설 항체 바이오 마커, 예를 들어,NMDAR의 항체 또는 D2R 항체는 실질적으로 진단과 인식을 개선하고, 환자에 대한 치료 옵션을 열었습니다. 사실, 면역 요법과 조기 치료가 개선 된 결과 (11, 12)와 연결되어 있습니다. 이러한 효소 결합 면역 분석 (ELISA)과 웨스턴 블롯으로 항체를 검출하는 전통적인 방법은 혈청에있는 항체의 검출에 사용되었다. 그러나, 그들은 쉽게 세포 또는 표면 항원의 인식을 사용하지 않고, 오히려 세포 내 항원으로 면역 반응을 보여줄 수 있습니다. 또한, 신경 전달에 관련된 중요한 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 항체는 병원성 2,3,7,13,14 될 가능성이있다. 따라서, 관련 세포 표면 또는 환자의 세포 항체 표적을 발견 할 수있는 정확하고 민감한 분석의 개발이 가장 중요하다. 필드 금 표준 방법은 소위 &quot;휴대 BA에서, 생균의 사용에 기초SED 분석 &quot;. 이 방법은 또한 포유 동물 세포의 항원의 완전한 cDNA의 서열을 함유하는 벡터의 형질 감염에 의해 네이티브 형태 (대부분 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포)의 표면 항원의 발현을 포함한다. 라이브 nonpermeabilized 세포는 다음 희석 된 환자의 혈청 배양 및 형광 색소 - 복합 항 - 인간 면역 글로불린 (ig으로) 이차 항체에 의해 따른다. 형광의 강도 또는 레벨은 검출되고 결합자가 항체의 수준으로 연관된다. 하나의 항원이 세포에서 과다 발현으로이 기술은 고유합니다. 가장 널리 &quot;판독&quot;을 사용은 면역 세포 화학 4,5,8-10 후 공 초점 현미경 분석하고있다. 그러나, 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 성공적으로 탈수 초성 질환 15 ~ 17 환자에서 항체를 감지하는 데 사용되었다. 특히, 워터스 외. 15은 팬을 사용하여 항체의 검출을 비교셀 기반 현미경으로 다음 분석이나 흐름 등의 항체 검출 기술의 엘 세포 계측법 분석하고, 가장 민감한 정확하고 신뢰할 수있는 방법으로 세포 기반 분석 유동 세포 계측법 보여 주었다. 그것은 조사 의존 정량없고, 방사성 물질의 사용을 포함하지 않는 때문에, 세포 기반 분석법 유세포 유리하다. 이 큰 환자의 코호트는 단시간으로 측정 할 수로서 또한 편리하다. 더 최근에, 우리는 면역 CNS 질환 환자 11 NMDAR 항체 및 D2R 항체를 검출하는 세포 기반 분석 계측법 높은 처리량의 흐름을 최적화했다. 우리 그룹은 최근 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 환자의 혈청에서 NMDAR 항체를 발견했습니다. 이러한 NMDAR 항체 - 양성 혈청 기계 공 촛점 현미경을 사용하여 분석하고, 또한 11 개의 긍정적 인 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 C의 탐지를위한 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 설명자동 높은 처리량 샘플러를 이용하여 환자의 혈청에서 onformation 민감한 CNS 항체.

<table><tbody><tr><td>pIRES2-EGFP 벡터</td><td>클론텍</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>인간 HA-도파민-2 수용체(D2R) cDNA</td><td>미주리 S& T cDNA 리소스 센터</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>NMDAR (NR1) cDNA</td><td></td><td></td>의 인간 서브유닛 1 <td>A. Vincent 교수의 선물&nbsp; (영국 옥스포드)</td></tr><tr><td>단클론 정제 마우스 항 인간 NR1 항체 (클론 : 54.1)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>마우스 정제 단일 클론 항 DRD2 IgG (클론 : 1B11)</td><td>시그마 알드리치</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 647 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L)</td><td>인비트</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 647 염소 안티 인간 IgG (H + L)</td><td>인vitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine 및 110 mg/L sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Foetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 염화나트륨</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR 정제 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick 젤 추출 스핀 키트</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>플라스미드&nbsp; 플러스&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장비/소프트웨어 이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>모델/버전</td></tr><tr><td>고처리량 샘플러 시스템이 있는 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII with HTS</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (수은 램프 및 U-RFLT50 전원 공급 장치 포함)</td></tr><tr><td>전동 멀티채널 피펫(15-300 &mu; l)</td><td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12채널 Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96-well 플레이트</td><td>코닝</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

