AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다음 실험의 전반적인 목표는 FM 기반 단일 분자 힘 분광법을 사용하여 융합 단백질 결합 파트너의 기계적 특성과 접힘 상태를 연구하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 잘 정의된 당김 기하학을 달성하기 위해 유리 슬라이드와 A FM 캔틸레버에서 단백질 결합 파트너를 공유 고정함으로써 달성됩니다. 유리 표면은 캔틸레버로 움푹 들어가 수용체 리간드 결합을 설정할 수 있습니다.

다음으로, 캔틸레버는 개별 단백질 도메인을 펼치고 수용체 리간드 복합체를 연결하기 위해 일정한 속도로 후퇴하며, 이는 풀림 경로를 따라 에너지 장벽 역할을 하는 3차 구조 요소를 드러내며, 이는 고분자 탄성 모델에서 드러납니다. 결합 파트너에 대한 추가 운동 및 에너지 정보는 운동 모델을 동적 힘 스펙트럼에 피팅하여 얻을 수 있습니다. 이 절차의 전반적인 목표는 힘으로 작용하는 단백질의 전개 경로를 연구하는 것입니다.

이 방법은 단백질의 기계적 안정성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 접근 가능한 파일 그룹으로 엔지니어링할 수 있는 모든 단백질 수용체 리간드 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 연구자들은 타이밍이 중요하고 캔틸레버를 다루는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪습니다.

이 방법은 다중 도메인 단백질이 어떻게 펼쳐지는지와 같은 생물 물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 2 x 24 밀리미터 직경, 0.5 밀리미터 두께의 유리 커버는 A-P-T-F-E 홀더에 미끄러져 넣은 다음 초음파 처리합니다. 덮개는 에탄올과 초순수의 50-50 혼합물에서 15 분 동안 미끄러집니다.

초음파 처리가 완료되면 커버 슬립을 초순수로 헹구고 피라냐 용액에 30 분 동안 에칭합니다. 30분 후 커버 슬립을 제거하고 초순수로 헹구고 부드러운 질소 흐름으로 건조시킵니다. 다음 잠수: 덮개는 에탄올, 초순수와 3개의 아미노 프로필 디메틸 아호이의 45 대 5 대 1 혼합물로 미끄러집니다.

침수 샘플을 실온의 셰이커에 넣고 분당 약 50회 회전하면서 60분 동안 가열합니다. 그런 다음 커버 슬립을 100% 에탄올에 순차적으로 담근 다음 초순수를 각각 두 번씩 담그십시오. 다시 말하지만, 부드러운 질소 흐름 아래에서 덮개를 말리십시오.

건조되면 커버 슬립을 섭씨 80도의 오븐에서 30분 동안 굽습니다. 사용하지 않은 커버 슬립을 아르곤 아래에 최대 6주 동안 보관하여 실리콘 캔틸레버 팁의 아미노화를 수행합니다. 먼저 깨끗한 유리 슬라이드에 4개의 실리콘 캔틸레버를 놓고 15분 동안 UV 오존으로 처리합니다.

그런 다음 3 분 동안 캔틸레버를 담그고 에탄올과 3 개의 아미노 프로필 디메틸 옥시스 Ilene의 50-50 용액을 25 % 초순수와 함께 담그십시오. 다음으로, 캔틸레버를 톨루엔, 에탄올 및 초순수 베이커에서 60초 동안 순차적으로 헹굽니다. 최종 헹굼 후 RIN 사이의 여과지에서 캔틸레버를 조심스럽게 건조시킵니다.

캔틸레버를 깨끗한 유리 슬라이드에 놓고 섭씨 80도에서 30분 동안 굽습니다. 먼저 200 마이크로리터 피펫 팁의 팁을 잘라 직경을 넓힌 다음 100 마이크로리터의 스톡 비드 용액을 각 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 피펫팅하여 2 Ts의 TEP diss sulfide 환원 비드를 준비합니다. 다음으로, TEP 비드 슬러리 OTT에 TBS 1ml를 첨가하고 마이크로 튜브를 잠시 와류로 헹굽니다.

그런 다음 850Gs에서 3분 동안 샘플을 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 마이크로 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리고 1ml의 TBS로 비드를 두 번 더 헹굽니다.최종 헹굼 후 헹굼 사이의 원심분리는 TEP 비드에 밀리리터당 3밀리그램의 농축 단백질 용액을 1:2 비율로 첨가하고 기포가 유입되지 않도록 마이크로 피펫 팁으로 저어주어 슬러리를 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 단백질 TEP 비드 슬러리 혼합물을 2.5시간 동안 회전기에 놓습니다. 아미노 아이스 캔틸레버를 담그고 pH 8.5의 베이트 완충액에 슬립을 45분 동안 덮어 표면의 1차 아민기를 양성자화합니다. 그런 다음 N-H-S-P-E-G 말람 분말을 실온으로 가열하고 나트륨 보이 8 버퍼에서 볼텍싱하여 210 마이크로 리터를 25 마이크로 몰로 준비합니다.

