Name: AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 탐색하세요 AFM 기반 단일분자 힘 분광법을 사용하여 셀룰로솜 수용체-리간드 상호작용의 기계적 특성과 폴딩 상태를 연구하는 방법을 배우세요. 이 기법은 단백질 안정성과 생물물리학 연구에 필수적입니다.

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저자는 유럽 연구 위원회(European Research Council)가 헤르만 가우브(Hermann Gaub)에게 준 고급 보조금의 자금 지원을 인정한다. 마이클 A. 내쉬(Michael A. Nash)는 브랑코 바이스 펠로우십 프로그램인 소사이어티(Society in Science)의 자금 지원에 감사를 표합니다. 저자들은 이 연구에 사용된 단백질을 관대하게 제공한 와이즈만 과학연구소(Weizmann Institute of Science)의 에드워드 A. 바이어(Edward A. Bayer), 요아브 바락(Yoav Barak), 다니엘 B. 프리드(Daniel B. Fried)에게 감사를 표한다. 저자는 도움이 되는 토론을 해준 Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner, Stefan W. Stahl에게 감사를 표합니다.

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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

단일 분자 힘 분광법 실험에서 의미 있는 데이터를 얻으려면 잘 정의되고 재현 가능한 당김 형상을 달성하는 것이 중요합니다. 여기에 사용된 프로토콜은 정의된 당김 형상에서 단백질 복합체의 부위 특이적 고정화를 초래합니다.
이 연구에 사용된 캔틸레버는 물에서 힘 민감도와 높은 공진 주파수 때문에 선택되었습니다. 또한, 약 10nm의 작은 팁 곡률은 다중 상호 작용의 가능성이 감소하기 때문에 단일 분자 실험에 유리합니다. 그러나 캔틸레버 암의 작은 설치 공간(38x16μm2)은 광학 편향 방법(29)을 사용할 때 레이저 빔의 조정을 복잡하게 만듭니다. 이 연구에 사용된 설정에서 집중된 레이저 빔의 직경은 캔틸레버의 너비와 비슷합니다. 결과적으로 일정한 합계 신호를 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 캔틸레버의 레이저 드리프트는 우리가 설명한 것처럼 역광학 레버 감도를 수정하기 위해 데이터 곡선 전체의 노이즈 분석을 사용하여 부분적으로 보상할 수 있습...

