비행 고환에있는 영상 중심체
September 20th, 2013
초파리의 정자 중 centrosomal 단백질의 영상은 중심체 생물학에 중요한 새로운 단백질을 식별 할뿐만 아니라이 과정에서 알려진 선수의 특정 기능을 명료하게하는 강력한 방법입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 표지된 Centro Somal 마커를 사용하여 새로운 유전적 돌연변이를 스크리닝하고 새로 확인된 Centro somal 유전자의 기능을 밝히는 것입니다. 이는 세 가지 다른 이미징 전략으로 달성할 수 있습니다. 살아있는 고환의 이미징, 트랙 B, 고환의 화학적 고정 또는 트랙 C 면역 염색을 추적합니다.
절차의 첫 번째 단계는 유전적으로 표지된 중심체 단백질을 발현하는 파리의 고환을 분리하는 것이며, 이는 즉각적인 이미징으로 이어질 수 있습니다. 두 번째 단계는 고환을 화학적으로 고정하는 것이며, 그 다음에는 이미징을 수행할 수도 있습니다. 셋째, 고환은 면역 염색 후 이미지화할 수 있습니다.
궁극적으로 중심 단백질의 위치는 형광 현미경 검사로 식별됩니다. 이 방법은 중심 형성의 분자 기초, 중심 신장 및 중심 분리와 같은 중심 영역 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. JoVE 간행물 2 6 4 1에 자세히 설명된 대로 초파리 고환을 분리하는 것으로 시작합니다.
고환을 분리한 후, 표본을 양전하를 띤 유리 현미경 슬라이드에 갓 준비한 6마이크로리터의 실온 dappy 염색 완충액에 담그십시오. 10분 정도 기다린 다음 염색 버퍼를 두 번 교체하여 과도한 DPI를 부드럽게 씻어냅니다. 6 마이크로 리터의 PBS로.
고환이 씻겨 나가지 않도록 주의하세요. 여과지 조각을 사용하여 슬라이드를 wickwickly 제거하여 슬라이드에서 용액을 제거합니다. 6 마이크로 리터 용량은 18 평방 밀리미터 커버 슬립에 적합합니다.
이제 날카로운 메스를 사용하여 관심 세포 유형 근처의 고환을 뚫는 데 도움이 되며, 이는 찌그러뜨리는 단계에서 이러한 세포에 가해지는 압력을 최소화합니다. 그런 다음 표본 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 그런 다음 펜으로 슬라이드의 고환 위치를 표시하고 이미징을 진행합니다.
고환을 분리한 후 양전하를 띤 유리 현미경 슬라이드 위에 있는 6마이크로리터의 PBS 방울에 고환을 담그십시오. 선형 방식으로 또는 다른 방식으로 고환을 수동으로 배치합니다. 그런 다음 여과지를 사용하여 PBS를 심지로 제거하고 새로 준비한 6마이크로리터의 고정 버퍼로 교체합니다.
고정 버퍼에서 5분 후 여과지로 심지를 제거합니다. 이제 검체를 갓 준비한 DPI 염색 버퍼 6마이크로리터에 10분 동안 담급니다. DPI를 6마이크로리터 부피의 PBS 2개로 교체하여 세척합니다.
그런 다음 표본 위에 18제곱밀리미터 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 그런 다음 슬라이드에 고환의 위치를 표시하고 이미징을 진행합니다. 이 절차를 위해 먼저 실리콘 커버 슬립을 준비하십시오.
먼저 흄 후드 아래 실온에서 실리콘 용액이 담긴 작은 트레이에 커버 슬립을 1분 동안 담그고 커버 슬립이 완전히 노출되어 있고 서로 겹쳐지지 않았는지 확인합니다. 다음으로, 커버 슬립을 세탁할 때마다 1분 동안 물에 세 번 세탁합니다. 그런 다음 70% 에탄올로 1분 동안 세 번 씻고 마지막으로 물로 1분 동안 씻습니다.
그런 다음 실리콘으로 처리된 커버 슬립이 흄 후드 아래에서 자연 건조되도록 합니다. 여러 고환을 해부하고 표본 유형의 슬라이드를 무덤에 넣은 후 실리콘화 커버 슬립에 5마이크로리터의 PBS를 추가하고 고환을 PBS 액적으로 옮깁니다. 성공을 보장하기 위해 각각 단일 고환이 있는 여러 개의 커버 슬립이 필요합니다.