인간 혈청에있는 n-메틸-d-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

최근 몇 년 동안, 표면 및 신경 전달에 관여 구조적 단백질에 대한 항체는 어린이와 성인자가 면역 CNS 질환에서 검출되었다. 이 항체는 진단과 치료를 안내하는 데 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 환자의 혈청에서 항체의 검출을 개선했습니다. 그들은 다음 형광 색소 - 복합 이차 항체 다음에 희석 한 환자의 혈청으로 배양하는 진핵 세포에서 뇌 항원의 표면 발현을 기반으로합니다. 세탁 후, 바인딩 차 항체는 다음 유동 세포 계측법에 의해 분석된다. 우리 그룹은 안정적으로 특정 신경 전달 물질 수용체에 대한 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 세포 계측법 높은 처리량의 흐름을 개발했다. 이 유동 세포 계측법 방법 곧장 앞으로, 양적, 효율적이며, 많은 환자 코호트 쉽게 짧은 시간으로 측정 될 수 있도록 높은 처리량 샘플러 시스템의 사용을 허용한다. 또한,이 같은 셀 기반말할 간단 중추​​ 신경계 및 말초 신경계 모두에서 많은 다른 항원 표적으로하는 항체를 검출하도록 구성 될 수있다. 추가로 새로운 항체 바이오 마커를 발견하는 것은 신속하고 정확한 진단을 가능하게하고 면역 매개 질환의 치료를 향상시킬 것입니다.

라이브 HEK293 D2R + CTL 및 HEK293 세포는 높은 처리량 샘플러를 사용하여 유동 세포 계측기로 획득 하였다. 분석하는 동안, 세포는 앞으로 분산 형 (크기)와 사이드 분산 형 (단위) 매개 변수 (그림 1A와 1D)를 기반으로 문이되었다. 형질 감염된 HEK293 세포는 세포질에서 리포터 분자, GFP를 발현하고, 형질 감염되지 않은 세포를 분석 (도 1B 및 1E)에서 제외 하였다. GFP + 게이트 내에서 AF647-복합 항 - 인간 IgG 이차 항체 결합과 관련된 MFI는 (그림 1C 및 1 층)을 측정 하였다. 인간 혈청을 분석 할 때 배경 형광을 해소하기 위해, ΔMFI는 HEK293 D2R + 세포의 MFI (도 1G)까지 HEK293 CTL 세포의</s...