셀룰로솜은 혐기성 셀룰로분해 박테리아(예: C. 열세포)의 표면에 표시되는 큰 다효소 복합체로, 식물 세포벽 리그노셀룰로오스를 용해성 올리고당으로 효율적으로 해중합하도록 진화했습니다1. 셀룰로솜의 핵심 속성은 친화도가 높은 코헤신-도커인 상호 작용입니다. 가장 두드러진 패러다임에서, 고도로 보존된 60-75 아미노산 유형 I 도커인 모듈이 다양한 박테리아 효소의 C 말단 말단에 표시됩니다. dockerin 모듈은 효소의 시너지 조합 어셈블리를 비촉매 스캐폴드 단백질('스캐폴딘')로 지시하며, 이 단백질은 유형 I 도커인 모듈에 특이적인 응집체 도메인의 폴리단백질을 구성합니다. 더 높은 수준에서, 셀룰로솜 구조는 매우 복잡해질 수 있으며, 구조를 세포 표면에 고정하고 여러 골격을 포함하는 분지 구조의 조립을 허용하는 대체 응집체 및 도커인 쌍(예: 유형 II, 유형 III)을 통합합니다2. 다양한 코헤신-도커인 유형은 관련 구조를 가지고 있음에도 불구하고 의도하지 않은 스캐폴딘 또는 다른 셀룰로솜 생성 박테리아 종의 성분과의 교차 반응을 억제하는 차등 결합 특이성을 나타냅니다. 생물정보학 접근법은 유전자 수준에서 수천 개의 고유한 셀룰로솜 구성 요소를 성공적으로 식별했지만 단백질 구조는 비교적 적게 알려져 있으며 코헤신-도커인 특이성 결정에 작용하는 메커니즘은 구조 생물학 연구의 활발한 영역으로 남아 있습니다.
Binnig et al.에 의해 원자력 현미경(AFM)이 발명된 이후.3, 비접촉 이미징, 진동 모드 이미징4 및 단일 분자 힘 분광법(SMFS)5,6을 포함하여 다양한 AFM 작동 모드가 개발되고 지속적으로 개선되었습니다. SMFS는 개별 단백질7-11, 핵산12-15 및 합성 고분자16-19를 직접 조사하는 데 널리 사용되는 기술로 발전했습니다. 수용체-리간드 결합20,21을 조사하기 위한 일반적인 SMFS 실험에서 AFM 캔틸레버 팁은 결합 파트너 중 하나로 수정되는 반면 평평한 유리 표면은 상보적 결합 파트너로 수정됩니다. 수정된 캔틸레버는 표면과 접촉하여 파트너가 바인딩할 수 있도록 합니다. 그런 다음 캔틸레버의 바닥을 일정한 속도로 빼내고 광학 레버 편향 방법을 사용하여 힘을 측정합니다. 결과 힘-거리 데이터 추적은 바인딩이 설정된 경우 톱니와 같은 피크를 나타냅니다. 결합 파트너가 여러 단백질 도메인에 융합되는 경우, 힘-거리 추적의 각 피크는 단일 단백질 도메인 또는 접힌 하위 도메인의 풀림과 상관될 수 있으며, 마지막 피크는 단백질 결합 계면의 파열에 해당합니다. 힘 저항 요소의 특정 위치는 관심 있는 다양한 단백질 영역을 식별하기 위한 지문으로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 단백질 접힘 및 안정화에 관여하는 중요한 아미노산을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. SMFS 실험에서 관찰된 특징적인 힘 확장 거동을 치료하기 위해 많은 모델이 문헌에 보고되었습니다. 가장 일반적으로 사용되는 모델에는 자유 접합 사슬(FJC) 모델22, 웜 유사 사슬(WLC) 모델18,23-25 및 자유 회전 사슬(FRC) 모델25,26이 포함됩니다.
이전 작업11에서는 단일 분자 힘 분광법을 사용하여 cohesin 및 dockerin 모듈의 상호 작용을 조사했습니다. 여기에서는 enzyme-dockerin 및 CBM-cohesin 단백질 구조를 사용한 유리 표면 및 캔틸레버 기능화를 위한 실험 프로토콜을 제시합니다. 또한 데이터 수집 및 분석 절차를 포함한 AFM 기반 SMFS 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 설명된 프로토콜은 다른 분자 시스템으로 쉽게 일반화될 수 있으며, 친화성이 높은 수용체 리간드 쌍에 관심이 있는 연구자에게 특히 유용하다는 것이 입증되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilane</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 디설파이드 환원 겔</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever 미니 질화규소 캔틸레버</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>소프트 배치</td></tr><tr><td>XYZ 압전 액추에이터</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선 " 광범위한 스펙트럼" IR 레이저</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM 컨트롤러</td><td>망명 연구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이고르 프로 6.31</td><td>웨이브 메트릭</td><td></td><td>데이터 수집 및 분석</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 염화칼슘 <tr><td>염화칼슘 pH 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕산나트륨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td>, <td>직경 24mm, 두께 0.5mm,</td></tr><tr><td>PTFE 샘플 홀더</td><td></td><td></td>, <td>맞춤형</td></tr><tr><td>초음파 발생기 욕조</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td>분석 순도</td></tr><tr><td>, 황산(농축),</td><td></td><td></td> <td>분석 순도</td></tr><tr><td>, 과산화수소(30%)</td><td></td><td></td><td>, 분석 순도</td></tr>, <tr><td>오비탈 셰이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td></td><td></td><td>분석 순도</td></tr><tr><td>필터 페이퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td></td><td></td><td>마이크로 튜브</td></tr><tr><td>회전자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afm 기반 single-molecule force spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

셀룰로솜은 혐기성 박테리아와 곰팡이의 하위 집합이 리그노셀룰로오스 기질을 소화하는 데 사용하는 개별 다효소 복합체입니다. 비촉매 스캐폴드 단백질에 대한 효소의 조립은 상호 작용하는 코헤신 및 도커인 모듈을 포함하는 관련 수용체-리간드 쌍 제품군 간의 상호 작용에 의해 지시됩니다. 코헤신(cohesin)과 도커린(dockerin) 모듈 사이의 매우 강력한 결합으로 인해 낮은 피코몰에서 나노몰 범위의 해리 상수가 발생하며, 이는 기존의 벌크 방법으로는 정확한 오프레이트 측정을 방해할 수 있습니다. 원자력 현미경을 사용한 단일분자 힘 분광법(SMFS)은 힘에 대한 개별 생체 분자의 반응을 측정하며, 다른 단일 분자 조작 방법(예: 광학 핀셋)과 달리 고하중 영역(>120 pN)을 조사할 수 있는 능력으로 인해 고친화성 수용체-리간드 상호 작용을 연구하는 데 최적입니다. 여기에서는 단일 분자 수준에서 셀룰로솜 단백질 어셈블리를 연구하기 위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 천연 셀룰로솜에서 파생된 단백질 토폴로지를 사용하여 효소-도커인 및 탄수화물 결합 모듈-코헤신(CBM-코헤신) 융합 단백질을 사용했으며, 각각은 엔지니어링된 시스테인 잔기에서 접근 가능한 유리 티올 그룹을 가지고 있습니다. 우리는 high-affinity complex에 대한 자세한 결합 매개변수를 얻기 위한 측정 및 데이터 분석 절차와 함께 부위별 표면 고정화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 단일 하위 도메인 전개력, 복잡한 파열력, 운동 오프 레이트 및 결합 웰의 잠재적 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 다중영역 셀룰로분해 복합체의 조립을 담당하는 코헤신-도커인 상호작용을 특성화하는 데 있어 이러한 방법의 성공적인 적용이 자세히 설명됩니다.

