인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 고처리량 유세포 분석 세포 기반 분석을 사용하여 환자 샘플에서 신경 세포, 항 D, 2, R 또는 N-M-D-A-R 항체를 검출하는 것입니다. 이는 플라스미드 내에서 인간 D two R 또는 N-M-D-A-R의 전체 CDNA 염기서열인 sub cling에 의해 달성됩니다. 두 번째 단계로, 인간 세포주를 형질 주입하여 신경 항원의 세포 표면 발현을 유도합니다.

다음으로, transfection된 세포를 유세포 분석 획득 전에 환자 혈청 및 적절한 2차 항체와 함께 배양합니다. 세포 표면 항원에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 유세포 분석을 기반으로 결과를 얻습니다. 이 당사의 높은 3포트 유세포 분석 세포 기반 분석은 대규모 환자 샘플 코호트에 대해 빠르고 정량적이며 효율적입니다.

이는 면역화학 및 컨포칼 분석과 함께 세포 기반 분석을 사용하는 것에 비해 상당한 이점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 유세포 분석기에서 적절한 수의 세포를 획득하기 위해 실험 과정에서 세포 손실로 어려움을 겪을 것입니다. 세척 사이에 세포를 흡인하지 않도록 주의하십시오.

transmembrane 단백질의 발현에 적합하고 항원과 녹색 형광 단백질의 세포 동시 발현을 가능하게 하는 발현 벡터를 선택하십시오. 예를 들어, 이 벡터는 내부 리보솜 진입 부위의 제어하에 향상된 GFP 리포터를 가지며, 염기서열분석에 의해 클론을 검증한 후, 적절한 제한 효소를 사용하여 전체 길이의 human CD NA를 벡터에 서브 클론하고, transfect 배양에 사용하기에 적합한 플라스미드 스톡을 만든다. HEK 2 93 세포는 10%의 소 태아 혈청을 함유한 완전한 DMEM입니다.

한 번의 세척 후 트립신으로 세포를 수확하고 세포를 원심 분리하고 세포 펠릿을 신선하고 완전한 DMM으로 현탁시킵니다. 세포를 세고, 약 70%Co fluency에서 6개의 well plates에 2ml의 배양물을 파종하고, HEK 2 93 cell의 wells를 발현 구조체 및 control vector와 함께 transfection을 위해 할당합니다. 나중에 보상을 위해 transfection된 HEK 2 93 세포에 일부를 보관하십시오.

200마이크로리터의 0.9%염화나트륨, 2.5마이크로그램의 DNA 및 밀리리터당 4마이크로그램의 폴리에틸렌으로 구성된 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다. 즉시 10초 동안 Vortex를 배양하고 실온에서 10분 동안 배양한 후 2ml의 신선한 완전 DMM의 각 웰에 트랜스펙션 믹스를 추가합니다. 플레이트를 덮고 측면을 퍼필로 감싸고 280GS에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 세포 형질 주입을 돕습니다.

그런 다음 파라 필름을 제거한 다음 플레이트를 18시간 동안 배양 조건에 놓습니다. 배양 배지를 새롭고 완전한 DM EM으로 교체하고 72시간 동안 배양을 더 유지합니다. 세포를 분리하려면 각 웰에 500마이크로리터의 바리스를 추가하고 섭씨 37도에서 약 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS에서 2%FBS 2밀리리터에 각 웰의 세포를 재현탁시키고 3회 세척 후 세포를 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 2%FBS 용액에서 밀리리터당 100만 개의 세포로 셀 팔레트를 재현탁합니다. 이제 유세포 분석을 위한 96웰 템플릿을 설계하여 서로 다른 세포주가 각 환자 샘플 또는 1차 항체로 처리되도록 합니다.

다음 씨 50, V 바닥 96 좋은 판에 있는 우물 당 000의 세포는 5 분 동안 450 Gs에 원심분리해서 세포를 펠릿화한다. 플레이트를 비스듬히 기울이고 세포 펠릿을 흡인하지 않도록 주의하면서 supra natin을 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 항원 표면 발현을 평가하기 위해 1차 항체의 연속 희석을 추가합니다.

