Name: 인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 배우세요 인간 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포를 분리하는 방법입니다. 기계적 분쇄, 효소 소화, 밀도 원심분리를 통해 단일 세포 현탁액을 얻고, 자기 또는 FACS 분류로 순수한 세포를 분리할 수 있습니다.

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우리는 CDR2 항체를 제공하는 흉선 샘플 및 브루노 Kyewski (DKFZ, 하이델베르크, 독일)과 함께 우리를 제공하기위한 흉부 외과 부, 대학 병원 튀빙겐의 외과 의사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 선별 시설 (튀빙겐 대학)에서 한스 - 요 르그 Bühring 사브리나 GRIMM에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 SFB 685과 Hertie 재단에 의해 지원되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 Gotter 등 4 발행 프로토콜의 변형이다. 프로토콜의 중요한 단계는 상태와 조직의 초기 제제뿐만 아니라 퍼콜 밀도 분리이다. 우리는 최대한 빨리 수집 한 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다. 그것은 청소 및 조직을 절단 할 때 빠르지 만 철저하게 작동하는 것이 중요합니다. 단계 2.3에 기재된 흉선 세포 세척 동안, 간질 세포를 손상시킬 수있는 너무 격렬하고 장기간 압력이 조직 조각에 주사기 플런저의 뒷면에 힘을인가 할 때 균형을 찾기 위해 매우 중요하다. 교란을 유발하지 않고 퍼콜 솔루션 / 세포 현탁액의 상단에있는 매체를 레이어링도 연습이 필요할 수 있습니다. 원심 분리 후, 가능한 한 빨리 퍼콜 용액 최소량 퍼콜 층으로부터 모든 저밀도 분획의 세포를 수집하는 것이 중요하다. 전체 세포 수율 및 상대 APC 번호는 (표 1 참조) 매우 가변적 (특히 연령에 대한) 기증자와 실험의 ...