다음으로, 해부 현미경으로 앞에서 설명한 것처럼 각 고환을 조심스럽게 뚫습니다. 이제 양전하를 띤 유리 현미경을 부드럽게 놓습니다. 커버 슬립 위로 밀어 PBS가 커버 슬립과 슬라이드 사이에 고르게 분산되도록 합니다.
그런 다음 커버 슬립과 슬라이드 사이의 과도한 버퍼를 wickly 제거, 이는 고환에 대한 압력을 증가시키고 찌그러뜨릴 것입니다. 이제 준비된 슬라이드를 액체 질소에 떨어뜨립니다. 이제 더 많은 슬라이드를 준비하고 탱크에 추가할 수 있습니다.
큰 집게를 사용하여 진행하기 전에 액체 질소에서 슬라이드 중 하나를 제거하고 재빨리 메스를 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 시편은 시편에서 커버 슬립을 제거하는 동안 슬라이드에 남아 있어야 합니다. S 슬라이드의 표면을 따라 번지지 않도록 주의하십시오.
이것은 메스를 사용하여 한 번의 빠른 동작으로 덮개를 밀어 넣음으로써 달성할 수 있습니다. 이제 메탄올로 채워진 유리 코플랜 염색 용기에 슬라이드를 배양합니다. 영하 20도에서 15분간 냉각합니다.
배양 후 슬라이드를 아세톤이 들어있는 병으로 옮깁니다. 아세톤에서 30초 후 섭씨 영하 20도에서 냉각합니다. 실온의 PBS에서 1분 동안 슬라이드를 세척합니다.
다음으로, 비특이적 부위를 막기 위해 새로 준비된 PBST에서 슬라이드를 10분 동안 배양합니다 PBS 결핵을 배양하는 동안 수분 챔버의 웰에 물을 채웁니다 10분 후 PBST에서 슬라이드를 제거하고 검체 주위의 각 슬라이드를 건조시킵니다. 표본 자체가 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 슬라이드가 건조되면서.
수분 챔버에 넣으십시오. 항체 용액을 추가하기 전에 검체를 둘러싼 슬라이드 영역을 건조시키는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 항체가 검체에 국한된 상태로 유지되어 배양 단계 중 건조를 방지할 수 있습니다.
그런 다음 새로 준비된 P-B-S-T-B-R에 희석된 1차 항체 100마이크로리터를 검체에 부드럽게 떨어뜨립니다. 특성화되지 않은 항체에 대해 1에서 200 사이의 희석을 사용합니다. 그런 다음 표본 위에 1cm 정사각형의 파라폼 조각을 놓아 항체 용액을 펴고 항체 용액이 증발하지 않도록 보호합니다.
표본을 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후 집게를 사용하여 슬라이드에서 파라폼을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 PBST에서 실온에서 세탁할 때마다 5분 동안 슬라이드를 세 번 세탁합니다.
그 후, 검체가 위를 향하도록 슬라이드를 수분 챔버로 옮기고 PBST, BR로 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 검체에 부드럽게 첨가합니다. 이전과 마찬가지로 파라폼을 적용하고 PBST에서 5분 세척 3회, PBS에서 5분 세척 3회로 2차 세척을 한 시간 동안 기다립니다. 그런 다음 조심스럽게 표본을 건드리지 않고 슬라이드를 건조시킵니다.
6마이크로리터의 장착 매체를 추가하고 표준 커버 슬립을 적용합니다. 커버 슬립을 매니큐어로 밀봉하고 고환의 위치를 표시한 후 이미징을 진행합니다. 중심소체는 정자 형성 과정에서 여러 형태학적, 기능적 변형을 겪습니다.
쉽게 관찰할 수 있는 과정 중 하나는 정자형성증의 중심소체 신장이며, LAR 마커 ANA one GFP는 0.6미크론 길이의 올레를 표시하며, 이 올레는 정자 형성 중에 연장되고 거의 성숙한 정자에서 2.5미크론의 길이에 도달합니다. 초파리 정자의 센트리 오일은 독특하게 길기 때문에 이미징을 사용하여 중심체 신장에 대한 정량적 진술을 할 수 있습니다. 야생형 형태학과 비교하여, 중심 성장을 변화시키는 다양한 돌연변이가 확인되었다.