우리는 C. thermocellum 유래의 type I cohesin-dockerin 쌍을 조사하기 위해 기술된 절차를 사용하였습니다. cohesin-dockerin 쌍이 성공적으로 결합함에 따라, 기록된 힘-거리 트레이스(force distance traces)에서 특징적인 피크 패턴이 나타났습니다. 전형적인 트레이스는 그림 4a에 표시되어 있습니다. 트레이스의 각 피크는 하나의 단백질 서브도메인의 언폴딩(unfolding)을 나타내며, 마지막 피크는 수용체-리간드 복합체의 해리를 의미합니다.
본 연구에서 조사한 CBM-cohesin-dockerin-xylanase 복합체의 경우, 초기 힘의 상승은 PEG 링커 분자의 신장에 해당합니다. 이후 최대 3회까지 나타나는 일련의 하강 힘 강하(force dips)는 xylanase 도메인의 언폴딩(unfolding)을 반영합니다. 마지막 피크는 cohesin-dockerin 결합 인터페이...

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 FM 기반 단분자 힘 분광법을 사용하여 융합 단백질 결합 파트너의 기계적 특성과 접힘 상태를 연구하는 것입니다. 이를 위해 두 번째 단계에서 단백질 결합 파트너를 유리 슬라이드와 AFM 캔틸레버에 공유 결합으로 고정하여 명확하게 정의된 견인 기하학적 구조를 구현합니다. 캔틸레버로 유리 표면을 압입하면 수용체-리간드 결합이 형성됩니다.다음으로, 개별 단백질 도메인을 펼치고 수용체-리간드 복합체를 결합시키기 위해 캔틸레버를 일정 속도로 후퇴시킵니다. 이를 통해 고분자 탄성 모델에서 나타나는 것과 같이, 언폴딩 경로를 따라 에너지 장벽으로 작용하는 3차 구조 요소들을 밝혀내는 결과를 얻을 수 있습니다. 동적 힘 스펙트럼에 키네틱 모델을 피팅함으로써 결합 파트너에 대한 추가적인 키네틱 및 에너지 정보를 얻을 수 있습니다. 이 절차의 전반적인 목적은 힘이 가해진 상태에서 단백질의 언폴딩 경로를 연구하는 것입니다.이 방법은 단백질의 기계적 안정성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 접근 가능한 파일 그룹으로 설계 가능한 모든 단백질 수용체 리간드 시스템에 적용될 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 연구자들은 타이밍이 매우 중요하고 캔틸레버 취급이 어려워 고생할 수 있습니다.이 방법은 다중 도메인 단백질이 어떻게 풀리는지와 같은 생물물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우선, 직경 24 mm, 두께 0.5 mm의 유리 커버슬립 두 개를 PTFE 홀더에 넣은 후, 에탄올과 초순수 50:50 혼합액에서 15분 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리가 완료되면, 커버슬립을 초순수로 헹구고 피라냐 용액(piranha solution)에서 30분 동안 식각합니다. 30분 후, 커버슬립을 꺼내 초순수로 헹구고 질소 기류로 부드럽게 건조합니다. 다음으로 커버슬립을 에탄올, 초순수 및 3-aminopropyltriethoxysilane이 45:5:1 비율로 혼합된 용액에 담급니다.침지시킨 샘플을 상온의 쉐이커에 넣고 분당 약 50회 회전 속도로 60분 동안 반응시킵니다. 그 다음 커버슬립을 100% ethanol에 담갔다가 초순수로 옮기는 과정을 각각 두 번씩 순차적으로 반복합니다. 다시 질소 기류를 부드럽게 분사하여 커버슬립을 건조시킵니다.건조 후, 커버슬립을 80 °C 오븐에서 30분 동안 굽습니다. 사용하지 않은 커버슬립은 실리콘 캔틸레버 팁의 아미노화 공정을 위해 아르곤

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

AFM 기반 단일 분자 힘 분광법으로 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

우리는 액체 내에서 진폭 변조 (탭핑 모드) 원 자간 력 현미경으로 나노 미터 이하 해상도의 이미지를 달성하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 상용 원 자간 력 현미경에 설명된다. 우리는 매개 변수의 우리의 선택 뒤에 이론적 근거를 설명하고 해상도 최적화를위한 전략을 제안한다.

액체의 진폭 변조 원자 힘 현미경과 서브 나노 미터 해상도 이미징

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 세균 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하여 나노 스케일 해상도를 달성할 수 있습니다. 둘 다, 세포 외 변화의 매핑 (예를 들어, 세포 분열시) 뿐만 아니라 화학 조성의 비교 연구 (예를 들어, 약물 내성에서 발생) 박테리아의 단일 세포 수준에서 수행 될 수있다.

원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

탐색하세요 AFM 기반 단일분자 힘 분광법을 사용하여 셀룰로솜 수용체-리간드 상호작용의 기계적 특성과 폴딩 상태를 연구하는 방법을 배우세요. 이 기법은 단백질 안정성과 생물물리학 연구에 필수적입니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

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