인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목적은 인간 흉선에서 수지상 세포와 상피 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 기계적 파쇄를 통해 절제된 조직을 분쇄함으로써 수행됩니다. 다음으로, 조직 파편을 효소로 추가 소화시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

마지막으로, Percoll 분리를 통해 세포 현탁액에서 저밀도 세포 분획을 농축합니다. 최종적으로, 이 분획에서 자성 분리 또는 FACS 소팅, 또는 두 방법을 조합하여 수지상 세포와 상피 세포를 분리할 수 있습니다. 본 연구에서 제시하는 방법은 인간 흉선에서 발견되는 수지상 세포 및 흉선 상피 세포와 같은 희귀 세포군을 성공적으로 분리하고 후속 연구를 수행하기 위한 효율적이고 재현 가능하며 비용 효율적인 절차를 제공합니다.

저희 실험실의 대학원생인 I rotta가 해당 절차를 시연하겠습니다. 먼저 흉선 조직을 상온의 멸균 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣고 잔류 혈액을 헹구어 냅니다. 그 다음 페트리 접시에 신선한 PBS를 추가하고 핀셋과 가위를 사용하여 혈전, 결합 조직, 지방 조직 및 건강해 보이지 않는 조직 부위를 제거합니다.

흉선 조직을 깨끗하게 정리한 후, 참조를 위해 무게를 측정하고 조직을 1 cm³ 크기의 균일한 조각으로 자릅니다. 이제 조각들을 PBS로 덮고 얼음에 둡니다. 그런 다음 10~20 mL 멸균 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 조직에 가볍게 압력을 빠르게 가함으로써, 대부분의 흉선세포를 제거하고 소화시킬 조직의 전체 부피를 줄입니다.

용액이 눈에 띄게 혼탁해질 것입니다. 흉선세포가 방출되면 배양 접시를 부드럽게 저은 다음, 조직 조각을 실수로 흡입하지 않도록 주의하며 유리 흡입기로 흉선세포가 포함된 상층액을 제거하십시오. 멸균 세포 배양 스크레이퍼를 사용하여 모든 조직 조각을 접시의 한쪽으로 모은 다음, 접시를 45도 각도로 기울여 남은 상층액을 흡입하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

디쉬를 신선한 PBS로 헹구고 PBS가 비교적 투명해질 때까지 상층액을 계속 수집합니다. RPMI로 최종 세척을 수행한 후, 날카로운 가위를 사용하여 조직 조각을 수지상 세포(dendritic cells 또는 dc)를 분리할 수 있도록 5 mL 피펫에 들어갈 정도로 충분히 잘게 다집니다. 먼저 최대 10g의 메쉬 조직 조각을 50 mL 튜브에 넣고, 조직 5g당 10 mL의 collagenase DNA 용액과 10 mL의 RPMI를 첨가합니다.

그런 다음 조직 현탁액을 37 °C 열 배양기에서 천천히 회전시키며 40분 동안 배양합니다. 세포가 방출되면서 효소 용액이 탁해질 것입니다. 소화 과정이 끝나면 세포 현탁액을 실온에서 110 G로 2분 동안 원심 분리하여 조직 파편을 침전시키고, 상층액을 수집한 다음 세포 현탁액을 펠렛 형태로 만듭니다.

이번에는 상층액을 제거하고 10~50 mL의 완전 RPMI 배지로 세포를 재현탁합니다. 펠렛의 크기에 따라 트라이판 블루 배제법으로 생존 세포 수를 결정한 다음, 캡을 느슨하게 닫은 상태로 세포 현탁액을 37 °C에 두어 흉선 상피 세포(TEC)를 분리합니다. 그다음, 조직 잔해를 10 mL의 신선한 collagenase DNA 용액과 10 mL의 RPMI 및 trypsin EDTA 혼합액에 재현탁합니다.

조직 조각들을 37°C에서 완만하게 회전시키며 40분 동안 추가로 소화합니다. 배양 마지막 10~15분 동안, trypsin을 중화시키기 위해 fetal calf serum을 1:5 비율로 첨가합니다. 조직 조각들을 펠렛팅한 후, 상층액을 수집하고 세포 현탁액을 다시 원심 분리합니다.

이번에는 느슨한 펠렛이 손실되지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 생존 세포 수를 측정한 후, 이 세포 현탁액 또한 37°C에 둡니다. 저밀도 분획(LDF) 세포를 농축하려면, 세포가 원심분리되는 동안 이전에 DC 및 T 세포 농축을 위해 따로 보관해 두었던 세포 현탁액을 펠렛화하는 것부터 시작하십시오.