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

다음 실험의 전반적인 목적은 고처리량 유세포 분석 세포 기반 분석법을 사용하여 환자 샘플에서 신경 뉴런성 anti D two R 또는 N-M-D-A-R 항체를 검출하는 것입니다. 이는 인간 D two R 또는 N-M-D-A-R의 전체 cDNA 서열을 플라스미드 내에 서브클로닝함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 인간 세포주를 형질전환시키면 세포 표면에 신경 항원이 발현됩니다.다음으로, 형질전환된 세포를 환자 혈청 및 적절한 2차 항체와 함께 배양한 후 유세포 분석기로 데이터를 수집합니다. 세포 표면 항원에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 유세포 분석을 기반으로 결과를 얻습니다. 본 연구의 고처리량 3-포트 유세포 분석 세포 기반 분석법은 대규모 환자 표본군에 대해 신속하고 정량적이며 효율적입니다.이는 면역화학 및 공초점 분석을 이용한 세포 기반 분석법보다 상당한 이점이 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 유세포 분석기에서 적절한 수의 세포를 확보하기 위해 실험 과정 중 발생하는 세포 손실로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 세척 단계 사이에 세포가 흡입되어 제거되지 않도록 주의하십시오.막단백질 발현에 적합하며 항원과 녹색 형광 단백질을 세포 내에서 개별적으로 공동 발현할 수 있는 발현 벡터를 선택하십시오. 예를 들어, 이 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site)의 제어를 받는 강화된 GFP 리포터를 가지고 있습니다. 적절한 제한 효소를 사용하여 인간 CD NA 전체 길이를 벡터에 서브클로닝하십시오. 시퀀싱을 통해 클론을 확인한 후, transfection 배양에 적합한 플라스미드 스톡을 제작하십시오. 10% 태아 송아지 혈청이 포함된 완전 DMEM 배지에서 HEK 2 93 세포를 배양하십시오.한 번 세척한 후 트립신을 사용하여 세포를 수확하고, 원심분리한 뒤 세포 펠릿을 신선한 완전 dmm에 다시 현탁합니다. 세포 수를 측정하고, 6-웰 플레이트에 약 70% 합류도(confluency)가 되도록 2mL 배양액을 분주합니다. 발현 컨스트럭트 및 대조 벡터를 트랜스펙션할 HEK 293 세포 웰을 지정합니다. 나중에 보정용으로 사용할 트랜스펙션되지 않은 HEK 293 세포를 일부 남겨둡니다.0.9% sodium chloride 200 µL, DNA 2.5 µg 및 polyethaline 4 µg/mL로 구성된 transfection mix를 준비합니다. 즉시 10초 동안 Vortex한 후 실온에서 10분간 배양하고, 이를 2 mL의 신선한 complete dmm이 들어있는 각 well에 첨가합니다. 플레이트를 덮고 측면을 parafilm으로 감싼 뒤, 세포 transfection을 돕기 위해 280 ×g에서 5분간 원심분리합니다.그 다음 파라필름을 제거하고 플레이트를 18시간 동안 배양 조건 하에 둡니다. 배양액을 신선한 complete DM EM으로 교체하고 72시간 더 배양합니다. 세포를 분리하기 위해 각 웰에 500 µL의 varice를 첨가하고 37 °C에서 약 5분 동안 배양합니다.그 다음, 각 웰의 세포를 2%FBS가 포함된 PBS 2mL에 재현탁하고, 3회 세척 후 원심분리관으로 옮깁니다. 세포 펠렛을 2%FBS 용액에서 mL당 100만 개의 세포 농도로 재현탁합니다. 이제 서로 다른 세포주가 각 환자 샘플 또는 1차 항체와 처리되도록 유세포 분석 획득을 위한 96웰 템플릿을 설계합니다.그런 다음 V-bottom 96-well plate의 well당 50,000개의 세포를 분주하고 450 Gs에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 플레이트를 기울여 세포 펠렛이 흡입되지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 항원의 표면 발현을 평가하기 위해 1차 항체를 단계 희석하여 첨가합니다.그 다음 항체를 검출하기 위해 환자 샘플을 처리합니다. 2% FBS 용액 170 µL로 3회 세척한 후, 적절한 AF 647 접합 2차 항체(환자용 anti-human IgG 및 1차 항체용 anti-US. IgG)를 첨가하여 암실 내 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 3회 세척 후 실온의 암실에서 1시간 동안 하이브리드화합니다.유세포 분석기에서 세포를 획득하기 위해 세포를 35 µL의 2% FBS 용액에 재부유합니다. 먼저 고처리량 샘플러를 설정합니다. 유세포 분석 획득 템플릿에 따라 웰당 10,000개의 이벤트를 획득합니다.데이터를 내보낸 후 유세포 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석합니다. 전방 및 측방 산란광을 기준으로 살아있는 HEK 293 세포를 게이팅합니다. 또한, 형질전환된 세포만 분석하기 위해 GFP 양성도가 높은 세포군을 게이팅합니다. 살아있는 GFP 양성 세포 내에서 AF 647 채널의 평균 형광 강도를 측정합니다.그 다음 분석을 위해 데이터를 Excel 또는 prism으로 내보냅니다. 각 환자 및 대조군 샘플에 대해 대응하는 샘플에서 얻은 MFI 대비 1차 항체 농도를 도식화합니다. delta MFI를 결정하고, 대조군 코호트의 평균 delta MFI에 표준 편차의 3배를 더하여 항체 양성 판정 임계값을 계산합니다.그런 다음 환자 그룹에 따라 분류된 개별 샘플을 그래프에 표시하십시오. 여기서 임계값은 선으로 표시합니다. n-methyl-D-aspartate 수용체 또는 dopamine 2 수용체를 발현하는 세포는 고처리량 샘플러가 장착된 유세포 분석기로 수집되었습니다.분석 과정에서 세포는 크기에 따른 전방 산란(forward scatter)과 과립도에 따른 측방 산란(side scatter)을 기준으로 게이팅되었습니다. 형질전환된 HK 2 9 3 세포는 세포질 내에서 GFP 리포터 분자를 발현했으며, 비형질전환 세포는 GFP 양성 게이트 내 분석에서 제외되었습니다. 인간 혈청 분석 시 배경 형광을 제거하기 위해 AF 6 47 접합 항인간 IgG 2차 항체 결합과 관련된 MFI를 측정하였습니다.델타 MFI는 대조군 세포의 배경 MFI를 빼서 계산하였습니다. 이 유세포 분석 기반 세포 분석법은 관심 있는 세포 표면 항원의 항체 검출을 기반으로 합니다. 예를 들어, N-M-D-A-R 발현 플라스미드가 형질전환된 GK 2 93 세포는 표면 및 methyl de receptor의 높은 발현을 보였습니다.마찬가지로, D two R 형질전환 세포는 도파민 two 수용체를 발현한 반면, 대조군 세포는 이들 항원 중 어느 것도 발현하지 않았습니다. 본 임상 연구에서는 N-M-D-A-R 뇌염 환자군, D two R 항체 관련 뇌염 환자군 및 기타 비염증성 신경계 질환을 가진 대조군을 평가하였습니다. 양성 환자 중 항체에 대해 이중 양성을 보인 사례는 없었음에 유의하십시오.예상대로 N-M-D-A-R과 D2R을 타겟팅하였습니다. 분석한 모든 대조군에서 N-M-D-A-R 및 D2R 항체는 검출되지 않았습니다. 숙달되면, 개발 후 약 80개 샘플의 유세포 분석 데이터 획득에 1시간을 포함하여 총 5시간 내에 이 기법을 적절히 수행할 수 있습니다.이 기술은 신경면역학 분야의 연구자들이 면역 매개 질환에서 새로운 항체 표적을 발견할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Medicine

