AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다음 실험의 전반적인 목표는 FM 기반 단분자 힘 분광법을 사용하여 융합 단백질 결합 파트너의 기계적 특성과 접힘 상태를 연구하는 것입니다. 이를 위해 두 번째 단계에서 단백질 결합 파트너를 유리 슬라이드와 AFM 캔틸레버에 공유 결합으로 고정하여 명확하게 정의된 견인 기하학적 구조를 구현합니다. 캔틸레버로 유리 표면을 압입하면 수용체-리간드 결합이 형성됩니다.

다음으로, 개별 단백질 도메인을 펼치고 수용체-리간드 복합체를 결합시키기 위해 캔틸레버를 일정 속도로 후퇴시킵니다. 이를 통해 고분자 탄성 모델에서 나타나는 것과 같이, 언폴딩 경로를 따라 에너지 장벽으로 작용하는 3차 구조 요소들을 밝혀내는 결과를 얻을 수 있습니다. 동적 힘 스펙트럼에 키네틱 모델을 피팅함으로써 결합 파트너에 대한 추가적인 키네틱 및 에너지 정보를 얻을 수 있습니다. 이 절차의 전반적인 목적은 힘이 가해진 상태에서 단백질의 언폴딩 경로를 연구하는 것입니다.

이 방법은 단백질의 기계적 안정성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 접근 가능한 파일 그룹으로 설계 가능한 모든 단백질 수용체 리간드 시스템에 적용될 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 연구자들은 타이밍이 매우 중요하고 캔틸레버 취급이 어려워 고생할 수 있습니다.

이 방법은 다중 도메인 단백질이 어떻게 풀리는지와 같은 생물물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우선, 직경 24 mm, 두께 0.5 mm의 유리 커버슬립 두 개를 PTFE 홀더에 넣은 후, 에탄올과 초순수 50:50 혼합액에서 15분 동안 초음파 처리합니다.

초음파 처리가 완료되면, 커버슬립을 초순수로 헹구고 피라냐 용액(piranha solution)에서 30분 동안 식각합니다. 30분 후, 커버슬립을 꺼내 초순수로 헹구고 질소 기류로 부드럽게 건조합니다. 다음으로 커버슬립을 에탄올, 초순수 및 3-aminopropyltriethoxysilane이 45:5:1 비율로 혼합된 용액에 담급니다.

침지시킨 샘플을 상온의 쉐이커에 넣고 분당 약 50회 회전 속도로 60분 동안 반응시킵니다. 그 다음 커버슬립을 100% ethanol에 담갔다가 초순수로 옮기는 과정을 각각 두 번씩 순차적으로 반복합니다. 다시 질소 기류를 부드럽게 분사하여 커버슬립을 건조시킵니다.

건조 후, 커버슬립을 80 °C 오븐에서 30분 동안 굽습니다. 사용하지 않은 커버슬립은 실리콘 캔틸레버 팁의 아미노화 공정을 위해 아르곤 가스 하에 최대 6주 동안 보관하십시오. 먼저 실리콘 캔틸레버 4개를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓고 UV 오존으로 15분 동안 처리합니다.

그 후 캔틸레버를 에탄올과 3-아미노프로필디메틸트리메톡시실란(3-aminopropyl dimethyl trimethoxysilane)의 50:50 혼합액과 0.25% 초순수 용액에 3분 동안 담급니다. 다음으로 캔틸레버를 톨루엔, 에탄올, 초순수가 담긴 비커에 순차적으로 60초 동안 헹굽니다. 마지막 헹굼 단계 이후, 헹굼 과정 사이에 필터 페이퍼 위에서 캔틸레버를 조심스럽게 건조시킵니다.

캔틸레버를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓고 80 °C에서 30분 동안 가열합니다. 먼저 200 µL 피펫 팁의 끝부분을 잘라 직경을 넓힌 다음, 각 1.5 mL 마이크로 튜브에 스톡 비드 용액 100 µL를 분주하여 TEP diss sulfide 환원 비드 2개를 준비합니다. 그 다음, TEP 비드 슬러리가 담긴 튜브에 TBS 1 mL를 첨가하고, 마이크로 튜브를 짧게 볼텍싱하여 비드를 세척합니다.

그 다음 샘플을 850 Gs에서 3분 동안 원심분리하여 비드를 펠렛화합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버린 후, 1 mL의 TBS로 비드를 두 번 더 세척합니다. 세척 단계 사이마다 원심분리를 수행하며, 마지막 세척 후 TEP 비드에 3 mg/mL 농도의 단백질 용액을 1:2 비율로 첨가하고 마이크로 피펫 팁으로 저어주어 공기 방울이 생기지 않도록 슬러리를 부드럽게 혼합합니다.

그 다음 단백질 TEP 비드 슬러리 혼합물을 회전 혼합기에 넣고 2.5시간 동안 반응시킵니다. 표면의 일차 아민 그룹을 탈양성자화하기 위해 아미노화된 캔틸레버와 커버 슬립을 pH 8.5의 소듐 보레이트 완충액에 45분 동안 담급니다. 그런 다음 N-H-S-P-E-G 말렘 파우더를 실온으로 가온하고, 소듐 보레이트 완충액에서 볼텍싱하여 25 $\mu$M 농도로 210 $\mu$L를 준비합니다.