1.07 g/mL Percoll 밀도 구배를 설정합니다. 이 표에 따라, 두 펠렛을 각각 1×10⁹ cells가 되도록 6 mL의 준비된 Percoll 용액으로 재현탁합니다. 세포 용액을 충분히 섞어 균일한 현탁액을 만든 후, 용액을 50 mL Oakridge 폴리카보네이트 스크류 캡 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 튜브당 30 milliliters의 완전 RPMI를 perca 세포 현탁액 위에 천천히 층을 이루도록 분주합니다. 층이 섞이지 않도록 주의하며 튜브를 고정각 로터가 장착된 사전 냉각된 원심분리기로 조심스럽게 옮겨 35분 동안 세포를 분리합니다. 그 후 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여 per 세포와 배지 사이의 계면에서 농축된 저밀도 세포 분획을 차가운 완전 RPM이 들어 있는 50 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

그 다음, 튜브에 추가적인 완전 RPMI를 채워 세포당 남은 양을 희석합니다. 마지막으로, 농축된 세포를 완전 RPMI로 두 번 세척한 다음 펠렛을 신선한 배지에 재부유시키고, 이 첫 번째 그림에서 생존 세포 수를 결정합니다. 방금 시연한 바와 같이, 6세 아동으로부터 얻은 꽤 큰 9cm 크기의 조직 조각이 표시되어 있습니다.

중요한 첫 번째 단계는 조직에서 불필요한 부분을 제거하여 정제하는 것입니다. 흰색 화살표로 표시된 바와 같이, 이후 흉선 조직의 단일 세포 부유액을 얻고 저밀도 분획 세포를 농축하였습니다. 일반적인 단일 세포 부유액은 밀도 구배 분리 후 H-L-A-D-R 양성 세포를 약 3% 포함하지만, 대형 세포의 경우 이 비율이 15~40%까지 증가합니다.

고밀도 분획 내의 저밀도 분획은 주로 균일하고 크기가 작은 흉선세포로 구성됩니다. 흉선 내에 이러한 세포는 거의 존재하지 않습니다.

골수성 수지상 세포는 CD 11 C를 포함한 여러 표면 마커의 발현을 통해 식별할 수 있습니다. 이 그림은 분리 후 수정된 자기 세포 분리 프로토콜을 사용하여 CD 11 C 양성 세포를 효율적으로 분리하는 과정을 보여줍니다. 분리된 세포의 면역 염색을 통해 확인한 결과, CD 11 C 양성 수지상 세포의 순도는 93%였습니다. 평균적으로 분리된 CD 11 C 양성 세포의 회수율은 총 10⁹개의 흉선 세포당 5 × 10⁵에서 5 × 10⁶개의 골수성 수지상 세포입니다.

이 표에는 다양한 연령과 조직 무게, 다양한 양의 입력 단일 세포 현탁액으로부터 얻은 여러 개별 흉선 샘플의 대표 데이터와 총 저밀도 분획 세포 수, 그리고 이후 항원 제시 세포 농축 분획에서만 확인된 CD11c 양성 수율 및 순도가 나타나 있습니다. 세포의 약 0.5%는 CD45 low EPCA 양성 또는 CD45 음성 EPAM 양성 피질 상피 세포이며, 트립신으로 소화된 CD45 low negative 농축 기질 세포로부터 수질 상피 세포를 각각 EPAM low CD2 양성 및 EPAM high CD2 음성으로 분리할 수 있습니다. 인간 흉선으로부터 수지상 세포 및 흉선 상피 세포 하위 집단의 분리.

이 과정은 시간에 민감합니다. 분리 절차가 빠를수록 세포의 상태가 더 좋아집니다. 이 프로토콜을 숙달하면 수지상 세포는 5~6시간 이내에, 흉선 상피 세포는 8~10시간 이내에 분리할 수 있습니다.

오늘 이 영상을 시청하신 후에는 수지상 세포와 흉선 상피 세포를 성공적으로 분리하기 위해 인간 흉선 조직을 처리하는 방법에 대해 매우 잘 이해하시게 될 것입니다. 이렇게 분리된 세포는 이후 세포의 특성을 더 자세히 분석하고 생물학적 기전을 더 깊이 이해하기 위한 다양한 하위 응용 연구에 활용될 수 있습니다.