이 솔루션은 NHS의 반감기가 매우 짧기 때문에 가능한 한 빨리 사용해야 합니다. pH 8.5에서 30마이크로리터의 N-H-S-P-E-G 말람 용액을 페트리 접시에 빠르게 증착하고 90마이크로리터를 다른 모든 유리 커버 슬립에 증착합니다. 30마이크로리터 방울 안에 캔틸레버를 조심스럽게 놓습니다.

그런 다음 물방울이 없는 커버 슬립을 N-H-S-P-E-G 말람 용액이 있는 용액으로 뒤집어 N-H-S-P-E-G 말람 용액으로 샌드위치를 만듭니다. 중간에 캔틸레버와 커버 슬립을 실온에서 1시간 동안 실온에서 N-H-S-P-E-G MALAM 용액으로 배양합니다. TEP 비드와 환원 단백질 용액을 100GS에서 1분 동안 원심분리하고 스내트를 수집합니다.

다음으로, 단백질 용액을 TBS로 희석합니다. 표면 접합 중 단백질 농도를 밀리리터당 0.5-2밀리그램 범위로 목표로 합니다. 그런 다음 감소되고 희석된 단백질 용액을 몇 분 동안 따로 보관하는 동안 캔틸레버를 헹구고 슬립을 덮습니다.

커버 슬립을 초순수가 담긴 세 개의 순차적인 비커로 헹굽니다. 가장자리를 조심스럽게 터치하여 용지를 여과하여 커버 슬립에 남아 있는 액체를 제거합니다. 그런 다음 커버 슬립을 적절한 s에 장착합니다.ampA FM 기기와 호환되는 홀더 및 잔류 액체를 부드러운 질소 흐름 아래에서 건조시킵니다.

20마이크로리터의 희석된 단백질 용액을 덮개 슬립 중앙에 작은 방울로 바르십시오. 그런 다음 캔틸레버를 초순수의 순차적인 3개의 비커로 헹구고 두 번째 희석된 단백질 용액의 30마이크로리터 방울을 헹굽니다. pegylated 커버 슬립 및 캔틸레버를 각각의 희석된 단백질 용액과 함께 실온에서 습도 챔버에서 1-2시간 동안 배양합니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 1ml의 TBS로 커버 슬립을 10회 이상 헹구고 측정할 때까지 TBS에 보관하십시오. 또한 TBS가 들어있는 3개의 순차적 비커를 사용하여 캔틸레버를 헹구어 결합되지 않은 단백질을 제거하고 TBS에도 보관합니다. 기능화된 캔틸레버 및 유리 슬라이드를 액체 측정에 적합하고 초당 약 200-5, 000나노미터의 Z 피에토에서 접근 가능한 속도 범위를 지원하는 A FM 모델에 장착합니다.

캔을 장착할 때 공기 노출을 최소화할 때 레이저 빔을 올바르게 조정한 후 전체 프로세스 동안 표면이 버퍼로 덮여 있는지 확인하십시오. 드리프트 효과를 줄이기 위해 시스템을 최소 30분 동안 평형을 유지하고 필요한 경우 다시 조정하십시오. 그런 다음 응집력의 성공적인 결합에 대한 측정을 시작하십시오.

Docker in pair: 여기에 표시된 기록된 힘 거리 추적. 특징적인 피크 패턴을 나타냅니다. 트레이스의 모든 피크는 하나의 단백질 하위 영역의 전개를 나타내며, 마지막 피크는 수용체 리간드 복합체의 해리에 해당합니다.

그런 다음 기록된 힘 거리 추적은 힘 윤곽선 길이 공간으로 변환되고 장벽 위치 히스토그램에 조립되었습니다. 이 데이터는 약 89나노미터의 윤곽 길이 증가를 보여주며, 이는 응집력 있는 도커 및 상호 작용의 에너지 환경을 조사하기 위해 xin 영역의 풀림에 명확하게 할당될 수 있습니다. 총 186개의 데이터 추적이 4개의 서로 다른 풀링 속도에서 얻어졌습니다.

그 결과 큰 파란색 원으로 표시된 동적 힘 스펙트럼은 주어진 하중 속도에서 가장 가능성이 높은 파열력을 나타냅니다. 그런 다음 이 값을 Bell Evans 모델에 적합시켰고, 적합도는 Koff 및 delta X에 대한 값을 산출했으며, 이는 이전에 발표된 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면, 이 기술의 실험적인 부분은 8-9시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 후속 실험에서 부위 특이적 돌연변이 유발을 수행하여 개발 후 결합에 중요한 아미노산을 결정할 수 있습니다. 이 기술은 단일 분자 생물 물리학 분야의 연구자들이 단백질 접힘 풍경을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 우리는 이를 사용하여 기계적으로 가장 안정적인 단백질 시스템으로 알려진 셀룰로오스 SOE의 기계적 특성을 연구합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 단백질 수용체 리간드 쌍에 대해 단일 분자 힘 분광법을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.