두 가지 예는 항상 초기와 대포알 돌연변이가 있는데, 이는 감수분열이 시작되기 전에 정자 형성을 저지하지만 이러한 돌연변이에서 센트 신장을 차단하지 않습니다.성숙한 정자 세포의 센트 오일은 최대 길이가 1.8 미크론에 이르는 대조 세포의 센트 오일에 비해 약 2.4 미크론으로 성장합니다. 일단 마스터되면 샘플 크기에 따라 트랙 A는 20분, 트랙 B는 30분, 트랙 C는 3시간에서 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 비행 중인 중심체를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
개요
이 기사는 드로소필라 정자 발생 중 중심체 단백질의 이미징 기술을 자세히 설명하며, 중심체 생물학에서 중요한 단백질과 그 기능을 식별하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 유전학
배경
- 중심체는 세포 분열과 조직화에서 중요한 역할을 합니다.
- 드로소필라는 중심체 생물학 연구를 위한 효과적인 모델 생물체입니다.
- 이미징 기술은 중심체 단백질의 역학을 밝힐 수 있습니다.
- 이러한 과정을 이해하면 더 넓은 생물학적 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- 유전적으로 태그된 중심체 마커를 사용하여 새로운 유전자 돌연변이를 스크리닝합니다.
- 새로 식별된 중심체 유전자의 기능을 밝힙니다.
- 중심체 형성 및 기능의 분자적 기반을 탐구합니다.
사용된 방법
- 태그된 중심체 단백질을 발현하는 드로소필라 정소의 분리.
- 세 가지 이미징 전략: 생체 이미징, 화학적 고정, 면역 염색.
- 중심체 단백질의 위치를 식별하기 위한 형광 현미경 사용.
- 효과적인 이미징을 위한 특정 완충액 및 항체의 사용.
주요 결과
- 다양한 조건에서 중심체 단백질의 성공적인 이미징.
- 새로운 중심체 단백질 및 그 기능의 식별.
- 정자 발생 중 중심체 행동의 역학에 대한 통찰력.
- 중심체 관련 질병을 이해하는 데 대한 잠재적 의미.
결론
- 이미징 기술은 중심체 생물학 연구를 위한 강력한 틀을 제공합니다.
- 연구 결과는 세포 분열에서 중심체 기능 이해에 기여합니다.
- 향후 연구는 이러한 방법을 기반으로 다른 세포 과정을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Imaging centrosomes in Drosophila testes enables high-resolution analysis of centrosomal protein dynamics, supporting early-stage target validation in cell division and differentiation pathways. This approach provides predictive confidence for identifying and characterizing novel proteins implicated in centrosome function, directly informing portfolio decisions in discovery biology. The method's scalability and genetic tractability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking across multiple R&D programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of centrosomal protein function and pathway involvement during spermatogenesis.
- Supports biological de-risking by distinguishing effects of specific genetic mutations on centrosome morphology and dynamics.
- Facilitates functional target validation through quantitative imaging of centrosome elongation and separation.
- Provides a robust system for triaging candidate genes based on phenotypic impact.
Screening & Assay Development
- Prepares validated Drosophila models expressing tagged centrosomal proteins for downstream genetic screens.
- Standardizes imaging workflows using live, fixed, and immunostained samples for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable screening of mutants to identify novel regulators of centrosome biology.
- Delivers reliable phenotypic readouts for compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms where centrosome dysfunction contributes to pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in a genetically tractable system.
- Provides predictive de-risking for advancing targets implicated in cell division and differentiation disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic clarification in centrosome biology.
- Discovery Biology: Quantitative imaging of centrosome morphology enables hypothesis-driven interrogation of protein function and pathway mapping.
- Screening: Standardized imaging protocols ensure reproducibility and assay readiness for high-throughput mutant analysis.
- Analytics: Fluorescence microscopy provides quantitative measurements of centrosome elongation and separation for comparative analysis.
- Translational Research: Mechanistic insights inform preclinical models of cell division-related diseases when supported by genetic evidence.
- Enterprise Reuse: The Drosophila testis system serves as a reusable platform for ongoing target validation and functional genomics studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in centrosome-related target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows for genetic and phenotypic screening.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of discovery-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and triage of candidate genes implicated in cell division and differentiation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to imaging infrastructure and validated genetically tagged markers.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of genetic tools and markers.
- Throughput and scalability are influenced by sample handling and imaging capacity.