NHS의 반감기가 매우 짧으므로 용액을 가능한 한 빨리 사용해야 합니다. pH 8.5에서 N-H-S-P-E-G malam 용액 30 µL를 페트리 접시에, 90 µL를 다른 유리 커버슬립마다 빠르게 분주합니다. 캔틸레버를 30 µL 방울 안에 조심스럽게 배치합니다.

그 다음, 액적이 없는 커버슬립을 N-H-S-P-E-G malam 용액이 있는 커버슬립 위에 뒤집어 올려 N-H-S-P-E-G MALAM 용액이 포함된 샌드위치 구조를 형성합니다. 그 상태로 캔틸레버와 커버슬립을 N-H-S-P-E-G MALAM 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TEP 비드와 환원된 단백질 용액을 100 GS에서 1분 동안 원심분리하고 상청액을 수집합니다.

다음으로, 단백질 용액을 TBS로 희석하십시오. 표면 접합 시 단백질 농도가 0.5에서 2 mg/mL 범위가 되도록 맞춥니다. 그 다음, 캔틸레버와 커버슬립을 세척하는 동안 환원 및 희석된 단백질 용액을 몇 분간 그대로 둡니다.

초순수가 담긴 세 개의 비커에서 커버슬립을 순차적으로 세척합니다. 커버슬립의 가장자리를 여과지에 조심스럽게 접촉시켜 잔류 액체를 제거합니다. 그런 다음 AFM 기기와 호환되는 적절한 샘플 홀더에 커버슬립을 장착하고, 질소 기류를 약하게 흘려 잔류 액체를 건조합니다.

희석된 단백질 용액 20 µL를 커버슬립 중앙에 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 캔틸레버를 초순수가 담긴 세 개의 비커에서 순차적으로 헹구고, 이어서 두 번째 희석 단백질 용액 30 µL를 한 방울 떨어뜨립니다. PEG화된 커버슬립과 캔틸레버를 각각의 희석 단백질 용액과 함께 습도 챔버 내 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 커버슬립을 1 mL의 TBS로 최소 10회 헹군 후, 측정 전까지 TBS에 보관하십시오. 또한, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 TBS가 담긴 3개의 비커를 순차적으로 사용하여 캔틸레버를 헹구고, 이 역시 TBS에 보관하십시오. 기능화된 캔틸레버와 유리 슬라이드를 액체 내 측정이 가능하고 Z 피에조의 속도 범위가 약 200 내지 5,000 nm/s로 조절 가능한 AFM 모델에 장착하십시오.

마운팅 시 공기 노출을 최소화하고, 레이저 빔을 정확하게 조절하는 동안 모든 표면이 버퍼로 덮여 있도록 하십시오. 드리프트 효과를 줄이기 위해 시스템을 최소 30분 동안 평형 상태로 둔 다음, 필요한 경우 다시 조정하십시오. 그 후 응집 결합이 성공적으로 이루어지면 측정을 시작하십시오.

여기에 표시된 기록된 힘-거리 추적(force distance traces)은 도커(Docker) 쌍에서 나타납니다. 이는 특징적인 피크 패턴을 보여줍니다. 추적의 각 피크는 하나의 단백질 서브도메인이 풀리는 것을 나타내며, 마지막 피크는 수용체-리간드 복합체의 해리를 의미합니다.

기록된 힘-거리 추적 곡선들을 힘-윤곽 길이 공간으로 변환한 후, 배리어 위치 히스토그램으로 구성하였습니다. 데이터 분석 결과 약 89 nanometers의 윤곽 길이 증가가 나타났으며, 이는 응집성 docker 및 상호작용의 에너지 지형을 탐색하기 위한 xin 도메인의 언폴딩으로 명확하게 지정될 수 있습니다. 총 4가지의 서로 다른 풀링 속도에서 186개의 데이터 추적 곡선을 얻었습니다.

큰 파란색 원으로 표시된 결과 동적 힘 스펙트럼은 주어진 하중 속도에서의 가장 확률 높은 파열력을 나타냅니다. 이러한 값들을 Bell Evans 모델에 맞춘 결과 Koff 및 delta X 값이 산출되었으며, 이는 이전에 발표된 결과와 잘 일치하는 것으로 확인되었습니다. 이 기술의 실험 부분은 숙련되면 8~9시간 만에 수행할 수 있습니다.

이 절차 이후, 개발된 단백질의 결합에 필수적인 아미노산을 결정하기 위해 후속 실험에서 부위 특이적 돌연변이 유발(site-specific mutagenesis)을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 단일 분자 생물물리학 분야의 연구자들이 단백질 접힘 랜드스케이프(protein folding landscapes)를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 우리는 이를 사용하여 알려진 단백질 시스템 중 기계적으로 가장 안정적인 시스템 중 하나인 셀룰로오스 SOE의 기계적 특성을 연구합니다.

이 영상을 시청하고 나면 단백질 수용체-리간드 쌍에 대한 단일 분자 힘 분광법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.