그리고 그 후에 환자 표본은 항체를 검출하기 위하여 170 마이크로리터의 2%FBS 해결책에 있는 3개의 세척 후에 암흑 속에 있는 실온에 1 시간 동안 세포를 배양하고, 환자 및 반대로 미국을 위한 적합한 AF 6 47에 의하여 공액 2차 항체 항 인간 IgG를 추가합니다. 1차 항체에 대한 IgG. 3회 세탁 후 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 하이브리드화합니다.

Resus는 유세포 분석기에서 유세포 분석 세포 획득을 위해 35마이크로리터의 2%FBS 용액에 세포를 현탁시킵니다. 먼저 고처리량 샘플러를 설정합니다. 유세포 분석 수집 템플릿에 따라 well당 10, 000개의 이벤트를 획득합니다.

유세포 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 내보낸 다음 전방 내부 산란을 기반으로 라이브 HEK 2 93 셀을 게이트로 분석합니다. 또한 높은 GFP 양성률을 통해 형질주입된 세포만 분석합니다. 살아있는 GFP 양성 세포 내에서 AF 6 47 채널의 평균 형광 강도를 측정합니다.

그런 다음 분석을 위해 데이터를 Excel 또는 프리즘으로 내보냅니다. 각 환자 및 대조군 샘플에 대한 해당 샘플에서 얻은 MFI에 대한 1차 항체의 농도를 플롯합니다. 델타 MFI를 결정하고, 대조군 코호트의 평균 델타 MFI보다 3 표준 편차를 추가하여 항체 양성의 임계값을 계산합니다.

그런 다음 환자 그룹에 따라 그룹화된 개별 샘플을 그래프에 플로팅합니다. 여기에서 임계값을 선으로 나타냅니다. n methyl de aspartate receptor 또는 dopamine two receptor를 발현하는 세포를 고처리량 샘플러를 사용하여 유세포 분석기에서 획득했습니다.

분석하는 동안 셀은 크기에 대한 전방 산란(forward scatter)과 입도에 대한 측면 산란(side scatter)을 기반으로 게이트되었습니다. TRANSFECTION된 HK 2,9,3 세포는 세포질에서 GFP 리포터 분자를 발현시켰고, UNT transfection된 세포는 GFP 양성 보행 내에서 분석에서 제외되었습니다. AF 6 47 conjugated anti-human IgG 2차 항체 결합과 관련된 MFI는 human sera를 분석할 때 배경 형광을 제거하기 위해 측정되었습니다.

델타 MFI는 대조 셀의 배경 MFI를 빼서 계산했습니다. 이 유세포 분석 세포 기반 분석은 관심 세포 표면 항원의 항체 검출을 기반으로 합니다. 예를 들어, N-M-D-A-R에 대한 플라스미드 발현으로 형질주입된 GK2 93 세포는 표면 및 메틸 데 수용체의 높은 발현을 보여주었다.

유사하게, D2R형질주입된 세포는 도파민 2 수용체를 발현한 반면, 대조 세포는 이들 항원을 발현하지 않았다. 본 임상시험은 N-M-D-A-R 뇌염이 있는 환자 코호트, D 2개의 R 항체 관련 뇌염이 있는 환자 코호트, 그리고 다른 비염증성 신경 질환이 있는 대조군 코호트를 평가했다. 양성 환자 중 항체에 대해 이중 양성인 환자는 없었습니다.

예상대로 N-M-D-A-R-M-D 2 R을 대상으로합니다. N-M-D-A-R 및 D, 2개의 R 항체는 분석된 대조군 중 어느 것에서도 검출되지 않았습니다. 이 기술은 일단 마스터되면 개발 후 약 80개의 샘플에 대해 1시간의 흐름 수집으로 5시간 내에 적절하게 수행할 수 있습니다.

이 기술은 신경면역학 분야의 연구자들이 면역 매개 질환에서 새로운 항체 표적을 발견할 수 있는 길을 열었습니다.