흉선은 T 세포의 발달이 발생하는 기관이다. 흉선은 여전히​​ 이전 시대에 감지 할 수 있지만이 연속적으로 지방으로 대체되는 경우를 상대적 절대적 크기는 나이와 함께 감소한다. 면역 반응에 대한 중요성은 1960 년대 초 1에서 증명되었다. T 세포 레퍼토리는 기능적 큰폭 자기 관용 T 세포 레퍼토리이 결과, T 세포의 개발에 생존 또는 사망 큐를 선택해 흉선 APC 다른 종류의 펩티드-MHC 복합체와 T 세포 수용체의 상호 작용을 통해 형성된다. 인간 흉선 세포의 약 98 %는 흉선 세포라고도 T 세포를 개발하고있다. 나머지 2 %는 TEC의 다양한 (대뇌 피질, 수질, 낭하), 골수 및 plasmacytoid DC (MDC, PDC), 대식 세포, B 세포, 성숙 재 순환 T 세포, 과립구 등 다양한 종류의 세포들로 구성 에프식 표현형 ibroblasts, 내피 세포와 매우 드문 상피 세포는 근육, 신경, 호흡기 상피 세포와 같은 다른 조직 (그림 1)에서 세포의 닮은. 이들 중, TEC와 DC는 정상 흉선에있는 주요 APC 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 문화 및 분자 프로파일 링이 APC 유형의 정화는 점점 더 많은 관심을 얻고있다. 으로 인해 낮은 주파수로, 자세한 분석을 위해 이러한 종류의 세포 중 어느 격리, 효율적인 재현하고 비용 효율적인 절차가 필요합니다. 여기에 제시된 방법은 이전에 발표 된 연구 3,4에서 수정합니다. 다른 조직과 같이, 흉선 세포로부터 추출 효소 단일 세포 현탁액을 얻기 위하여, 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용 네트워크를 disaggregating함으로써 달성 될 수있다. 좋은 분리 효율, 세포 수율, 세포 생존과 세포의의 유지와 같은 특정 매개 변수가 있습니다결정적이며 urface 마커 이러한 희귀 세포 집단의 성공적인 분리를 위해 최적화 될 필요가있다. 이 프로토콜에서, DC 및 TEC의 부분 집합의 분리는 기계적 장애 및 소화 효소에 의해 조직의 단일 세포 현탁액을 만들기에 의해 수행된다. 우리는 조직을 함께 보유하고있는 고유 콜라겐을 분해하는 다른 효소 활성의 균형 잡힌 비율이 클로스 트리 디움 histolyticum에서 콜라게나 제를 사용합니다. DNA 분해 효소 I은 (흉선 세포는 매우 민감하다.) 우리는 또한 티슈 dissociator 의해 보조 기계 및 효소 조직 치료를 포함하는 전형적인 효소 조직 소화에 대안을 제공 인해 사균없는 DNA로 세포 응집을 감소시키기 위하여 효소 용액에 포함된다. 단일 세포 현탁액을 세포의 저밀도 분획 (LDF)의 농축을위한 단일 퍼콜 밀도 원심 분리된다. 세포의이 부분에서, DC는 F를 염색하여 분리 할 수​​있다또는 DC-표면 마커 (즉,의 CD11c의 +) 및 자기 분리 또는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여. 흉선 세포의 대부분을 구성하는 림프 세포와는 달리, TEC는 높은 수준의 CD45을 표현하지만, 상피 세포 접착 분자 EpCAM에 대한 긍정적하지 않습니다. CTEC는 CDR-2 (대뇌 피질 돌기 망상-2) 항체 4,5 다소 낮은 EpCAM 식으로 인식이 아직 정의되지 않은 항원의 발현에 의해 수질 TEC 구별 될 수있다. 차동 EpCAM 및 CDR2의 공동 발현은 고속 셀을 통해 이러한 TEC 서브 세트들의 효율적인 분리가 6을 정렬한다. 여기에 제시된 프로토콜은 인간의 흉선 조직에 최적화되어 있습니다. FACS 정렬이 사용되는 경우에 절차의 지속 기간은, 조직의 양과 실험자의 능력뿐만 아니라, 셀 소터의 속도에 따라 달라진다. 일반적으로 DC의 분리를위한 프로토콜은 5 이내에 완료 할 수 있습니다-6의 시간과 8 ~ 10 시간에 TEC의 격리를위한. 흉선 조직에서 DC와 TEC의 부분 집합의 격리는 시간에 민감한입니다. 빠른 분리 절차, 세포의 상태 나은. 마지막으로, 절연 세포 mRNA의 비교 연구 및 단백질 발현, PCR 실험, 단백질 분리, 분자량 프로파일 (즉 transcriptomics, 마이크로 RNA 분석)뿐만 아니라 세포 배양 6 같은 추가 조사를 위해 사용될 수있다. 윤리 정책 인간의 흉선 조직에서 작동 할 수 있도록하기 위해 연구원 조직은 일반적으로 미성년자에서 얻을 수 있기 때문에 로컬 윤리위원회 또는 담당 기관뿐만 아니라 기증자의 정보를 서면 동의 (또는 일반적으로 자신의 부모로부터 승인을 받아야합니다 어린이). 또한, 인간의 모든 조직은 잠재적으로 감염성 및 적절한 조치는 등, 장갑, 작업로,주의해야 것으로 취급되어야한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약 및 재료</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청-골드</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase I, 등급 II 소 췌장</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td><td>PAA</td><td>L11-001</td><td>재고 conc. 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 단백질 라벨링 키트</td><td>분자 프로브</td><td>A-10235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>반인간 CDR2 (정제)</td><td>Bruno Kyewski, DKFZ- 하이델베르크, 독일</td><td></td><td>Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>반인간 CD45 (Pacific Blue)</td><td>Biolegend</td><td>304022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 휴먼 EpCAM (APC)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-254</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>반-휴먼 CD11c (PE)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-411</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-PE 마이크로비즈</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-CD45 마이크로비즈, 인간</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LS 칼럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>조직 해리기용</td> <td>gentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td></tr><tr><td>Percoll (밀도 1.130 g/ml)</td><td>GE Healthcare, Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>멸균 증류수 (DNAse/ RNAse free)</td><td>GIBCO</td><td>10977-035</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gamunex 10%</td><td>Tajecris-Biotherapeutics</td><td>G120052</td><td>1:10 사전 희석, 20 &mu 사용; L/1 x 106cells</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 필터</td><td>Millex GS</td><td>SLGS033SS</td><td>주사기 구동</td></tr><tr><td>Stericup 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>펌프 구동</td></tr><tr><td>50 ml PC 오크 릿지 원심분리기 튜브</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>50 ml PP 원추형 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 5 ml 시험관</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>FACS 염색</td></tr><tr><td>세포 여과기 70 &mu; m</td><td>벡턴 디킨슨</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS</td></tr><tr><td>Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution R6 (로터)</td><td>Kendro</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>로테이터 REAX 2</td><td>Heidolph</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093 235</td><td>조직 해리기</td></tr></tbody></table>

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

이 프로토콜에서 우리는 인간 흉선에서 수지상 세포 (DC) 및 상피 세포 (TEC)를 분리하는 방법을 제공한다. DC와 TEC의 주요 항원 제시 세포 정상 흉선에있는 (APC) 타입이며, 그것은 그들이 잘 흉선 선택시 뚜렷한 역할을한다는 것을 설정됩니다. 이 세포는 흉선에서 별개의 미세 환경에서 지역화 된 각 APC 유형은 세포의 단지 작은 인구를 구성하고 있습니다. 추가로 이들 세포 유형의 생물학을 이해하기 위해, 이러한 세포 집단의 특성은 매우 바람직하지만 인해 낮은 주파수로, 이러한 세포 유형의 임의의 분리는 효율적이고 재생 가능한 절차를 필요로한다. 이 프로토콜은 다양한 휴대 속성의 특성에 적합한 세포를 얻을 수있는 방법을 자세히 설명합니다. 흉선 조직을 기계적으로 파괴되어 소화 효소의 상이한 단계 후에, 생성 된 세포 현탁액을 퍼콜 밀도 원심 분리 단계를 사용하여 농축한다. 골수 DC (의 CD11c의 격리를위한 &lt;SUP&gt; +), 저밀도 분획 (LDF)의 세포가 자기 세포 분류하여 immunoselected됩니다. TEC 인구 (MTEC, CTEC)의 보충은 특정 세포 마커를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀을 통해 그 이후의 분리를 허용하는 저밀도 퍼콜 세포 분획에서 조혈 (CD45 안녕하세요) 세포의 파괴에 의해 달성된다. 고립 셀은 다른 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다.