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이 동영상은 서로 다른 항원과 결합된 형광 자기 구슬 또는 마이크로스피어를 사용하여 혈청 샘플에서 다양한 항체 동형을 동시에 검출하는 면역분석 기술에 대해 설명합니다. 이 분석은 감염 중 또는 백신 접종 후 혈청전환을 이해하는 데 도움이 됩니다.

Multianalyte Immunobead Assay: 인간 혈청 샘플에서 여러 항체 아형을 동시에 검출하기 위한 흐름 기반 면역분석 기법

이 비디오는 쥐 해마 신경 세포 배양을 사용하여 샘플에서 특정 항원에 대한 항체를 식별하는 기술을 보여줍니다. N-Methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)를 표적으로 하는 자가항체가 포함된 환자 샘플에 배양된 뉴런을 노출시킴으로써, 면역염색을 통해 뉴런 표면에 결합된 자가항체의 존재를 밝힙니다.

해마 신경 배양을 이용한 인간 혈청에서 자가항체를 검출하기 위한 분석

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

우리는 ectopically NMDA 수용 체에 대 한 자가 면역 뇌염으로 의심 되는 환자의 혈액에서 검출 하는 항으로 인간 배아 세포 (HEK293)에서 녹색 형광 단백질 태그로 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위를 표현. 이 간단한 방법 임상 설정에서 심사 적합 있을 수 있습니다.

Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

여기 우리는 중화 항 체 또는 인간 매트릭스, 뇌 척추 액체 (CSF) 등 인간의 혈 청에에서 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 방해 하는 다른 요소를 감지 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 제시.

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

세포 기반 분석 결과 세럼 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g.를 검출 하기 위하여 널리 사용 방법은 이 메서드는 임상 진단 및 neuromyelitis 광학 스펙트럼 장애의 과학적 연구에 적용할 수 있습니다.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

신경 흥분의 엔도-동적 과정 및 exocytosis 흥분 성의 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 통해 변조 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 표면 및 내부 수용 체 인구 풀 측정에 대 한 접근, 하이 콘텐츠 분석 결과가입니다.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

배우세요 고처리량 유동세포계측법을 이용한 NMDA-R 및 D2R 항체 검출 방법을 통해 면역매개성 신경질환의 진단을 개선하는 효율적인 세포 기반 분석 기술을 익히세요.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

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