이 프로토콜에서 출발 물질로서 우리는 동의 한 후, 제도적 지침에 따라 얻어진 교정 심장 혈관 수술 (학과 흉부 외과, 대학 병원 튀빙겐의)를받은 아이들에서 제거 흉선 조직을 사용합니다. 이 폐기 물질은 2-30 g 이상에서 크기가 크게 다를 수 있습니다. 수득되는 MDC의 개수와 TEC 서브셋 (CTEC 및 MTEC)은 크기뿐 아니라 분리에 사용 흉선 조직 샘플의 나이에 따라 달라진다. 그림 2는 (~ 9cm) 여섯 살짜리 아이로부터 얻은 조직의 다소 큰 부분을 보여줍니다. 이 프로토콜에서 중요한 첫 번째 예비 단계 (흰색 화살표로 표시) 바람직하지 않은 부분에서 조직의 청소입니다. 단일 퍼콜 밀도 원심 분리를 해제하여 분리 된 단일 세포 현탁액을 구하는 2 항과 프로토콜의 3.1에 ​​기술 된 흉선 조직을 처리 하였다단일 세포 현탁액을 HLA-DR + 세포의 약 3 % (도 3...

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

이 절차의 전반적인 목적은 인간 흉선에서 수지상 세포와 상피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 기계적 파쇄를 통해 절제된 조직을 분쇄함으로써 수행됩니다. 다음으로, 조직 파편을 효소로 추가 소화시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다.마지막으로, Percoll 분리를 통해 세포 현탁액에서 저밀도 세포 분획을 농축합니다. 최종적으로, 이 분획에서 자성 분리 또는 FACS 소팅, 또는 두 방법을 조합하여 수지상 세포와 상피 세포를 분리할 수 있습니다. 본 연구에서 제시하는 방법은 인간 흉선에서 발견되는 수지상 세포 및 흉선 상피 세포와 같은 희귀 세포군을 성공적으로 분리하고 후속 연구를 수행하기 위한 효율적이고 재현 가능하며 비용 효율적인 절차를 제공합니다.저희 실험실의 대학원생인 I rotta가 해당 절차를 시연하겠습니다. 먼저 흉선 조직을 상온의 멸균 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣고 잔류 혈액을 헹구어 냅니다. 그 다음 페트리 접시에 신선한 PBS를 추가하고 핀셋과 가위를 사용하여 혈전, 결합 조직, 지방 조직 및 건강해 보이지 않는 조직 부위를 제거합니다.흉선 조직을 깨끗하게 정리한 후, 참조를 위해 무게를 측정하고 조직을 1 cm³ 크기의 균일한 조각으로 자릅니다. 이제 조각들을 PBS로 덮고 얼음에 둡니다. 그런 다음 10~20 mL 멸균 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 조직에 가볍게 압력을 빠르게 가함으로써, 대부분의 흉선세포를 제거하고 소화시킬 조직의 전체 부피를 줄입니다.용액이 눈에 띄게 혼탁해질 것입니다. 흉선세포가 방출되면 배양 접시를 부드럽게 저은 다음, 조직 조각을 실수로 흡입하지 않도록 주의하며 유리 흡입기로 흉선세포가 포함된 상층액을 제거하십시오. 멸균 세포 배양 스크레이퍼를 사용하여 모든 조직 조각을 접시의 한쪽으로 모은 다음, 접시를 45도 각도로 기울여 남은 상층액을 흡입하는 것이 도움이 될 수 있습니다.디쉬를 신선한 PBS로 헹구고 PBS가 비교적 투명해질 때까지 상층액을 계속 수집합니다. RPMI로 최종 세척을 수행한 후, 날카로운 가위를 사용하여 조직 조각을 수지상 세포(dendritic cells 또는 dc)를 분리할 수 있도록 5 mL 피펫에 들어갈 정도로 충분히 잘게 다집니다. 먼저 최대 10g의 메쉬 조직 조각을 50 mL 튜브에 넣고, 조직 5g당 10 mL의 collagenase DNA 용액과 10 mL의 RPMI를 첨가합니다.그런 다음 조직 현탁액을 37 °C 열 배

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

배우세요 인간 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포를 분리하는 방법입니다. 기계적 분쇄, 효소 소화, 밀도 원심분리를 통해 단일 세포 현탁액을 얻고, 자기 또는 FACS 분류로 순수한 세포를 분리할 수 있습니다.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

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